土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù)

1、1 課題2 土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù) 、理論基礎(chǔ) 1篩選菌株 (1) 實(shí)驗室中微生物篩選的原理：人為提供有利于 _ 生長的條件(包括營養(yǎng)、溫度、pH等)，同時 _ 或 其他微生物生長。 (2) 選擇培養(yǎng)基：在微生物學(xué)中，將允許 _ 種類的微生物生長，同時 _ 和 _ 其他種類微生物 生長的培養(yǎng)基，稱作選擇培養(yǎng)基。 (3) 配制選擇培養(yǎng)基的依據(jù) 根據(jù)選擇培養(yǎng)的菌種的生理代謝特點(diǎn)加入某種物質(zhì)以達(dá)到選擇的目的。例如，培養(yǎng)基中不加入有機(jī)物可以選擇培養(yǎng) 微生物；培養(yǎng)基中不加入氮元素， 可以選擇培養(yǎng) _ ；的微生物加入高濃度的食鹽可選擇培養(yǎng)金黃 色葡萄球菌等。 2 統(tǒng)計菌落數(shù)目 (1) _ 測定微

2、生物數(shù)量的常用方法有 和 。 (2) 稀釋涂布平板法統(tǒng)計樣品中活菌的數(shù)目的原理 當(dāng)樣品的 _ 足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個 _ 。通過統(tǒng) 計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中大約含有多少活菌。為了保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在 _ 的平板進(jìn) 行計數(shù)。此外，測定微生物數(shù)量的常用方法還有 _ 直接計數(shù)。 3設(shè)置對照 設(shè)置對照的主要目的是排除實(shí)驗組中 _ 對實(shí)驗結(jié)果的影響，提高實(shí)驗結(jié)果的 _ 。例如為 了排除培養(yǎng)基是否被雜菌污染了，需以培養(yǎng) _ 的培養(yǎng)基作為空白對照。 二、實(shí)驗設(shè)計 關(guān)于土壤中某樣品細(xì)菌的分離與計數(shù)實(shí)驗操作步驟如下： 1 _ 取樣：從肥沃、濕潤的土壤中取

3、樣。應(yīng)先 _ 3 cm左右，再取樣，將樣品裝入事先準(zhǔn)備 好的 _中。 2制備 _ :準(zhǔn)備牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基和選擇培養(yǎng)基，將菌液稀釋相同的倍數(shù)，在牛肉膏蛋 白胨培養(yǎng)基上生長的菌落數(shù)目應(yīng)明顯 _ 選擇培養(yǎng)基上的數(shù)目，因此，牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基可以作 為 _ ，用來判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用。 3 微生物的 _ 與觀察 將10g 土樣加入盛有90 mL無菌生理鹽水的錐形瓶中(體積為250 mL)，充分搖勻，吸取上清液 _ ，轉(zhuǎn)移至盛 2 有 _ 的生理鹽水的無菌大試管中， 將土樣以1、101、102 依次等比稀釋至107稀釋度，并按照由107 103稀釋度的順序分別吸取 _ 進(jìn)行平板涂布操作。每

4、個稀釋度下需要 3個選擇培養(yǎng)基、1個牛肉膏蛋白胨 培養(yǎng)基。 將涂布好的培養(yǎng)皿放在 30C溫度下培養(yǎng)，及時觀察和記錄。 挑選選擇培養(yǎng)基中不同形態(tài)的菌落接入含 _ 培養(yǎng)基的斜面中，觀察能否產(chǎn)生如教材中的顏色反應(yīng)。 4. 細(xì)菌的計數(shù) 當(dāng)菌落數(shù)目穩(wěn)定時，選取菌落數(shù)在 _ 的平板進(jìn)行計數(shù)。在同一稀釋度下，至少對 3個平板進(jìn)行 重復(fù)計數(shù)，然后求出 _ ，并根據(jù)平板所對應(yīng)的稀釋度計算出樣品中細(xì)菌的數(shù)目。每克樣品中的 菌株數(shù)= _ C:某一稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)； V:所用稀釋液的體積； M: 稀釋倍數(shù)。 三、鑒定 1、尿素CO(NH 2)2重要的農(nóng)業(yè)氮肥。被土壤中細(xì)菌分解為 NH3才能被植物吸收利用

