小麥EMS突變體的創(chuàng)制與性狀鑒定

1、小麥EM茨變體的創(chuàng)制與性狀鑒定EMS(ethylmethanesulfonate)mutagenesisisatechnologythatusesEMStotreatseedsandcausemutations，sothatwecanobtainvaluablemutantsinashortperiodandprovidealargenumberofgermplasmresourcesforbreeding.Inthisstudy，theseedsofwheatcultivarsShannong666-2andShannong861weretreatedrespectivelybyEMS，an

2、dweobtained203Shannong666-2and306Shannong861singleplantsintheM1generation，thenplantedthemintoM2lines.InM2generation，onerepresentativeplantineachrowandthesingleplantswithsignificantvariationwereharvested.Weobtained290Shannong666-2and412Shannong861singleplants，andthenplantedasM3lines.IntheM3generation

3、，thetraitssuchasplantheight，headingdate，resistancetopowderymildewandstriperustwereinvestigatedintheadultplantstage.InShannong666-2，thevariationofplantheightwasobviouswiththevariationrangeof4080cm,andseveralhighanddwarfmutantlineswereobtained；somestrainswithhighresistancetostriperustorhighlysusceptib

4、letopowderymildewwereidentified.Itwasfoundthattheheadingdateofsomelineswas2daysearlieror14dayslaterthanthewildtype.InShannong861，wealsoobtainedseveralhighordwarfmutantlines，andtheplantheightrangewas2585cm；somestrainswithhighresistancetopowderymildeworhighsensitivitytostriperustwereidentified.Andthec

5、hangeinheadingdaterangedfrom3daysearlieror11dayslaterthanthewildtype.Theaboveresultsindicatedthatthemutantsobtainedbythismutagenesiswasabundant，whichprovidesimportantbasicmaterialsfortheidentification，cloningandfunctionalanalysisofwheatagronomictrait-relatedgenesanddisease-resistantgenes，aswellasimp

6、ortantgermplasmforwheatbreeding.KeywordsWheat；EMSmutagenesis；Mutant；Agronomictraits；Diseaseresistance小麥是世界三大糧食作物之一，世界上超過三分之一的人口以小麥為主糧。在我國，小麥是北方人口的主要食糧，每年種植面積約2300萬公頃，占全國糧食消費總額的1/5以上，居第三位，僅次于水稻和玉米1。近年來，隨著我國人口快速增長，城市化進程加快，土地種植面積減少，供求矛盾日益突出，怎樣快速提高小麥產(chǎn)量和質(zhì)量，是目前亟待解?Q的問題之一。影響小麥產(chǎn)量的因素很多，如株高、抽穗期、抗病性等。株高通過影響開花期

7、、植株倒伏程度來影響小麥產(chǎn)量1；抽穗期是小麥長期適應(yīng)不同地區(qū)和氣候環(huán)境條件的重要體現(xiàn)，它不僅與生育期密切相關(guān)，而且直接影響產(chǎn)量、抗病、抗逆等許多重要農(nóng)藝性狀2；另外，近年來以白粉病、銹病為代表的多種小麥病害3也嚴重影響著小麥的產(chǎn)量，發(fā)病嚴重時甚至導(dǎo)致絕收。培育高產(chǎn)抗病、抗倒伏的小麥品種是解決這些問題最有效的途徑，而EMS變技術(shù)是幫助育種家獲得有益變異的有效手段之一。甲基磺酸乙酯（ethylmethylsulfone,EMS是一種可以改變DNA吉構(gòu)的烷化劑。利用EMSt理種子以構(gòu)建突變體庫是獲得優(yōu)異種質(zhì)資源的重要途徑，具有種質(zhì)創(chuàng)新頻率高、遺傳變異譜寬、育種周期短等優(yōu)點。此外，以EM族變體為基礎(chǔ)，

8、可以快速篩選目的基因突變個體，挖掘新基因，開展功能基因研究4。由于EMS變技術(shù)在突變過程中容易形成點突變且不會造成染色體畸變，因而被廣泛用于構(gòu)建突變體庫。如：Kuraparthy等5利用栽培一粒小麥（T.monococcum構(gòu)建EM獲變體庫，篩選到提高小麥有效分蘗的突變株，并進一步發(fā)現(xiàn)了控制分蘗的tin3基因；陳洋等6用EMS&理抗黃矮病的小麥-中間偃麥草易位系YW642勺種子，從M2中篩選出32種不同性狀的突變體；沈銀柱等7利用EMSi發(fā)小麥花藥愈傷組織獲得耐鹽再生植株，并以鹽脅迫為選擇壓力，篩選出一級耐鹽品系。除此之外，還成功構(gòu)建了偃展41108、豫農(nóng)2019、京41110等表型變

