環(huán)介導等溫擴增技術(shù)快速檢測結(jié)核分枝桿菌核酸

1、文章編號:1001-764X(201105-378-03·研究生園地·環(huán)介導等溫擴增技術(shù)快速檢測結(jié)核分枝桿菌核酸*沈會平1,張耀祺1,楊堅2,石磊1,陳濤3,李國周4,趙紅波5,莫自耀5(1華南理工大學輕工與食品學院,廣州510640;2迪澳生物科技有限公司,廣州510663;3廣東省結(jié)核病防治研究所,廣州510630;4東莞市慢性病防治院,廣東東莞523008;5廣州醫(yī)學院呼吸疾病國家重點實驗室,廣州510230摘要:目的建立一種快速準確的檢測結(jié)核分枝桿菌(MTB核酸的環(huán)介導等溫擴增(LAMP方法。方法以重復插入序列IS6110為目的基因,設(shè)計LAMP引物,特異檢測MTB

2、核酸。用本法與痰涂片抗酸染色鏡檢法、實時熒光PCR法對100例可疑患者痰標本進行對比檢查。結(jié)果LAMP法特異性強,僅擴增MTB復合群核酸;靈敏度高,檢測限達100fg;而實時熒光PCR 檢測限為1pg。對100例疑似結(jié)核病患者痰液標本檢測,涂片抗酸染色法、LAMP法、實時熒光PCR法的陽性率分別為28%、39%和38%。結(jié)論本研究建立的LAMP方法檢測MTB核酸特異性強、靈敏度高、時間短且操作簡便,有望成為臨床快速檢測MTB的新方法。關(guān)鍵詞:結(jié)核分枝桿菌;環(huán)介導等溫擴增法;IS6110基因;實時濁度儀中圖分類號:R37891文獻標志碼:ARapid detection for Mycobact

3、erium tuberculosis by loop-mediated isothermal amplificationSHEN Hui-ping1,ZHANG Yao-qi1,YANG Jian2,SHI Lei1,CHEN Tao3,LI Guo-zhou4,ZHAO Hong-bo5,MO Zi-yao5(1College of Light Industry and Food Science,South China University of Technology,Guangzhou510640,Guangdong;2Diao Bio-Technology CoLtd,Guangzhou

4、510663,Guangdong;3Guangdong Research Institute for Mycobacterium tuberculosis Control,Guangzhou510630, Guangdong;4Dongguan Hospital for Chronic Disease,Dongguan523008,Guangdong;5The State Key Laboratory of Respiratory Diseases,Guangzhou Medical University,Guangzhou510230,Guangdong,ChinaAbstract:Obje

5、ctive To develop a rapid loop-mediated isothermal amplification(LAMPmethod for detecting the nuclear acid of Mycobacterium tuberculosis(MTBMethods The repetitive insertion sequence IS6110was used as target gene to develop an efficient LAMP method by which MTB was specifically detectedMTB in100clinic

6、al sputum samples were detected simultaneously by direct smear,LAMP and real-time fluorescent PCRResults The developed LAMP method showed high specificity for detecting pathogenic strains of MTB complexThe detection limit of LAMP assay was as low as100fg of DNA for each tube,while the detection limi

7、t of conventional PCR was10pg for each tubeIn the100clinical sputum samples the positive rate of MTB detected by direct smear, LAMP and real-time PCR was28%,39%and38%,respectivelyConclusion The developed LAMP in this study was effective method with high specificity and sensitivity for detection of M

8、TB,so it is expected to become a valuable tool for rapid detection and i-dentification of MTB in clinical laboratoryKey words:Mycobacterium tuberculosis;loop-mediated isothermal amplification;IS6110gene;real-time turbidity meterWHO調(diào)查報告,僅2008年全球肺結(jié)核人數(shù)就增加940萬,死亡180萬1-2。中國是全球22個肺結(jié)核高負擔國家之一,患者數(shù)量位居全球第二。肺結(jié)核

9、是由結(jié)核分枝桿菌(MTB引起的一種慢性疾病。導致人類感染的結(jié)核菌大多數(shù)是人型MTB,也有10%左右是由牛型MTB。目前,MTB的檢測方法主要有鏡檢法、培養(yǎng)法和核酸擴增等分子生物學方法3。鏡檢法快速、簡單,但是靈敏度低4;培養(yǎng)法準確,但耗時長。環(huán)介導等溫擴增(loop-mediated i-sothermal amplification,LAMP是對靶基因的6個特異部位設(shè)定4種引物,利用具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶在恒溫條件下催化新鏈合成,從而使靶基因高效擴增的一種核酸擴增技術(shù)5。本實驗用LAMP法檢測疑似結(jié)核病患者痰液標本中的MTB核酸,并對該法的特異性、靈敏性以及準確性做了評估。1材

