外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)及染色體G帶標(biāo)本制備的實驗對策

1、外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)及染色體G 帶標(biāo)本制備的實驗對策李潔, 徐文瑜, 楊嬌英(廣東湛江市婦幼保健院, 廣東524038摘要:1700例外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)成功率為97%, 8500份G 顯帶標(biāo)本制備合格率為94%, 核型分析報告完成率97%。本文對染色體制備技術(shù)多個環(huán)節(jié):標(biāo)本采集、接種、培養(yǎng)、低滲、固定、消化、。對40例失敗原因及17次違規(guī)操作經(jīng)采取補救措施的效果進行分析評價, 。關(guān)鍵詞:外周血淋巴細(xì)胞; G 顯帶; 實驗對策中圖分類號:R446171文獻標(biāo)識碼:B - -0051-02外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)及G 傳學(xué)研究的基礎(chǔ), , 多環(huán)節(jié)易受不確定因素干擾的報道多以羊水、, 針對外周血染色體制作方

2、面的報道極少, 本文在15年進行1700例培養(yǎng), 8500份G 顯帶處理基礎(chǔ)上總結(jié)出如下實驗對策。資料與方法實驗對象:1990年10月2005年8月我院婦兒門診遺傳咨詢者及婦產(chǎn)科、新生兒科住院患者1700例。設(shè)備與試劑:恒溫箱、烤箱、水浴箱、圖像分析系統(tǒng)。前1000例培養(yǎng)基為自配, 主要成份:1640粉、小牛血清、PHA 、不含抗生素。后700例培養(yǎng)基為湖南湘雅基因技術(shù)有限公司產(chǎn)品。肝素抗凝劑、0. 75%低滲液、0. 4g/ml 秋水仙素、胰酶粉、Gi m esa 染液均為自配。其中抗凝劑, 反復(fù)高壓4保存。秋水仙素反復(fù)凍融-10保存, 胰酶粉(顯帶前臨時配制 4保存, 均可長期多年使用。實

3、驗方法:按國內(nèi)公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)方法1, 微量全血培養(yǎng)G 顯帶。為便于質(zhì)控, 各操作環(huán)節(jié)計量恒定:抗凝全血接種5滴(摘下針頭培養(yǎng)37、72h秋水仙素阻斷0. 4g/ml 4滴(6號針頭 離心控制2000r/min ×10m in 低滲液4m l 37水浴15m in 預(yù)固定1m l 室溫5m in 2次固定4m l 室溫5m in 細(xì)胞懸液0. 6m l 滴冰片2滴/片×5干燥3720h 烘烤803h 胰酶消化6m in Gi m esa 染片30m in結(jié)果與分析培養(yǎng)成功率為97%。本室自定培養(yǎng)合格標(biāo)準(zhǔn)為每例滴片5張, 共有40個以上眾相數(shù)可供計數(shù)。50%的核型(20/40 各條

4、染色體分布舒展, 相對集中、少重疊, 于40×10鏡下可明顯觀察到1號、7號、11號、14號、X, 這6條帶紋特征性強的染色體。培養(yǎng)合格可進行下一步顯帶處理。培養(yǎng)失敗40例, 其中2例, 與臨床用藥和疾病相關(guān)38例(見表1 。表1培養(yǎng)失敗40例分析(40×10倍總相數(shù)/5片顯帶實驗/臨床聯(lián)系n 0纖毛菌阻斷時見培養(yǎng)液混濁2<10門診感染性病例5<30極短A =E 伴新生兒溶血性黃疸5<15引產(chǎn)住院病例17制片成功率為94%(7990/8500 。G 帶處理共8500張片。顯帶合格標(biāo)準(zhǔn)為100×10鏡下, 2號、4號、6號、13號、17號、20號、

5、22號共7對染色體的特征性帶紋區(qū)域可辨認(rèn)(見表2 。顯帶合格的核型應(yīng)15個/5張片。表2室內(nèi)染色體G 顯帶合格標(biāo)準(zhǔn)組型號別顯帶特征描述A 2p1區(qū)2帶6帶p2區(qū)2帶4帶短臂顯4條深色帶B 4p1區(qū)3帶5帶q3區(qū)4帶短臂近著絲粒區(qū)顯1條深色帶長臂未端顯1條深色帶C 6p1區(qū)2帶q2區(qū)4帶短臂近著粒區(qū)1條深色帶中段淺帶區(qū)較寬D 13p2區(qū)1帶p3區(qū)1帶長臂中段深寬帶E 17q2區(qū)1帶q2區(qū)4帶長臂未端1條深寬帶F 20p1區(qū)2帶短臂上1/2有1細(xì)灰?guī)22q1區(qū)1帶長臂中段1細(xì)灰?guī)?7例違規(guī)操作采取補救措施后2例失敗, 成功率為88.2%見表3。表317例違規(guī)操作補救效果觀察n違規(guī)記錄補救措施相數(shù)