9、異豐富的突變體庫，獲得了一些性狀優(yōu)良的突變體，為小麥遺傳育種和基因克隆提供了材料來源。為了構(gòu)建新的突變體庫，進一步豐富小麥遺傳育種和功能基因組學(xué)的基礎(chǔ)材料，本研究利用EM陽變技術(shù)處理兩個小麥高產(chǎn)品系山農(nóng)861及山農(nóng)666-2的種子，并進行相關(guān)農(nóng)藝性狀、抗病性等表型的考察，旨在為小麥新品種選育和基因克隆提供有價值的種質(zhì)材料，為發(fā)掘、鑒定有關(guān)農(nóng)藝性狀和抗病性相關(guān)基因及其功能鑒定奠定基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1 試驗材料山農(nóng)666-2與山農(nóng)861均為山東農(nóng)業(yè)大學(xué)選育的小麥新品系，由王洪剛教授提供。這兩個材料的共同特點是穗大、抗倒伏，同時具有高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)等優(yōu)點。不同之處在于：山農(nóng)666-2高抗白粉病，但高

10、感條銹病；山農(nóng)861高抗條銹病，但高感白粉病。1.2 試驗方法1.2.1 EMS變處理在室溫下分別用0.30%、0.35%、0.40%和0.45%的EM略處理500粒山農(nóng)666-2的種子，置于培養(yǎng)皿中發(fā)芽7天，統(tǒng)計各濃度下的發(fā)芽率和存活率，以確定最適的EMS處理濃度；用0.35%、0.40%的EM瀏理山農(nóng)861,存活率分別為64.3%、39.2%。以50%的存活率為衡量標準，最終確定山農(nóng)666-2、山農(nóng)861的最適EMSt理濃度分別為0.40%、0.38%。兩個品系分別處理3500粒種子，處理方法參見Slade等（2005）11的方法。1.2.2 田間種植、管理與收獲處理過的種子置于培養(yǎng)皿發(fā)芽

11、后，于2014年11月種植于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗站，種植密度為行長1.5m，行距0.25m，株距0.10m。2015年成熟時收獲所有存活單株的種子，其中，山農(nóng)666-2收獲203個單株，山農(nóng)861收獲306個單株。2015年秋季播種時，每個單株取1020粒種子，種植于山東農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗站，每個單株種一行，構(gòu)建成203個山農(nóng)666-2M2株行及306個山農(nóng)861M2株行。記載材料生長過程中幼苗、葉、莖、穗部等的表型變化，并調(diào)查株高、抽穗期、白粉病及條銹病抗性等性狀。鑒于M2代同一個株行的不同單株間仍可能存在變異，故收獲時，沒有出現(xiàn)明顯分離的株系，僅收獲一個單株；出現(xiàn)明顯分離的株系，先收獲一個最具代表性

12、的單株作為該株系的代表菌株，再收獲具有明顯變異的單株。山農(nóng)666-2共收獲290個單株，山農(nóng)861共收獲412個單株。這些單株于2016年秋播時每株取20粒種子，種植在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)實驗站，每個單株種一行，并對其株高、抽穗期、白粉病及條銹病抗性等性狀進行調(diào)查分析。在M2M3代種植過程中，每隔20行種植野生型及高感白粉病和條銹病的銘賢169材料各一行作為對照行及感染行，澆水、施肥等管理同正常田間管理。1.2.3 抽穗期與株高調(diào)查方法在調(diào)查抽穗期時，當每一株行中有三分之一的植株已抽穗，且每個穗子抽出三分之二時，確定為該株行的抽穗日期，抽穗期即為播種日期至抽穗日期間的天數(shù)。株高為從基部至主莖頂部即主莖

13、生長點之間的距離。1.2.4 病害鑒定白粉病鑒定：由于試驗地每年白粉病發(fā)病都很嚴重，白粉病抗性鑒定采用自然發(fā)病法。每隔20行種植高感白粉病、條銹病材料銘賢169作為感染行，當其成株期白粉病發(fā)病達到4級后，調(diào)查白粉病抗性，白粉病分級標準按照盛寶欽等12提出的6級反應(yīng)級別標準（表1）。條銹病鑒定：采用人工接種鑒定法，按照高盛國等13提出的注射接種方法，利用CYR31CYR32昆合菌種進行人工接種鑒定?？共〉燃墑澐植捎美钫襻?4提出的6級標準（表2）。2結(jié)果與分析對EM潴變處理后獲得的山農(nóng)666-2、山農(nóng)861M2代株行進行調(diào)查發(fā)現(xiàn)，M2代出現(xiàn)了多種性狀變異，如葉片畸形、穗子畸形、植株矮化、分蘗數(shù)

14、變化、抗病性變化、育性降低甚至不育等。進一步對M3代290個山農(nóng)666-2、412個山農(nóng)861株系的株高、抽穗期、白粉病及條銹病抗性等進行調(diào)查分析，結(jié)果如下。2.1 株高山農(nóng)666-2株高約70cm,經(jīng)EM夠變后，M3株系的株高出現(xiàn)2種類型的明顯變異（圖1、圖2a）:一是矮稈突變，株高在65cm以下的株系共87個，占M3株系總數(shù)的30%平均株高為56cm,最低株高僅為40cm；二是高稈突變，株高在75cm以上的視為高稈變異，共47個株系，占M3株系總數(shù)的16.2%,平均株高為78cm，最高可達80cm。山農(nóng)861株高約68cm,經(jīng)EMSi變后，株高也發(fā)生了明顯的變異（圖1），其中株高在63cm

