殼寡糖抗腫瘤作用及免疫調(diào)節(jié)機(jī)理

1、殼寡糖抗腫瘤作用及免疫調(diào)節(jié)機(jī)理           作者：吳海明，華曉陽，何登全 【摘要】  目的  研究殼寡糖對小鼠腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的抑制作用以及殼寡糖對培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子表達(dá)的影響。方法  接種腫瘤的小鼠尾靜脈注射殼寡糖，觀察殼寡糖對腫瘤的生長和抑制作用。用相對定量的逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測殼寡糖對巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的影響。結(jié)果  殼寡糖對S180肉瘤的抑瘤率為35.02%（P

2、0.001)，對Lewis肺癌的轉(zhuǎn)移灶的影響：實(shí)驗(yàn)組（2.1±1.73），對照組（4.0±2.14），兩組比較，P0.05。巨噬細(xì)胞加入殼寡糖作用24h后，細(xì)胞因子的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P0.01)。結(jié)論  殼寡糖具有良好抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的作用。殼寡糖可增強(qiáng)巨噬細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子表達(dá)。        【關(guān)鍵詞】  殼寡糖；腫瘤；巨噬細(xì)胞；細(xì)胞因子            【Abstract】&

3、#160; Objective  To study the influence of oligochitosan in inhibiting growth and metastasis  of  tumor in  rats， and in expression of cytokines associated with macrophage. Methods  Inhibition of growth of tumor was  observed after oligochitosan 

4、;injected into rats through tail vein，the influence in transcription and translation of cytokines associated with macrophage was measured by RT-PCR and ELISA techniques.Results  Inhibition rate of  sarcoma S180 was  35.02%（P0.001) after injection of oligochitosan.

5、The  influence in  metastasis of Lewis lung cancer(P0.05)：experiment group（2.1±1.73），controlled group（4.0±2.14）. 24hs  after oligochitosan added to macrophage，expression of cytokine increased significantly(P0.01). Conclusion  Oligochitosan can inhibit growth&#

6、160; and  metastasis of tumor，and enhance expression of cytokines associated with macrophage.        【Key words】  oligochitosan； tumor；macrophage；cytokine        甲殼素是自然界豐富的生物資源之一，其部分脫乙酰化產(chǎn)物殼聚糖，具有抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、抑菌等多種生理功能。但殼

7、聚糖不溶于水，利用纖維素酶將其降解為殼寡糖，具有較好的水溶性易被人體吸收，本實(shí)驗(yàn)旨在研究殼寡糖對實(shí)驗(yàn)性小鼠S180腫瘤和Lewis肺癌的抑制作用以及殼寡糖對體外培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子基因表達(dá)的影響。        1  材料與方法        1.1  材料        1.1.1  殼寡糖  由浙大醫(yī)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室制備。    &

8、#160;   1.1.2  動物來源  小鼠由浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心提供，體重為1820g。        1.1.3  小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7  由中科院上海細(xì)胞所提供。        1.1.4  標(biāo)準(zhǔn)DNA marker和ELISA實(shí)驗(yàn)試劑  由上海貝西科技公司提供。        1.2  方法 &

9、#160;      1.2.1  殼寡糖抗腫瘤作用實(shí)驗(yàn)方法  無菌取S180肉瘤和Lewis肺癌細(xì)胞，制成2×107細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液；皮下注射腫瘤液于ICR種小鼠（0.2ml/只），次日分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，每組10只ICR種小鼠。實(shí)驗(yàn)組尾靜脈注射100mg/kg的殼寡糖，對照組注射生理鹽水，停藥次日處死小鼠，剝離實(shí)體瘤稱重或觀察轉(zhuǎn)移病灶數(shù)，計(jì)算抑瘤率（%）。        1.2.2  殼寡糖對巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的影響實(shí)驗(yàn)方法  培養(yǎng)小鼠采