6、顯帶3采標(biāo)本置室溫>10h 接種繼續(xù)實驗>40良2低滲后即離心(未固定 重新打散細(xì)胞預(yù)固定5m in >50良2低滲前誤加固定劑離心、棄上清液移管加蒸餾水低滲處理>30合格4培養(yǎng)至91h 進行阻斷繼續(xù)實驗>40良2阻斷前發(fā)現(xiàn)細(xì)胞大部分凝固成塊加秋水仙時充分振散凝塊, 于低滲時棄除傷血塊>50合格2烤片溫度失控(>100 繼續(xù)實驗>50核型固縮不合格2第一次固定>3h繼續(xù)實驗>10合格(下轉(zhuǎn)第25頁15中國優(yōu)生與遺傳雜志2006年第14卷第1 期嚴(yán)重, 被認(rèn)為是造成各種先天畸形和病殘的重要病因之一6, 孕婦只要有HC MV 感染, 就有

7、可能引起嚴(yán)重的胎兒先天感染和新生兒疾病8。孕婦感染HC MV 可發(fā)生在妊娠的各個時期, 可以是原發(fā)的, 也可以是復(fù)發(fā)的。孕婦在各個時期感染發(fā)生宮內(nèi)傳播的危險率之間雖無差異, 但是以孕早期的感染對胎兒危害最大, 常引起較重的全身感染和先天畸形, 并且母體的原發(fā)性感染比復(fù)發(fā)性感染更易引起宮內(nèi)傳播8, 所以及早發(fā)現(xiàn)HC MV 感染具有重要的臨床意義, 為臨床提供了正確的診治和處理依據(jù)。臨床實踐證明, 傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)進行病毒分離需要時間長; 而血清學(xué)檢測抗體則對抗體的要求較高, 且易出現(xiàn)假陰性及假陽性, 即使抗體陽性并不說明病毒是即時感染還是既往感染, 而不能滿足臨床早期、快速、方法是近年來新興的一種技

8、術(shù), , 我們就可以應(yīng)用PCR 而F Q -PCR , 號來檢測PCR 產(chǎn)物, , 另一方面還可以做到PCR 每循環(huán)一次就收集一個數(shù)據(jù), 建立實時擴增曲線, 準(zhǔn)確地確定CT 值, 從而根據(jù)CT 值確定起始DNA 拷貝數(shù), 做到了真正意義上的DNA 定量。它根據(jù)基因擴增量的多少來判斷病毒的治療和預(yù)后監(jiān)測情況, 而且和常規(guī)PCR 相比, 它具有特異性強、靈敏度高、定量準(zhǔn)確、儀器在線式實時監(jiān)測、結(jié)果直觀、避免人為判斷, 自動化程度高等特點, 且有效解決了PCR 污染問題。建立HC MV 感染的特異性早期診斷方法是治療預(yù)防該病的前提和關(guān)鍵。F Q -PCR 可應(yīng)用于HC MV 的早期診斷:許多病原體的

9、抗體產(chǎn)生存在較長的“窗口期”, 不利于疾病的早期診斷, 而此法直接檢測病毒DNA, 大大縮短了“窗口期”; 還可用于病情判斷和預(yù)后評價及藥物療效觀察:根據(jù)熒光定量PCR 檢測直接、反映病原體滴度是否受到藥物的治療而發(fā)生變化, 從而為藥物療效觀察提供直接依據(jù), 以供臨床上對用藥劑量、用藥時間以及是否聯(lián)合用藥提供參考。HC MV 病毒的早期快速診斷和及時徹底的治療, 對提高我國人口素質(zhì), 優(yōu)生優(yōu)育具有十分重要的意義, 隨著對我國HC MV 研究的進一步深入, F Q -PCR 的大力推廣應(yīng)用, HC 2MV 感染的會得到及時控制。獻1, 方法檢測孕婦血中HC MV 感染J .中, 2003, 11