15、以下的矮稈變異共73個，占M3株系總數(shù)的17.7%,平均株高為56cm,最矮至25cm；株高在73cm以上的高稈變異共有89個，占M3株系總數(shù)的21.6%,平均株高為78cm,最高可達85cm。2.2 抽穗期山農(nóng)666-2的抽穗期是198天，經(jīng)EMS變后，抽穗期有較大變異（圖1）。在290個M3代株系中，有3個抽穗期提前，占比1.0%，其中，有2個株系的抽穗期提前2天，1個株系提前1天；抽穗期延遲的株系較多，共205個，占比70.7%，最晚的延遲14天。山農(nóng)861的抽穗期是199天，經(jīng)EMSi變后獲得了不同抽穗期的突變株系（圖1）。其中，70個株系的抽穗期提前13天,占比16.9%；287個株

16、系的抽穗期延遲，占比69.7%，最晚的延遲11天。2.3 白粉病抗性經(jīng)EM潴變后，山農(nóng)666-2白粉病抗性發(fā)生3種類型變異（圖1）:59個株系由高抗突變?yōu)橹锌?，占?0.3%;23個株系由高抗突變?yōu)橹懈校急?.9%;7個株系由高抗突變?yōu)楦吒校?.4 %。山農(nóng)861經(jīng)EMS變后，也發(fā)生了3種類型白粉病抗性變異（圖1）:127個株系由高感突變?yōu)橹懈校急?0.8%;40個株系由高感突變?yōu)橹锌?，占?.7%;78個株系由高感突變?yōu)楦呖挂陨希▓D2b）,占比18.9%。2.4 條銹病抗性經(jīng)EM潴變后，山農(nóng)666-2條銹病抗性發(fā)生3種類型變異（圖1）:61個株系由高感突變?yōu)橹懈?，占?1.0%;51個株

17、系由高感突變?yōu)橹锌?，占?7.6%；41個株系由高感突變?yōu)楦呖挂陨希▓D2c）,占比14.1%。山農(nóng)861經(jīng)EM夠變后，同樣出現(xiàn)了3種類型條銹病抗性變異（圖1）:30個株系由高抗突變?yōu)橹锌?，占?.3%;6個株系由高抗突變?yōu)橹懈校急?.5%；3個株系由高抗突變?yōu)楦吒校▓D2d）,占比0.7%。2.5 白粉病、?l銹病抗性均發(fā)生變異的突變在白粉病和條銹病抗性變異株系中，有些兩者同時發(fā)生了變異，山農(nóng)666-2中有4個株系白粉病突變?yōu)楦吒卸鴹l銹病突變?yōu)楦呖?，占?.4%；山農(nóng)861中有1個株系白粉病突變?yōu)楦呖苟鴹l銹病突變?yōu)楦吒校急?.2%。3討論與結(jié)論EMSt度是影響突變體出芬率及變異頻率的一個重要

18、因素。趙天祥等15分別用0.7%和1.2%的EMSt理小麥品種偃展4110,表型變異率分別為2.9%與3.7%。本研究首先分別利用四種濃度（0.30%、0.35%、0.40%、0.45%）和兩種濃度（0.35%、0.40%）的EMS1處理小麥品系山農(nóng)666-2和山農(nóng)861的種子，通過比較各濃度下的發(fā)芬率和存活率，確定適合兩品種的最適EM瀏理濃度分別為0.40%和0.38%,再用最適濃度的EM瀏理小麥種子，從而提高了變異頻率。但本研究確定的EMS&適濃度與前人的差異較大，可能是因為EMSB度對基因型不同的材料影響不同。經(jīng)EM潴變處理后的小麥種子，農(nóng)藝性狀和產(chǎn)量性狀會發(fā)生不同類型的變異，且多為不良突變，優(yōu)良變異較少。本研究獲得了一些有益突變，為了降低突變不穩(wěn)定性，對M3代突變株系的株高、抽穗期及部分抗病性進行調(diào)查，最終獲得了多種突變株系。其中，突變株系的最大株高差可達60cm,因此，對株高差異較大的突變株配制雜交組合，培育大的分離群體，可以加快株高相關(guān)基因的定位與克隆?？刂菩←湷樗肫诘幕蛴腥惔夯颉⒐庵芷诨蚣捌渌颍@些基因中的任何一個或幾個發(fā)生突變都會造成晚熟，這也解釋了為什么本研究中抽穗期延后的突變株系遠遠多于抽穗期提前的，下一步我們可以對抽穗期相差較大的單株進行基因鑒定，尋找控制抽穗期的基因并運用于小麥新品種的培育。白粉病、條銹病等病害嚴重影響小麥的產(chǎn)量和品