10、用RT-PCR法和ELISA法研究殼寡糖對巨噬細(xì)胞IL-1、TNF-a和IL-18的基因表達(dá)的影響：實(shí)驗(yàn)組和對照組巨噬細(xì)胞分別提取RNA和收集上清液RT-PCR法檢測mRNA水平基因表達(dá)的變化以及ELISA法檢測蛋白表達(dá)量的變化。        1.3  統(tǒng)計(jì)學(xué)方法  各組值均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間采用t檢驗(yàn)，P0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)差異有顯著性意義。        2  結(jié)果    &#

11、160;   2.1  殼寡糖抗腫瘤作用  殼寡糖對小鼠S180肉瘤生長的影響（見表1），從表中可以看出實(shí)驗(yàn)組的抑瘤率為35.02%（P0.001），環(huán)磷酰胺組的抑瘤率為50.16%（P0.001）。殼寡糖對Lewis肺癌的影響（見表2）實(shí)驗(yàn)組的轉(zhuǎn)移灶為（2.1±1.73），對照組的轉(zhuǎn)移灶為（4.0±2.14），P0.05。綜合表1和表2可以看出殼寡糖對腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移具有明顯的抑制作用。 表1  殼寡糖對小鼠S180肉瘤生長的影響     表2  殼寡糖對小鼠Le

12、wis肺癌轉(zhuǎn)移的影響         2.2  殼寡糖對巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子表達(dá)的影響        2.2.1  殼寡糖最適作用時(shí)間的確定  巨噬細(xì)胞貼壁后加入殼寡糖，在4、8、16、24、48h不同時(shí)間段通過RT-PCR法檢測IL-1、INF-、IL-18的基因轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示24h達(dá)到高峰，故確定以24h為殼寡糖最適作用時(shí)間。        2.2.2

13、0; 殼寡糖最適作用濃度的確定  小鼠巨噬細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)貼壁后，按濃度10、20、30、40、60、80g/ml的劑量加入殼寡糖繼續(xù)培養(yǎng)，各組巨噬細(xì)胞樣本經(jīng)RT-PCR法結(jié)果見表3、4、5。 表3  不同濃度殼寡糖對巨噬細(xì)胞IL-1基因轉(zhuǎn)錄水平的影響    注：以-actin為內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)，各組均值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；*表示經(jīng)t檢驗(yàn)與對照組差異有顯著性，P0.05(n=4) 表4  不同濃度殼寡糖對巨噬細(xì)胞IL-18基因轉(zhuǎn)錄水平的影響     注：以-actin為內(nèi)參照標(biāo)

14、準(zhǔn)，各組均值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；表示經(jīng)t檢驗(yàn)與對照組差異有顯著性，P0.05，*表示經(jīng)t檢驗(yàn)與對照組差異有顯著性，P0.01(n=4) 表5  不同濃度殼寡糖對巨噬細(xì)胞TNF-基因轉(zhuǎn)錄水平的影響     注：以-actin為內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)，各組均值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；*表示經(jīng)t檢驗(yàn)與對照組差異有顯著性，P0.05(n=4)      結(jié)果顯示10g/ml的殼寡糖實(shí)驗(yàn)組與對照組比較無顯著性差異，20、30及40g/ml組均差異有顯著性，故確定20g/ml的殼寡糖為對IL-1和TNF

15、-的最適作用濃度，以40g/ml的殼寡糖作為對IL-18的最適作用濃度。        2.2.3  20g/ml的殼寡糖對IL-1和TNF-的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的影響用含20g/ml殼寡糖刺激培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞，用RT-PCR法檢測殼寡糖對IL-1和TNF-轉(zhuǎn)錄的水平的影響，用EISA法檢測殼寡糖對IL-1和TNF-分泌的影響（見表6、7、8、9）。        2.2.4  40g/ml殼寡糖對IL-18基因轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平的影響  用

