清熱祛濕法對實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎大鼠黏膜損傷的影響

1、清熱祛濕法對實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎大鼠黏膜損傷的影響                       作者：張海燕，黃穗平，黃紹剛，張向飛，王靜  【摘要】  目的探討清熱祛濕法（腸滌清灌腸液灌腸腸炎清1號灌胃）對實(shí)驗(yàn)性潰瘍性結(jié)腸炎(UC)大鼠黏膜損傷、血清和結(jié)腸組織中SOD活力及MDA含量的影響。方法成年雌性SD大鼠51只，先隨機(jī)抽取8只大鼠作

2、為正常組，不予造模；剩余的43只大鼠予造模后，第3天隨機(jī)抽取2只解剖，觀察造模是否成功；剩余的41只大鼠隨機(jī)分為模型組11只，腸滌清組、腸滌清腸炎清組、柳氮磺胺吡啶(SASP)組各10只。造模后第4天開始，正常組和模型組給予生理鹽水灌腸、其余三組分別給予腸滌清灌腸、腸滌清灌腸腸炎清灌胃、SASP灌腸灌胃，療程2周。分別從大鼠的一般狀況、結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)及病理形態(tài)變化、血清和結(jié)腸組織中SOD活力及MDA含量的變化來觀察清熱祛濕法對2，4，6-三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性UC大鼠的作用機(jī)制。結(jié)果與模型組和其他兩個(gè)組比較，腸滌清腸炎清可以顯著改善UC大鼠的腹瀉和便血情況，減輕結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)，改善結(jié)腸黏

3、膜的病理形態(tài)學(xué)情況，提高血清和結(jié)腸組織中SOD活力，降低血清和結(jié)腸組織中MDA含量。結(jié)論腸滌清和腸炎清可能通過提高血清和結(jié)腸組織中SOD活力及降低MDA含量來達(dá)到對實(shí)驗(yàn)性UC大鼠的治療作用。 【關(guān)鍵詞】  清熱祛濕法潰瘍性結(jié)腸炎 腸炎清1號腸滌清灌腸液Abstract：ObjectiveTo study the effect of the method of removing heat and dispersing dampness experimental ulcerative colitis (UC) in rats.Methods8 rats were randomly sel

4、ected as the normal group from 51 healthy female Sprague-Dawley (SD) rats.Active UC was induced by trinitro-benzene-sulfonic acid(TNBS) and ethanol solution in 43 ratsThree days after establishing the model of UC，the rats were randomly divided into four  groups：11 in model group，10 in Changdiqi

5、ng group，10 in Changdiqing + Changyanqing group and 10 in salicylazosulfapyridine (SASP) groupFour days after establishing the model of UC，the rats in both normal and model groups were treated with normal Saline enema (NSE).  Rats in the other 3 groups were treated with Changdiqing enema,Changd

6、iqing enema plus Changyanqing gavage，and SASP by gavage and enema，respectivelyThe course of treatment was 2 weeks and general condition， CMDI，dynamic changes of SOD activity and MDA level in serum and tissues of colon were observedResultsThe combination of Changdiqing and Changyanqing could signific

7、antly improve the symptoms of diarrhea and hematochezia, decrease the ulcer index of colonic mucosa,aleviate the pathological changes, increase SOD activity in serum and tissues of colon, and decrease the level of MDA in UC model rats compared with normal saline enema and the other two treatment gro

8、ups.ConclusionThe therapeutic effect of the combination of Changyanqing and Changdiqing in experimental UC rats might result from the increase of  SOD activity and decrease of  MDA level in serum and tissues of colon.Key words： The method of removing heat and dispersing dampness；  Ulc

9、erative colitis (UC)；  Changyanqing 1；  Changdiqing fluid    近年來潰瘍性結(jié)腸炎（Ulcerative Colitis，UC）在我國的發(fā)病率呈逐漸升高趨勢，且被認(rèn)為是結(jié)腸癌的癌前病變，已被世界衛(wèi)生組織列為難治病之一。在臨床實(shí)踐過程中，我們發(fā)現(xiàn)活動(dòng)期UC的病機(jī)特點(diǎn)以大腸濕熱為主，治療當(dāng)以清熱祛濕為法。中醫(yī)藥治療本病具有獨(dú)特優(yōu)勢，腸滌清灌腸液和腸炎清1號方已在廣東省中使用近十年，治療活動(dòng)期大腸濕熱型UC療效顯著。為探討清熱祛濕法(腸滌清灌腸液灌腸加腸炎清1號方灌胃)對UC的作用機(jī)理，本實(shí)驗(yàn)