10、料與方法11菌株與試劑Mtuberculosis H37Rv、Mtubercu-losis H37Ra、Mtuberculosis clinical isolate1、Mtubercu-losis clinical isolate2、Mbovis和Manvim等菌株由廣東省結(jié)核病防治研究所保存。Mkansasii、Min-tracelllulare、Mchelonae、Mfortuitum、Mscrofulace-*基金項目:呼吸疾病國家重點實驗室開放課題(2007DA780154F0904;廣州經(jīng)濟技術(shù)開發(fā)區(qū)科技項目(20090723000210000015。作者簡介:沈會平,1985年生,

11、女,碩士研究生,研究方向:生物技術(shù)與食品安全。通信作者:莫自耀,主任醫(yī)師,博士,E-mail:moziyao163net。um、Mszulgai等菌株由東莞慢性病防治院饋贈。甜菜堿、Bst DNA聚合酶購自Sigma公司;SYBR Green 購于廈門百維信公司;MTB核酸擴增熒光檢測試劑盒由中山大學達安公司提供。12引物的設(shè)計根據(jù)MTB IS6110基因序列設(shè)計4條引物,即2條外引物F3和B3,2條內(nèi)引物FIP和BIP。引物序列分別為:F3:5'-GAGTCGATCTGCACAC AGC-3'B3:5'-GAGTTTGGTCATCAGCCGT-3'FIP:5&

12、#39;-TGAGTTCGCCATCGCGCATGCCGATCGCCCCAT-3' BIP:5'-GTCCACGCCGCCAACTACGCTCGATGCCCTC ACGGT-3'。引物由大連寶生物公司合成。13樣品DNA的提取用煮沸法提取基因組DNA。取15mL菌液加入EP管,12000r/min離心3min,棄上清,加入1mL生理鹽水,12000r/min 離心3min,棄上清,加入100L滅菌重蒸餾水,重新懸浮,100水浴煮15min,冰浴10min,12000 r/min離心10min,取上清液,20保存。14LAMP擴增對反應(yīng)體系進行優(yōu)化,反應(yīng)體系:20mmol

13、/L Tris-HCl(pH88,16mmol/L dNTP(各400mol/L,4mmol/L(NH42SO4,10mmol/LMgSO4,10mmol/L KCl,1mol/L甜菜堿,08mol/L FIP,08mol/L BIP,02mol/L F3,02mol/L B3, 01%Triton X-100,8U Bst DNA聚合酶,DNA模板2L,加ddH2O至25L,在反應(yīng)管中加入1滴石蠟油及1L01%的SYBR Green。濁度儀63反應(yīng)1h。后置于805min終止反應(yīng)。濁度儀實時觀察反應(yīng)管中是否發(fā)生擴增,如果發(fā)生反應(yīng),產(chǎn)生焦磷酸鎂沉淀,濁度增加,濁度儀上會出現(xiàn)相應(yīng)的峰段。反應(yīng)結(jié)束

14、后,將反應(yīng)管蓋內(nèi)壁的SYBR Green離心,觀察反應(yīng)管中液體顏色,進一步驗證是否發(fā)生擴增反應(yīng),如發(fā)生擴增,溶液為綠色,否則保持SYBR Green橙色不變。15臨床痰液樣本的檢測從東莞市慢性病防治院收集100例臨床疑似結(jié)核病患者痰液標本,每份痰液攪拌混勻后,取1mL痰液進行涂片抗酸染色直接鏡檢。取15mL痰液,加入3mL4%的NaOH,振蕩搖勻,液化處理15min,15000r/min離心15 min,棄上清。加入1mL生理鹽水,充分懸浮,12 000r/min離心3min,棄上清。煮沸法提取DNA,用實時熒光PCR和LAMP方法進行擴增。實時熒光PCR反應(yīng)按試劑盒說明書進行操作。16統(tǒng)計學

15、分析用SPSS160軟件進行。用2檢驗對100例臨床痰液樣本的檢測結(jié)果進行分析,以P005為有統(tǒng)計學意義。2實驗與結(jié)果21LAMP特異性檢測利用建立的LAMP方法對各菌株DNA進行擴增,用濁度儀實時監(jiān)測,并加入SYBR Green觀察顏色驗證特異性。PCR引物為LAMP的外引物。只有MTB復合群的菌株為LAMP陽性,其他菌株均為陰性。說明建立的LAMP 方法具有很強的特異性,PCR的結(jié)果也證明LAMP 引物特異。22LAMP的靈敏度試驗測Mtuberculosis H37Rv DNA的濃度,以10ng/管作為原濃度,然后10倍連續(xù)稀釋DNA原液至101 106ng/管,各取2L 作為模板進行L