16、含40g/ml殼寡糖的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)巨噬細(xì)胞，RT-PCR檢測對IL-18基因轉(zhuǎn)錄水平的影響ELISA法檢測對IL-18細(xì)胞因子分泌的影響（見表10、11）。 表6  20g/ml殼寡糖對IL-1基因轉(zhuǎn)錄水平的影響     注：以-actin為內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)，均值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；*表示經(jīng)t檢驗(yàn)與對照組差異有顯著性，P0.01 表7  20g/ml殼寡糖對巨噬細(xì)胞釋放IL-1的影響     注：均值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；*表示經(jīng)t檢驗(yàn)與對照組差異有顯著性，P0

17、.01 表8  20g/ml殼寡糖對TNF-基因轉(zhuǎn)錄水平的影響     注：以-actin為內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)；均值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；*表示經(jīng)t檢驗(yàn)與對照組差異有顯著性，P0.01 表9  20g/ml殼寡糖對巨噬細(xì)胞釋放TNF-的影響     注：均值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；*表示經(jīng)t檢驗(yàn)與對照組差異有顯著性，P0.01 表10  40g/ml殼寡糖對IL-18基因轉(zhuǎn)錄水平的影響     注：以-acti

18、n為內(nèi)參照標(biāo)準(zhǔn)，各組均值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；*表示經(jīng)t檢驗(yàn)與對照組差異有顯著性，P0.01 表11  40g/ml殼寡糖作用下IL-18 ELISA檢測結(jié)果     注：各組均值以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示；*表示經(jīng)t檢驗(yàn)與對照組差異有顯著性，P0.01      結(jié)合RT-PCR和ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果，可以看出殼寡糖能促進(jìn)巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子IL-1、TNF-和IL-18 基因表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-1、TNF-和IL-18。     &

19、#160;  3  討論        國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)殼寡糖具有多種優(yōu)異的生理功能，能提高機(jī)體的抗腫瘤能力和免疫功能13。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以殼六糖為主的殼寡糖具有良好的抑制腫瘤細(xì)胞生長和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。殼寡糖對S180肉瘤的抑制作用較環(huán)磷酰胺略弱，但兩者與對照組比較差異均有非常顯著性（P0.001)。殼寡糖對Lewis肺癌轉(zhuǎn)移的抑制作用較干擾素略強(qiáng)，轉(zhuǎn)移灶數(shù)分別為殼寡糖組（2.1±1.73）和干擾素組（2.8±1.39），兩組與對照組比較差異均有顯著性（P0.05)。  &

20、#160;     現(xiàn)代腫瘤免疫學(xué)研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞在抗腫瘤的免疫效應(yīng)中發(fā)揮著主要作用。巨噬細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中具有十分重要的地位，它屬于專職的抗原提呈細(xì)胞（APC），同時(shí)又是免疫效應(yīng)細(xì)胞，它通過吞噬提呈抗原、激活T淋巴細(xì)胞，并分泌和產(chǎn)生多種細(xì)胞因子、活性氧及一氧化氮（NO）等，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡及抑制蛋白質(zhì)合成等作用，是機(jī)體免疫應(yīng)答和免疫調(diào)節(jié)的重要環(huán)節(jié)4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示殼寡糖能促進(jìn)巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子IL-1、TNF-和IL-18基因的表達(dá)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-1、TNF-和IL-18。而這些細(xì)胞因子又可以反饋激活巨噬細(xì)胞和NK細(xì)胞，形成網(wǎng)絡(luò)狀的反饋調(diào)節(jié)關(guān)系，從而極大地增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能和抗腫瘤能力。        殼聚糖是自然界中第二大生物資源，其降解產(chǎn)物殼寡糖具有無毒、無免疫源性、良好的組織相容性和易溶于水、生物活性高等特點(diǎn)5，可開發(fā)成為一種新型的抗腫瘤藥物和免疫調(diào)節(jié)劑。 【參考文獻(xiàn)】     1  張虎，杜昱光，虞星炬.幾丁寡糖與殼寡