尼莫地平抑制大鼠燒傷后枯否細胞TNF的產(chǎn)生

1、尼莫地平抑制大鼠燒傷后枯否細胞TNF的產(chǎn)生【關(guān)鍵詞】 燒傷 尼莫地平 枯否細胞 腫瘤壞死因子 【摘要】 目的 探討鈣離子通道阻斷劑尼莫地平調(diào)控燒傷后枯否細胞（KC）合成釋放TNF的可能性，為尋找到一種有效減輕、控制燒傷后過度全身炎癥反應(yīng)的措施提供理論依據(jù)。方法 內(nèi)灌注消化、密度梯度離心法分離培養(yǎng)正常SD大鼠KC，顯微熒光分光光度計復合倒置顯微鏡技術(shù)觀察燙傷血清作用下單個KC細胞內(nèi)鈣（Ca 2+ i）變化，ELISA方法測定燙傷血清培養(yǎng)的KC上清中TNF濃度變化;SD大鼠行30%TBSA度燙傷，傷后6h分離KC，RNA酶保護分析法測定KC TNFmRNA表達量，并測定血漿TNF水平;觀察尼莫地平

2、存在時，上述結(jié)果的改變。結(jié)果 與對照組相比，燒傷組KCCa 2+ i峰值及培養(yǎng)上清中TNF濃度增加值均顯著增加（P0.01），在1M尼莫地平存在時，兩者均顯著減少（P0.01）。燒傷后6h KC TNFmRNA表達量及血漿TNF水平顯著升高，靜脈給予尼莫地平（40g?kg -1 ?h -1 ）后，兩者均顯著減少（P0.01）。結(jié)論 燒傷后，KC合成釋放TNF，通過細胞內(nèi)鈣離子通道信號傳導途徑實現(xiàn)。尼莫地平能抑制燒傷后KC TNFmRNA表達，使KC產(chǎn)生TNF明顯減少，并下調(diào)血漿中TNF的總體水平。關(guān)鍵詞 燒傷 尼莫地平 枯否細胞 腫瘤壞死因子Nimodipine can inhibit the

3、 production of TNFby kupffer cells in severe burned ratsWang Guangyi，Tian Jianguang，Zhu Shihui，et al.Burn Department，ChanghaiHospital，Shanghai200433.【Abstract】 Objective To study whether nimodipine，a Dihydropyridine-type calcium channel blocker，can inhibit the production of TNFby kupffer cells（KC）an

4、d down-regulate its level of plasma after severe burn injury.Methods KCs of normal rats were isolated with portal vein catheter，intrahepatic digestion and density gradient centrifugation.Intracellular calcium concentration（Ca 2+ i）in individual KC after stimulated with postburn serumwas assessed flu

5、orometrically with microspectrofluorometer.Level of TNFin the supernatant of KC cultured with postburn serumwas detected by ELISA.SD rats underwent30%TBSA full thickness burn.Six hours later，KC were isolated and their total RNA was extracted.Level of TNFmRNA was detected by ribonuclease protection a

6、ssay.Level of plasma TNFwas also detected.Role of nimodipine on above-mentioned effects were observed.Results Compared with that of control group，Ca 2+ i of KC and level of TNFin supernatant in burn group increased significantly.At present of1M nimodipine，however，the numerical value decreased signif

7、icantly.Compared with that of control group，level of KC mRNA and plasma TNFin burn group also increased significantly.After intravenously injection with nimodipine（40g?kg -1 ?h -1），the numerical value decreased significantly.Conclusion Kupffer cells of rats are activated to secret TNFafter severe bu

8、rn injury and this process is realized through calcium ion signal transduction channel.Nimodipine can inhibit TNFproduction of KC by preventing its mRNA transcription，down-regulated its level of plasma.Key words burn nimodipine kupffer cells tumor necrosis factor嚴重燒傷后，大量炎癥介質(zhì)釋放，引起全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS）。腫瘤壞死

9、因子（TNF）在SIRS的發(fā)生發(fā)展中起主導作用，而枯否細胞（KC）是體內(nèi)TNF的重要來源。鈣離子通道作為細胞信號傳導的第二信使，在KC的活化中起重要作用。本研究旨在探討鈣離子通道阻斷劑的尼莫地平調(diào)控KC合成釋放TNF的可能性，為尋找到一種能用于燒傷臨床治療的有效減輕、控制過度全身炎癥反應(yīng)的措施提供理論依據(jù)。1 材料與方法1.1 燙傷血清的制備 成年SD大鼠（第二軍醫(yī)大學實驗動物中心提供，以下同），雌雄不限，體重200250g，隨機分成燒傷組和對照組。腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，剃軀干毛。燒傷組大鼠浸入98熱水中燙背部10s，造成30%TBSA度燒傷（經(jīng)病理證實）;對照組大鼠用室溫水模擬燙傷過程。