10、觀察了該方法對實(shí)驗(yàn)性UC大鼠黏膜損傷、血清和結(jié)腸組織中SOD活力及MDA含量的影響?，F(xiàn)報(bào)道如下。1  材料與儀器1.1  動(dòng)物SPF級健康成年雌性SD大鼠51只，體質(zhì)量為200230 g。由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號：SCXK(粵)2003-0002，粵監(jiān)證字2007A003。1.2  藥物腸滌清灌腸液：由黃柏30 g，敗醬草20 g，大黃20 g，地榆30 g，白及15 g等藥物組成。購于廣東省中醫(yī)院，由廣東省中醫(yī)院制劑部煎制，每劑煎150 ml備用，密封保存，溫?zé)岷蠊嗄c。    腸炎清1號方：由黃芩10 g，黃連10

11、 g，白頭翁15 g，秦皮10g，木香5 g，芍藥15 g，蛇舌草20 g，炒當(dāng)歸5 g，元胡15 g，甘草5g等藥物組成。購于廣東省中醫(yī)院，由江陰天江藥業(yè)有限公司制成中藥配方顆粒，加開水溶解后配制為含生藥1 g/ml溶液，置4的冰箱保存?zhèn)溆?，溫?zé)岷蠊辔浮?#160;   柳氮磺吡啶腸溶片(SASP)：上海三維制藥有限公司生產(chǎn)(批文號：國藥準(zhǔn)字H31020450)，規(guī)格：每片0.25 g。用刀片輕輕刮去外層包衣后研為細(xì)粉，用蒸餾水配成30 mg/ml的混懸液，置4的冰箱保存?zhèn)溆?，溫?zé)岷蠊辔讣肮嗄c。1.3  試劑2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）：由美國sigma

12、公司生產(chǎn)，批號為107K5008，分子量為：293.2，濃度為5%，購于上海Sigma-Aldrich生物技術(shù)有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）測試盒：購于南京建成生物工程研究所，批號：20080412；丙二醛（MDA）測試盒：購于南京建成生物工程研究所，批號：20080524。考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒：購于南京建成生物工程研究所，批號：20080530。1.4 儀器高速離心機(jī)：德國sigma公司生產(chǎn)的LD4-2A離心機(jī)；組織勻漿機(jī)；寧波生物科技有限公司生產(chǎn)的電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)；光學(xué)顯微鏡：Motic公司BA200型。分光光度計(jì)：UV-7504紫外可見分光光度計(jì)（上海欣茂儀器有限公司）。2

13、0; 方法2.1  大鼠分組SPF級健康成年雌性SD大鼠51只，采用架式籠養(yǎng)喂養(yǎng)。先隨機(jī)抽取8只大鼠作為正常組，不予造模。剩余的43只大鼠予造模后，第3天隨機(jī)抽取2只解剖，觀察造模是否成功；剩余的41只大鼠隨機(jī)分為4組：模型組（空白組）11只；腸滌清灌腸液灌腸組（簡稱腸滌清組）、腸滌清灌腸液灌腸腸炎清1號灌胃組（簡稱腸滌清腸炎清組）、SASP灌腸灌胃組（簡稱SASP組），每組10只。2.2  造模方法參照1：將大鼠禁食不禁水24 h后，腹腔注射10%水合氯醛腹腔麻醉（0.3 ml/100 g），固定于鼠解剖臺上，將一直徑2.0 mm長約11 cm的橡膠輸液管，由肛門輕緩插入

14、深約8 cm，給予2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）乙醇溶液(100 mg/kg TNBS50%的乙醇溶液0.25 ml)緩緩注入到大鼠腸腔內(nèi)，再注入少許空氣，提起大鼠尾部，倒置30 s，使造模劑充分滲入大鼠腸腔。讓動(dòng)物保持平躺蘇醒，各組大鼠蘇醒后正常飼養(yǎng)。觀察大鼠體重、進(jìn)食量、飲水量、毛發(fā)光澤度、大便性狀以及活動(dòng)情況。2.3 給藥方法按照公式：大鼠用藥劑量(mg/kg)5倍成人用藥量(mg/kg)，各組動(dòng)物在正常飼養(yǎng)的基礎(chǔ)上，從造模后第4天開始用藥。第1組為正常組：每天定時(shí)用生理鹽水灌腸，2 ml/200g。第2組為模型組：每天定時(shí)用生理鹽水灌腸，2 ml/200g。第3組為腸滌清組：每天

15、定時(shí)用腸滌清灌腸，2 ml/200 g。第4組為腸滌清腸炎清組：每天定時(shí)用腸滌清灌腸，2 ml/200 g；腸炎清1號灌胃，2 ml/200 g。第5組為SASP組：每天定時(shí)用SASP灌腸，2 ml/200 g；同時(shí)配合灌胃，2 ml/200 g。上述用藥皆1次/d，治療均為2周。2.4  取材大鼠禁食不禁水24 h后，用10%水合氯醛腹腔麻醉（0.3 ml/100 g），迅速剖腹，腹主動(dòng)脈取血2 ml，離心后置-80冰箱保存?zhèn)溆谩⒕喔亻T12 cm長的末端結(jié)腸取出，沿腸系膜緣剪開腸腔，用冷生理鹽水沖洗腸內(nèi)容物，將黏膜向上展開，肉眼觀察黏膜損傷并進(jìn)行評分，結(jié)腸黏膜損傷指數(shù)（CMDI）