16、AMP擴增和PCR反應(yīng)。DNA原液經(jīng)105倍稀釋(即100fg后,濁度儀上仍出峰(圖1a,加入熒光染料后,在白光下可觀察到溶液為綠色,表明LAMP擴增有效,本LAMP法的檢測限為100fg(圖1b。用PCR法檢測MTB DNA原液經(jīng)104倍稀釋(即1pg后,電泳可見顏色較淺的條帶(圖2 。注:a,擴增曲線;b,熒光染料染色結(jié)果;1 8,分別代表濃度為10ng、1ng、100pg、10pg、1pg、100fg、10fg、0fg。圖1LAMP 靈敏度試驗注:M,DNA Marker;1 8,說明同圖1。圖2PCR檢測MTB DNA靈敏度23臨床痰液樣本檢測鏡檢法、LAMP、實時熒光PCR檢測100

17、例痰液標本的陽性率分別為280%、390%和380%。鏡檢法檢測為陽性的樣本, LAMP法均為陽性。鏡檢法為陰性樣本,LAMP法均為陰性。LAMP法與實時熒光PCR檢測均為陽性35例,均為陰性58例,總符合率為930%。LAMP 法檢測陽性率與鏡檢法、實時熒光PCR法比較,2分別為2716和1056,P均005,無顯著性差異。3討論本研究針對MTB的重復插入序列IS6110設(shè)計LAMP引物進行擴增,通過濁度儀出峰情況和熒光染料SYRB Green染色結(jié)果做直觀判定。實驗的DNA模板未經(jīng)高溫裂解變性,也可以進行LAMP反應(yīng),證實了Aryan等6的研究。本研究建立的LAMP法特異性強,可準確區(qū)分M

18、TB和非MTB。在MTB中,IS6110是多拷貝序列,針對其設(shè)計引物可以提高反應(yīng)的靈敏度。建立的LAMP方法對MTB 的檢測限為100fg,與Pandey等7的研究結(jié)果一致。與PCR結(jié)果比較發(fā)現(xiàn),LAMP法檢測靈敏度比PCR法高1個數(shù)量級,而且耗時短,操作簡單。本研究對100例疑似肺結(jié)核患者的痰液標本的LAMP與直接涂片鏡檢法、實時熒光PCR檢測結(jié)果進行對比。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn),LAMP陽性率較鏡檢法高11%,原因可能是鏡檢法的靈敏度較低,每mL標本中至少有104 105個MTB才可檢出,因而易出現(xiàn)假陰性;而LAMP靈敏度高,當痰液中含有微量的MTB時,也能檢測出8。LAMP與實時熒光PCR檢測結(jié)果的

19、陽性率基本一致,但LAMP法具有操作簡便、無需精細昂貴儀器、耗時短等優(yōu)點。本研究中, LAMP能準確檢測到臨床樣本中的MTB核酸,表明其可用于臨床樣本的檢測。LAMP法在臨床上快速檢測出MTB,有利于結(jié)核病的早期診斷和治療9。本研究用實時濁度儀對實驗進行實時監(jiān)測,因而能更簡單明了控制反應(yīng)的進度。這種對反應(yīng)結(jié)果實時可見的LAMP法與傳統(tǒng)的LAMP法比較更易于操作,無需電泳對結(jié)果進行驗證,減少了操作的時間,肉眼即可觀察結(jié)果,一般技術(shù)人員即可勝任10。在對檢測系統(tǒng)進一步優(yōu)化,建立標準化程序后,有望在臨床常規(guī)應(yīng)用11-12。4參考文獻1WHO,2009aGlobal tuberculosis cont

20、rol:a short update to the2009reportWorld Health OrganizationWHO/HTM/TB/20094262WHO,2009bGlobal tuberculosis control:epidemiology,strategy,financing:WHO report2009World Health OrganizationWHO/ HTM/TB/20094113張躍建,薛昱,杜明韜,等牛乳中結(jié)核分枝桿菌復合群的實時熒光PCR檢測技術(shù)J乳業(yè)科學與技術(shù),2006(2:79-924van der Vliet GM,Schukkink RA,van G

21、emen Bet alNucleic acidsequence-based amplification(NASBAfor the identification of my-cobacteriaJJ Gen Microbiol,1993,139(10:2423-24295Notomi T,Okayama H,Masubuchi H,et alLoop-mediated isother-mal amplification of DNAJNucleic Acids Res,2000,28(12: E636Aryan E,Makvandi M,Farajzadeh A,et alA novel and

22、 more sen-sitive loop-mediated isothermal amplification assay targeting IS6110 for detection of Mycobacterium tuberculosis complexJMicrobiol Res,2010,165(3:211-2207Pandey BD,Poudel A,Yoda T,et alDevelopment of an in houseloop-mediated isothermal amplification(LAMPassay for detection of Mycobacterium tuberculosis and evaluation in sputum samples of Nepalese patientsJJ Med Microbiol,2008,57(Pt4:439-4438Poudel A,Pandey BD,Lekhak B,et alClinical profiling and useof loop-mediated isothermal amplification assay for rapid detection of Mycobacterium tuberculosis from sputumJKathman