10、傷后6h取頸動脈血，分離血清，于-70凍存。1.2 KC的分離和培養(yǎng) 參照Tomioka等方法，采用密度梯度離心法分離正常SD大鼠肝臟KC。將分離的KC接種于96孔板中，每孔細胞數(shù)量4.010 5 個，隨機分為燒傷組（B組）、對照組（C組）和尼莫地平組（N組），置于5%CO 2 培養(yǎng)箱中。用DMEM培養(yǎng)液37培養(yǎng)24h后，棄去培養(yǎng)液，加入含20%血清的DMEM培養(yǎng)液，其中燒傷組和尼莫地平組培養(yǎng)液中含1M尼莫地平（購自Bayer公司）為燙傷血清，對照組為對照血清。各培養(yǎng)孔于培養(yǎng)開始及3h后取上清，采用ELISA方法進行TNF濃度測定，ELISA試劑盒購自Diaclone公司。將培養(yǎng)3h的TNF濃

11、度測定值減去培養(yǎng)初始濃度，計算TNF的濃度增加值。1.3 單細胞細胞內(nèi)游離鈣離子濃度（Ca 2+ i）的測定 將分離的正常SD大鼠KC貼附于蓋玻片上，培養(yǎng)24h后，分別在含20%對照血清、燙傷血清和含1M尼莫地平的燙傷血清條件下，參照Agafonove等方法，采用顯微熒光分光光度計復合倒置顯微鏡（購自O(shè)lympus公司）技術(shù)，觀察單個KCCa 2+ i變化，熒光指示劑為Fura-2/AM（購自Calbiochem公司）。1.4 血漿細胞因子濃度測定 成年SD大鼠18只，體重200250g，隨機分成對照組（C組）、燒傷組（B組）、尼莫地平組（N組），每組大鼠各6只。按實驗步驟1中的方法燙傷B組和

12、N組大鼠，C組大鼠行假燙處理。大鼠燙傷成功后立即行尾靜脈穿刺，按Parkland公式持續(xù)液體復蘇，其中B組大鼠單純用乳酸鈉林格氏液復蘇，N組大鼠復蘇液體中含有尼莫地平，用量40g?kg -1 ?h -1 ，C組大鼠行尾靜脈穿刺不補液。傷后6h取血，采用ELISA方法進行血漿TNF濃度測定。同時按前述方法分離KC，采用一步法進行KC總RNA的抽提，使用RNA抽提純化試劑盒（購自上海華舜生物工程公司）。1.5 細胞因子mRNA含量測定 參照Rottman等方法，主要試劑均購自Pharmingen公司。體外轉(zhuǎn)錄合成同位素- 32 P標記的RNA探針:包括TNF和內(nèi)參照GAPDH探針。采用RNA酶保護

13、分析法將RNA探針與KC總RNA雜交，進行非梯度聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯像，用Gel Works1D Advanced v4.01軟件進行圖像分析，以GAPDH灰度值進行標準量化后，測量TNF條帶的相對灰度值。TNFmRNA的表達量，用已經(jīng)標準量化的GAPDH灰度值的相對值表示（100%）。1.6 統(tǒng)計學處理 TNF含量、Ca 2+ i和mRNA表達量用xs表示，不同組間統(tǒng)計學差異做非配對資料的t檢驗。2 結(jié)果2.1 燙傷血清對KCCa 2+ i的影響 對照組Ca 2+ i峰值為（10.70.89）nM，加入燙傷血清后，Ca 2+ i峰值為（42.11.66）nM，顯著高于對照組（P0.0

14、1），在1M尼莫地平存在時，Ca 2+ i峰值較單純燒傷組顯著減少（19.90.58）nM（P0.01）（見圖1）。圖2 尼莫地平對燒傷血清刺激的KCCa 2+ i的影響（n=630個細胞） （圖略）2.2 尼莫地平對KC分泌TNF的抑制作用 在含對照血 清的C組，KC培養(yǎng)上清中TNF濃度增加值為（19.323.45）pg/ml，而在含燙傷血清的B組，TNF濃度增加值（437.5669.78）pg/ml顯著升高（P0.01），在1M尼莫地平存在時，TNF濃度增加值（42.5414.23）pg/ml較單純燒傷組顯著減少（P0.01）。2.3 尼莫地平對細胞因子mRNA表達的影響 對照組大鼠KC表

15、達一定量的TNFmRNA（0.470.15），燒傷后細胞因子mRNA表達顯著升高（1.170.31，P0.01），給予尼莫地平后，細胞因子mRNA表達顯著降低（0.860.23，P0.01）。2.4 尼莫地平對大鼠燒傷后血漿TNF水平的影響 對照組大鼠血漿內(nèi)存在少量TNF（27.659.59）pg/ml，大鼠燒傷后6h血漿TNF水平（610.3595.47）pg/ml顯著增加（P0.01），靜脈給予尼莫地平后，血漿TNF水平（275.4612.63）pg/ml顯著下降（P0.01）。3 討論嚴重燒傷后，免疫系統(tǒng)被激活，大量炎癥介質(zhì)釋放，導致SIRS的發(fā)生。TNF在SIRS的發(fā)生、發(fā)展中起主導作用。KC作為巨噬細胞中最大的細胞群體，占巨噬細胞總數(shù)80%90%，是體內(nèi)TNF的主要來源，因而在燒傷后SIRS的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。KC作用的