16、的半定量標(biāo)準(zhǔn)參照 Vilaseca2等制定的評分標(biāo)準(zhǔn)（見表1）。再取病變最明顯處2 cm左右，放至-20冰箱速凍，然后移至-80冰箱冷凍保存。最后再留取各組大鼠結(jié)腸病變最明顯處組織若干，10%福爾馬林溶液浸泡固定，以備制作病理切片。表1  結(jié)腸黏膜損傷評分標(biāo)準(zhǔn)（略）2.5  檢測方法SOD、MDA檢測方法嚴(yán)格按照試劑盒說明操作，由廣州威佳科技有限公司檢測。病理切片由廣州中醫(yī)藥大學(xué)病理教研室制作。2.6  統(tǒng)計(jì)方法統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)的一般性分析及統(tǒng)計(jì)推斷：采用雙側(cè)檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水平0.05。所有計(jì)量資料均用 ±s表示。若數(shù)據(jù)符合方

17、差齊性，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)；若數(shù)據(jù)方差不齊，則采用非參數(shù)檢驗(yàn)方法。兩個(gè)變量的相關(guān)性分析采用非參數(shù)Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)方法。1         3  結(jié)果3.1  一般情況正常組：大鼠活動(dòng)正常，反應(yīng)靈活，毛色光潤，飲食正常，大便呈顆粒狀，無稀便及膿血便。模型組：在造模后的第2天即出現(xiàn)稀爛便，隨后相繼出現(xiàn)黏液便、膿血便，伴有反應(yīng)遲鈍，不喜活動(dòng)，倦怠懶動(dòng)、毛發(fā)凌亂、拱背、飲食飲水減少、體質(zhì)量減輕，甚至死亡現(xiàn)象。到實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，仍排稀爛便。3個(gè)用藥組：在用藥1周后大鼠

18、黏液血便逐漸減少，活動(dòng)逐漸增多，飲食飲水量逐漸增加，其中以腸滌清腸炎清組大鼠癥狀改善最為顯著，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，部分大鼠已排顆粒狀大便。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，模型組有5只大鼠死亡，腸滌清組有1只死亡，腸滌清腸炎清組有3只死亡，SASP組有2只死亡。其中腸滌清腸炎清組有2只大鼠是在灌胃過程中窒息而死，立即打開腹腔觀察，發(fā)現(xiàn)腸外壁與周圍組織無明顯黏連，縱行剪開腸管，局部腸壁略厚，可見散在糜爛、淺潰瘍，周圍黏膜略充血、水腫，已無較大較深潰瘍；由于所配制的腸炎清1號藥液較黏稠，在灌胃過程中誤入氣管，引起窒息而死亡，考慮死亡原因與UC本身無關(guān)。其余大鼠均死于“巨結(jié)腸”或腹瀉導(dǎo)致的嚴(yán)重營養(yǎng)不良。  &

19、#160; 造模后第3天從43只大鼠中隨機(jī)抽取2只解剖，肉眼觀察到結(jié)腸黏膜表面充血水腫、糜爛、點(diǎn)狀或片狀出血、潰瘍形成。光鏡下可見大量急性炎癥細(xì)胞浸潤，潰瘍達(dá)黏膜肌層，證明大鼠UC模型造模成功，可以進(jìn)行本實(shí)驗(yàn)研究。3.2  結(jié)腸黏膜損傷及病理形態(tài)學(xué)的變化3.2.1  肉眼觀察結(jié)腸黏膜損傷情況肉眼觀察結(jié)腸黏膜損傷大體情況：正常組大鼠結(jié)腸黏膜皺襞紋理清晰，未見炎癥、糜爛及潰瘍；模型組大鼠病變結(jié)腸外壁與周圍組織黏連，腸壁明顯增厚，黏膜明顯充血水腫，可見糜爛及潰瘍；其他3組大鼠腸壁黏連情況減輕，腸壁增厚較輕，黏膜輕度充血水腫，糜爛、潰瘍減輕，腸滌清+腸炎清組充血水腫最輕，已無潰瘍，