5、。 細(xì)菌歸酶 CO(NH;) )2 + HO - CO； +2NH 2、酚紅鑒別培養(yǎng)基：鑒定分解尿素的細(xì)菌。 原理：脲酶催化尿素分解成氨 T培養(yǎng)基堿性增強(qiáng) T酚紅變紅T結(jié)論：該細(xì)菌能分解尿素。 注意： 1、 在一定的培養(yǎng)條件下(相同的培養(yǎng)基、溫度及培養(yǎng)時間) ，同種微生物表現(xiàn)出相同而穩(wěn)定的菌落特征。 2、關(guān)注菌落的形態(tài)、大小、邊緣、突起、顏色、質(zhì)地等等，都是區(qū)分細(xì)菌的重要手段。 思維升華 1. 分離尿素分解菌操作中的注意事項 (1) 在實(shí)驗操作中，每個步驟都要注意無菌操作，以防培養(yǎng)基被污染，影響實(shí)驗效果。 (2) 樣品稀釋液的最佳濃度為獲得每個平板上有 30300個菌落，細(xì)菌一般為 104、1

6、05、106倍的稀釋液，放線菌一 般為103、104、105倍的稀釋液，真菌一般為 102、103、104倍的稀釋液。 為排除非測試因素(培養(yǎng)基)的干擾，實(shí)驗需設(shè)置牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基進(jìn)行空白對照。 (4) 每一稀釋倍數(shù)的菌液都至少要涂布 3個平板，作為實(shí)驗重復(fù)，求其平均值，若其中有菌落數(shù)與其他實(shí)驗差距懸殊 的，需要對該平板重新制作。 注意培養(yǎng)時間和溫度，獲取準(zhǔn)確的菌落數(shù)。細(xì)菌： 3037 C,培養(yǎng)12 d;放線菌：2528 C,培養(yǎng)57 d ; 霉菌(真菌):一般在2528 C,培養(yǎng)34 d。 (6) 微生物的菌落特征包括菌落的形狀、大小、隆起程度和顏色等方面。仔細(xì)觀察分離到的菌落，記錄它們的

7、特征。 (7) 做好標(biāo)記 本實(shí)驗使用的平板和試管比較多，為避免混淆，最好在使用前就做好標(biāo)記。 3 (8) 規(guī)劃時間 對于耗時較長的生物實(shí)驗，要事先規(guī)劃時間，以便提高工作效率，在操作時更加有條不紊。 2. 結(jié)果分析與評價4 內(nèi)容 結(jié)果分析 育無雜菌污染的判斷 對照的培養(yǎng)nil中無茵落生長 a 未被雜酉污染 培養(yǎng)基中苗落叛倫高一被雜茵污染 菌落形態(tài)客樣，菌落叛偏高一培養(yǎng)物中混入其他雜菌 選擇培養(yǎng)基的帰迭作用 牛肉膏蛋白啄培養(yǎng)基的菌落藪目大于選擇涪養(yǎng)基的數(shù) S 一選擇培養(yǎng)基具有篩選作用 樣品的稀釋操作 得到2個或2個以上曲落救目在30300的平板操作 成功 重復(fù)組的結(jié)果 若選取冋種土樣，統(tǒng)計結(jié)果應(yīng)接

8、近 、研究思路 1以下是分離土壤中分解尿素的細(xì)菌的培養(yǎng)基成分表，據(jù)表分析: 成分 KH：P0： aHP04 * TTtO 尿素 瓊脂 水 含量 1.理 2*lg 0.陀 10, Og LOg 15. Og 適量 （1）表中的KH2PO4、NaHP04和MgS0 4 72O為細(xì)菌提供 ，葡萄糖為細(xì)菌提供 ，尿素為微生物 提供 。瓊脂的作用是 _ _ 。 （2）如果將利用蛋白質(zhì)和多肽為唯一氮源的微生物培養(yǎng)在該培養(yǎng)基上，能否長出相應(yīng)的菌落? 數(shù)往往比活菌的實(shí)際數(shù)目低，原因是 _ （2）在三位同學(xué)的統(tǒng)計中，只有一位同學(xué)的統(tǒng)計是正確的，指出另兩位同學(xué)的統(tǒng)計為什么不正確? _ 。 （3）除了上述方法外還可

