大鼠心肌頓抑時(shí)血漿及心肌組織中降鈣素基因相關(guān)肽含量的變化

1、    大鼠心肌頓抑時(shí)血漿及心肌組織中降鈣素 基因相關(guān)肽含量的變化        摘要目的：觀察大鼠心肌頓抑時(shí)降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）的變化規(guī)律。方法：采用大鼠在體心肌頓抑模型，用放射免疫分析法測(cè)定血漿及心肌組織中CGRP含量。結(jié)果：心肌頓抑時(shí)血漿CGRP水平較對(duì)照組顯著升高（P0.01），而心肌組織中CGRP含量則較對(duì)照組顯著降低（P0.05）。結(jié)論：心肌組織與血漿中的CGRP含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。主題詞心??； 降鈣素基因相關(guān)肽；大鼠中分類號(hào)R331.31文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)

2、碼A文章編號(hào)1000-4718(2000)01-0033-03 Changes of plasma and myocardial calcitonin gene-related peptide in myocardial stunning ratsWU Hong-chao, QIAN Xue-xian, LI Li-ping(Department of Cardiology, Zhujiang Hospital, First Military Medical University, Guangzhou 510282， China)Abstract AIM: To investigate cha

3、nges of calcitonin gene-related peptide(CGRP) in myocardial stunning rats. METHODS: Rat in vivo myocardial stunning model was used. CGRP content in plasma and myocardium were determined by radioimmunoassay. RESULTS: Plasma level of CGRP increased significantly (P0.01), but in left ventricular myocar

4、dium CGRP decreased obviously (P0.05) in myocardial stunning group compared with the control group. CONCLUSION: CGRP content in the left ventricular myocardium was negatively correlated with plasma CGRP.MeSH Myocardium; Calcitonin gene-related peptide; Rats心肌頓抑是指心肌短時(shí)間缺血后當(dāng)冠脈血流恢復(fù)正?；蚪咏r(shí)，心肌細(xì)胞未發(fā)生損害而心肌機(jī)

5、械功能發(fā)生一過性異常的狀態(tài)1。迄今為止，其確切的發(fā)生機(jī)理尚未闡明。降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin gene-related peptide, CGRP）是一種內(nèi)源性血管活性多肽，由37個(gè)氨基酸組成，具有強(qiáng)大的擴(kuò)張血管，尤其是擴(kuò)張冠脈血管、改善冠脈血流作用；對(duì)心臟具有正性變力作用24。有關(guān)心肌頓抑時(shí)體內(nèi)CGRP變化規(guī)律的研究目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道，因此作者設(shè)計(jì)了本實(shí)驗(yàn)。材料和方法一、動(dòng)物模型：采用大鼠在體心肌頓抑模型5。具體操作如下：以3戊巴比妥鈉（60 mg/kg,ip）將大鼠麻醉，氣管插管行人工呼吸。左側(cè)第四肋間開胸，剪開心包，暴露心臟及左室表面血管，以肺動(dòng)脈圓錐及左心耳交界處的左冠狀靜

6、脈的標(biāo)志，用3/8 Cr 3×6不銹鋼園針，30絲線穿過左心耳下緣的心肌淺層。穩(wěn)定15 min，如出現(xiàn)明顯心律失常或平均動(dòng)脈壓低于9.33 kPa持續(xù)5 min以上則棄之不用。對(duì)照組穿線但不收緊線，實(shí)驗(yàn)組將絲線兩端一起穿入1管徑2 mm的聚乙烯管中，穩(wěn)定5 min后抽緊絲線，將塑料管壓向冠狀動(dòng)脈并與絲線一并夾住，阻斷冠脈前降支血流，15 min后放松塑料管與絲線行再灌注2 h。二、心肌收縮功能測(cè)定：分離右側(cè)頸總動(dòng)脈，插入PE50管至左心室，導(dǎo)管末端接壓力傳感器，連接于生理記錄儀上，輸出LVP信號(hào)，經(jīng)A/D轉(zhuǎn)換輸入計(jì)算機(jī)記錄左心室壓力曲線，經(jīng)程序處理獲得左心室峰壓（LVP）、左心室壓力