20、具體各組大鼠CMDI比較詳見表2。3.2.2  光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)腸黏膜病理形態(tài)正常組：大鼠結(jié)腸四層結(jié)構(gòu)清晰，黏膜上皮完整、連續(xù)，腺體排列規(guī)則、分泌功能活躍，未見炎細(xì)胞浸潤及血管反應(yīng)。見圖1。    模型對照組：結(jié)腸黏膜可見不同程度的灶性糜爛及潰瘍，有的潰瘍深達(dá)肌層甚至穿孔(可見潰瘍底部有滲出物、大量壞死組織、肉芽組織及少量瘢痕組織)。黏膜層變薄，黏膜腺體有不同程度破壞，黏膜及黏膜下見大量炎性細(xì)胞(淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、巨噬細(xì)胞) 浸潤，黏膜下層局部充血、水腫。見圖1。    3個(gè)用藥組：潰瘍較淺表或無潰瘍，潰瘍旁上皮修復(fù)明顯，腺

21、體增生活躍，隱窩、腸腺及間質(zhì)可見較多淋巴細(xì)胞為主的慢性炎性細(xì)胞浸潤。見圖1。表2  各組大鼠CMDI比較(略)3.3  血清和結(jié)腸組織中SOD活力結(jié)果各組大鼠血清和結(jié)腸組織中SOD活力檢測結(jié)果見表3。表3  各組大鼠血清和結(jié)腸組織中SOD活力檢測結(jié)果比較（略）采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。與正常組比較，P<0.01；與模型組比較，P<0.01，P<0.05，P>0.05；與腸滌清組比較，P<0.01，P<0.05，P>0.05；與SASP組比較，P<0.013.4  血清和結(jié)腸組織中MDA含量

22、結(jié)果各組大鼠血清和結(jié)腸組織中MDA含量檢測結(jié)果，見表4。表4  各組大鼠血清和結(jié)腸組織中MDA含量檢測結(jié)果比較（略）    采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。與正常組比較，P<0.01；與模型組比較，P<0.01，P<0.05、P>0.05；與腸滌清組比較，P<0.05，P>0.05；與SASP組比較，P<0.053.5  CMDI與SOD、MDA的相關(guān)性分析CMDI與SOD、MDA的相關(guān)性經(jīng)Spearman秩相關(guān)檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)CMDI與血清和結(jié)腸組織勻漿SOD活力呈負(fù)相關(guān)(P0.01)，SOD活

23、力越高，黏膜損傷越輕；CMDI與血清和結(jié)腸組織勻漿MDA含量呈正相關(guān)(P0.01)，MDA含量越高，黏膜損傷越嚴(yán)重。見表5。表5  CMDI與SOD、MDA的相關(guān)性分析（略）4  討論    TNBS和乙醇聯(lián)合造模時(shí)，在乙醇灼傷結(jié)腸黏膜后，TNBS與組織蛋白的賴氨酸-氨基團(tuán)結(jié)合，成為抗原，使T淋巴細(xì)胞致敏，與半抗原結(jié)合的動(dòng)物自身細(xì)胞被破壞，從而導(dǎo)致腸道炎癥的發(fā)生。炎癥主要位于黏膜層，亦可累計(jì)黏膜下層，較少深達(dá)肌層。本實(shí)驗(yàn)中，分別運(yùn)用腸滌清灌腸液灌腸、腸滌清灌腸液灌腸腸炎清1號灌胃、SASP灌腸灌胃法來活動(dòng)期實(shí)驗(yàn)性UC大鼠。治療2周后，結(jié)果表明3

24、種治療方法皆可減輕CMDI，尤其以腸滌清腸炎清組療效最為明顯（與其他3組比較，P值皆<0.01），在觀察結(jié)腸黏膜病理形態(tài)學(xué)方面，運(yùn)用藥物干預(yù)治療后，結(jié)腸黏膜炎癥都有不同程度的減輕，潰瘍變淺變小，炎癥細(xì)胞減少，證明運(yùn)用中藥綜合治療UC療效確實(shí)。    至今為止，UC的病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全明了。已有研究證實(shí)氧自由基與UC的結(jié)腸組織損傷密切相關(guān)，SOD活力下降，導(dǎo)致其清除氧自由基的能力下降，對細(xì)胞的保護(hù)減弱，同時(shí)MDA含量升高，脂質(zhì)過氧化程度加強(qiáng)，進(jìn)一步加劇對細(xì)胞的損傷程度，這是導(dǎo)致結(jié)腸炎癥及潰瘍形成的一個(gè)機(jī)制，因此本實(shí)驗(yàn)選擇UC大鼠血清及結(jié)腸組織勻漿中SOD活力、MDA含量來評價(jià)藥物治療作用。研究發(fā)現(xiàn)，造模后模型組UC大鼠血清及結(jié)腸組織勻漿中，SOD活力明顯下降（與正常組比較，P<0.01），MDA含量明顯升高（與正常組比較，P<0.01），與相關(guān)報(bào)道的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致3，4。通過藥物干預(yù)治療后，3個(gè)用藥組中大鼠血清和結(jié)腸組織中SOD活力皆有不同程度的升高；MDA含量均有不同程度的下降，以腸滌