9、以用顯微鏡直接測定微生物的數(shù)量，通過顯微鏡直接計數(shù)法得到的一定是活菌數(shù)嗎? _ 。要得到活菌數(shù)應(yīng)該采取的措施是 _ _。 3在做本課題實(shí)驗時，A同學(xué)從對應(yīng)106倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約 只選擇出大約50個菌落。 （1）你認(rèn)為出現(xiàn)A同學(xué)這種結(jié)果的原因可能是什么？ _ 設(shè)計對照實(shí)驗，幫助 A同學(xué)排除影響實(shí)驗結(jié)果的因素。 _ （2）在探究實(shí)驗中，實(shí)驗設(shè)計要遵循 _ _ 等原則，即實(shí)驗組和對照組只有 不同, 在該培養(yǎng)基上生長繁殖的微生物只能是 。這種培養(yǎng)基被稱做 培養(yǎng)基。 。能夠 2三位同學(xué)用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中細(xì)菌數(shù)量。在對應(yīng)稀釋倍數(shù)為 106的培養(yǎng)基中，得到以下統(tǒng)計結(jié) 果: 甲同學(xué)涂

10、布了一個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)是 乙同學(xué)涂布了三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)是 丙同學(xué)涂布了三個平板，統(tǒng)計的菌落數(shù)是 260 ； 210、240和250，取平均值 233 ； 21、212和256，取平均值163 ； （1） 一個菌落就是一個細(xì)菌嗎? 。一個菌落可以代表樣品中的一個活菌嗎? 。事實(shí)上，統(tǒng)計的菌落 150個菌落，而其他同學(xué)在同樣的稀釋度下 _ 。針對你提出的可能原因, 5 其它條件都相同。這樣可以排除任何其他可能原因的干擾，確保實(shí)驗結(jié)果是 引起的，從而提高實(shí)驗 結(jié)果的 。 二、實(shí)驗設(shè)計 以下是土壤中某樣品細(xì)菌的分離與計數(shù)實(shí)驗流程: （1） 土壤取樣前應(yīng)對小鐵鏟和盛土的紙袋進(jìn)行 處理,取土樣時

11、要鏟除表層土的原因是 _ L。 （2） 實(shí)驗流程中， _ _ 等操作都要在火焰旁進(jìn)行。 （3） 分離不同的微生物其稀釋度相同嗎？為什么？ _ 。但稀釋的結(jié)果是相同的，即 _ _ 。測定土壤中分解尿素的細(xì)菌時，一般選用的稀釋度是 。 （4） 涂布平板時，每個稀釋度下需要涂布 個選擇培養(yǎng)基和 個牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，前者遵循了 _ 原則，后者起 作用。計數(shù)時對 培養(yǎng)基中的菌落數(shù)取其 。 （5） 某同學(xué)用稀釋涂布平板法測定同一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)，他在三個培養(yǎng)基表面分別涂布稀釋 106倍的O.ImL 菌液，經(jīng)培養(yǎng)后得到的菌落數(shù)分別是 222、212和241。那么每克樣品中的菌株數(shù)是 。 （6） 為進(jìn)一步

12、確定得到的是能夠分解尿素的細(xì)菌，可以在選擇培養(yǎng)基中加入 ，如果 ，我 們就可以準(zhǔn)確地鑒定該種細(xì)菌能夠分解尿素。6 【參考答案】 預(yù)習(xí)案： 一、 1 （1 ）目的菌珠 抑制 阻止（2）特定 抑制 阻止（3）自養(yǎng) 能固氮的微生物； 2（1）有稀釋涂布平板法和顯微鏡直接計數(shù)。 （2）.稀釋度細(xì)菌 30-300顯微鏡 3非測試因素 可信度無雜菌污染 二、 1. 土壤，鏟去表層土。 2.培 養(yǎng)基 多于對照 3培養(yǎng) 1ml 9ml 0.1mL 4.30-300 平均數(shù) 重難探究： 1、 統(tǒng)計某一稀釋度下平板上的菌落數(shù)，最好能統(tǒng)計 3個平板，計算出平板菌落數(shù)的平均值，然后按課本旁欄的公 式進(jìn)行計算 2、 這是因為土壤中各類微生物的數(shù)量（單位：株 /kg ）是不同的，例如在干旱土壤中的上層樣本中：好氧及兼性厭 氧細(xì)菌數(shù)約為2185萬，放線菌數(shù)約為 477萬，霉菌數(shù)約為23.1萬。因此，為獲得不同類型的微生物，就需要按不 同的稀釋度進(jìn)行分離，同時還應(yīng)當(dāng)有針對性地提供選擇培養(yǎng)的條件