10、(5 :39., 聞良珍. 人巨細(xì)胞病毒PP 65蛋白基因的克隆及表達J .中國優(yōu)生與遺傳雜志, 2003, 11(1 :40-42.3Fowler K B, et al . Maternal age and congenital cyt omegal ovirus infec 2ti on:sreening of t w o diverse newborn populati ons 1980-1990J .J I nfect D is, 1993, 168:552.4張厚善, 王守蘭, 周妍, 等. 蘭州地區(qū)早孕婦女、產(chǎn)婦及新生兒中巨細(xì)胞病毒感染的研究J .中國優(yōu)生與遺傳雜志, 1998,

11、6(5 :52.5董水綏. 繼續(xù)深入進行巨細(xì)胞病毒感染研究J .中華兒科雜志,1995, 1:3.6肖坤則, 等. 中國圍產(chǎn)兒素質(zhì)現(xiàn)狀調(diào)查研究J .中華醫(yī)學(xué)雜志,1989, 4:185.7Stagno S, et al . Pri m ary cyt omegal ovirus infecti on in p reganncy . I nci 2dence, trans m issi on t o fetus, and clinical outtcomeJ . JAMA, 1986, 256:1904.收稿日期:2005-05-31(上接第51頁討論本室在公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)方法基礎(chǔ)上, 對實驗全程進行

12、量化恒定, 利于把握, 前后可比。在試劑使用上相對簡便。從多次違規(guī)操作的補救效果中受到啟發(fā), 在必要時推遲阻斷時間到91h, 接種不受限, 周四接種可推到周一收獲, 方便遠路咨詢者。此外遇表3操作失誤時, 勿輕易中止實驗。培養(yǎng)過程污染機率極低。導(dǎo)致培養(yǎng)失敗的主要因素是抗生素、消炎藥、高膽紅素(間接膽紅素 的干擾, 可能對淋巴細(xì)胞的抑制影響培養(yǎng)質(zhì)量, 用藥近期和新生兒高膽紅素血癥應(yīng)暫緩采血培養(yǎng)。防止染色體丟失。離心速度應(yīng)2000r/min 。稍緊縮的細(xì)胞沉淀物可避免操作時碰顫致沉淀物懸浮, 在棄上清液時易丟失少量沉淀物。上世紀(jì)70年代有報道標(biāo)本總量(細(xì)胞+試劑 設(shè)為4m l 2, 本文認(rèn)同。實驗

13、證明, 4m l 低滲液、固定劑, 對染色體去膜化解旋、舒展、膨脹并無影響。相反, 8m l 細(xì)胞懸液與試管, 吸管貼壁面積過大, 在反復(fù)多次吸吹過程中丟失部份有效成份?？酒遣蝗菸鹨暤沫h(huán)節(jié)?？酒瑫r間有56過夜或3723d 3, 即刻6080210h 4。本室采取3720h 后803h ?？酒粌H是老化過程, 還可蒸發(fā)殘留于標(biāo)本片上固定劑成份, 醇類酸類物質(zhì)的徹底蒸發(fā), 將利于消化液pH 環(huán)境。已報道G 顯帶技術(shù)有7種5, 但以胰酶消化為主。胰酶消化過程短促, 直接影響顯帶效果的不確定因素有:胰酶的效價、濃度、時間、pH 值3, 因此, 消化過程需靈活控制, 積累經(jīng)驗。本室15年來摸索出一套適應(yīng)2-4人份/每批量的消化方法:臨時配制胰酶液, 用小耳勺挑取少許胰酶粉溶解于0. 85%鹽水中, 配制成0. 25%濃度。消化時間為6m in 。小耳勺不需消毒處理, 用蒸餾水沖洗置37干燥。胰酶粉只要保持干燥, 多年不變質(zhì), 操作簡便, 節(jié)省試劑。效果穩(wěn)定, 適用于基層醫(yī)院。染色對顯帶非常重要。Gi m esa 為噻嗪類染料, 其堿性成份天青B 與DNA 分子中的磷酸基結(jié)合, 蛋白質(zhì)在一定的環(huán)境中, 具有不同的嗜酸性和嗜鹼性傾向, 出現(xiàn)著色差異易于觀察。因此染液pH 值對著色效果有影響。當(dāng)呈淡灰色帶紋不顯時, 應(yīng)調(diào)節(jié)染液pH