7、最大上升與下降速率(±dp/dtmax)、心肌收縮成分速率最大值(Vpm)、零負(fù)荷時(shí)收縮成分最大速率(Vmax)、心肌收縮成分縮短速度(Vce)等心功能指標(biāo)。三、血清心肌酶含量測(cè)定：實(shí)驗(yàn)完畢取頸動(dòng)脈血，分離血清，用自動(dòng)生化分析儀（Beckman）測(cè)定血清中肌酸激酶(creatine kinase, CK)及乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase, LDH)含量，單位IU/L。四、組織學(xué)檢查：實(shí)驗(yàn)完畢，取缺血部位心肌作常規(guī)切片，HE染色，光鏡檢查，Olympus BH-2型倒置顯微鏡觀察照像；取缺血區(qū)中央部位心肌，修成1 mm×1 mm×1 mm小塊，

8、浸入2戊二醛0.1MPB（pH 7.4）內(nèi)，4 后固定過夜，常規(guī)脫水，Epon-812包埋，超薄切片，醋酸鉛鈾染色，JME1200EX型透射電鏡觀察、照像。五、血漿及心肌組織中CGRP含量測(cè)定：（一）樣品收集：1血漿：取血3mL，注入含10EDTA Na2 30 L和抑肽酶40 L的試管中，混勻，4 3?000 r/min離心10 min分離血漿，20保存待測(cè)。2心肌組織：取出心臟，吸去血跡，稱重。剪下100 mg左右的左室缺血區(qū)心肌盡快放入1mol/L HAC 1 mL略作研磨，然后在100 水中煮沸10 min，勻漿。4 3 000 r/min離心15 min，取上清于20保存。（二）測(cè)定

9、方法：采用非平衡法。具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行，試劑盒購(gòu)自北京東亞免疫技術(shù)研究所。六、統(tǒng)計(jì)處理:所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，用t檢驗(yàn)判定均數(shù)差異顯著性。結(jié)果實(shí)驗(yàn)過程中出現(xiàn)室性心動(dòng)過速或心室顫動(dòng)2 min、動(dòng)脈壓低于9.33 kPa、出血過多（2 mL以上）或缺血面積過小者（60 mg）棄之不用。一、心功能的變化：心肌缺血15min后心功能明顯減低，與對(duì)照組相比P0.01；再灌注后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，心功能有所恢復(fù)。但至再灌注2h時(shí)仍未達(dá)到對(duì)照組水平，其+dp/dtmax、-dp/dtmax、Vmax、LVSP、Vce和Vpm分別為對(duì)照組的68.81%、59.50%

10、、53.95%、74.96%、47.07%和63.31%（P值均0.01） 。實(shí)驗(yàn)組于再灌注后2 h,靜脈注射異丙基腎上腺素（0.3 mg/kg）能明顯改善心肌功能，使+dp/dtmax由380.05±61.58(kPa/s)增加至462.33 ±76.84(kPa/s)（P0.01）。二、心肌酶學(xué)及組織學(xué)檢查：心肌頓抑組血清CK和LDH分別為215.92±55.57和97.75±23.37(IU/L)，與對(duì)照組CK（198.42±49.89 IU/L）和LDH（91.67±17.23 IU/L）比較無明顯差異。光鏡下見頓抑心肌組織結(jié)

11、構(gòu)正常，心肌纖維排列整齊，未見壞死和出血點(diǎn)；電鏡下見細(xì)胞無明顯水腫，心肌肌原纖維、肌漿網(wǎng)結(jié)構(gòu)正常；核膜完整，染色質(zhì)核邊聚。部分線粒體腫脹，基質(zhì)明顯變淡，嵴排列紊亂，或部分嵴消失。三、血漿及心肌組織中CGRP水平的變化：實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見表1）顯示心肌頓抑時(shí)血漿CGRP水平顯著高于對(duì)照組（P0.01）；而心肌組織中CGRP含量（0.231±0.172 pmol/g）則顯著低于對(duì)照組(0.299±0.229 pmol/g)（P0.05）。相關(guān)分析表明，心肌組織CGRP含量與血漿中的CGRP水平呈顯著負(fù)相關(guān)（r-0.7952，P0.01）。表1大鼠心肌頓抑時(shí)血漿及心肌組織中CGRP的變

12、化Tab 1 Changes of CGRP levels in blood and myocardium in rats with myocardial stunning(±s，n=11)GroupBlood（pg/mL）Myocardium（pmol/g）Control227.3±181.10.299±0.229Myocardial stunning520.4±480.6*0.231±0.172*P0.05，*P0.01，vs control group 討論實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，大鼠冠脈結(jié)扎15 min再灌注2 h可引起心功能下降，而且即使恢復(fù)再

13、灌注，2 h內(nèi)心功能也不能完全恢復(fù)；注射異丙腎上腺素可顯著改善再灌注2h時(shí)的心肌功能。心肌酶學(xué)及組織學(xué)檢查證實(shí)，缺血心肌組織除線粒體輕度受損外，無不可逆心肌損害的證據(jù)。符合心肌頓抑條件，說明模型建立是成功的。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，心肌頓抑時(shí)血漿中CGRP水平明顯增高，而心肌組織中CGRP含量卻顯著少于對(duì)照組；血漿與心肌組織中CGRP含量之間呈顯著負(fù)相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)室研究還發(fā)現(xiàn)頓抑心肌組織中CGRP免疫反應(yīng)神經(jīng)纖維數(shù)量顯著減少6，因此作者推測(cè)可能由于缺血等刺激促使CGRP從外周神經(jīng)釋放，引起血漿CGRP濃度升高，而心肌組織中CGRP神經(jīng)末梢釋放CGRP增多，心肌組織CGRP含量降低。雖然心肌頓抑時(shí)血漿CGRP含

14、量明顯增高，但并未觀察到CGRP的心血管效應(yīng)。其原因可能是由于用免疫學(xué)方法檢測(cè)CGRP時(shí)，不能區(qū)分-CGRP和-CGRP；同時(shí)，抗體還可與CGRP的其它形式發(fā)生交叉反應(yīng)，如CGRP的前提，二聚體或其降解片段等。在大鼠實(shí)驗(yàn)中已證實(shí)7，血漿中的CGRP有兩個(gè)來源：外周神經(jīng)是其基本來源，甲狀腺C細(xì)胞可能是另一個(gè)來源。體內(nèi)CGRP主要分布于神經(jīng)系統(tǒng)，尤以脊髓中含量最高。心肌頓抑時(shí)檢測(cè)到的血漿CGRP升高可能主要來源于心血管以外的組織，其中可能還包含許多無活性形式；而且心肌組織本身CGRP含量減少，故不能觀察到CGRP有益的心血管效應(yīng)。有報(bào)道認(rèn)為，大鼠缺血/再灌注損傷時(shí)，血漿及心肌組織內(nèi)皮素1（ET-1

15、）含量明顯增加。增加的內(nèi)皮素可直接作用于心肌細(xì)胞，促進(jìn)鈣內(nèi)流和胞內(nèi)貯存鈣釋放，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載；抑制心肌能量代謝，誘發(fā)或加重細(xì)胞內(nèi)鈣超載；促進(jìn)心肌、血管平滑肌合成、釋放血管緊張素，而血管緊張素又可作用于血管或心內(nèi)膜的內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)ET mRNA表達(dá)，增加ET釋放；還可通過其血流動(dòng)力學(xué)和（或）細(xì)胞機(jī)制促進(jìn)組織細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷，而脂質(zhì)過氧化又促進(jìn)內(nèi)皮素的大量釋放，從而參與了心臟缺血/再灌注損傷的發(fā)病過程8。CGRP具有擴(kuò)張冠狀血管、改善心肌血流及正性肌力作用，抑制血管平滑肌細(xì)胞釋放ET-1，并可拮抗內(nèi)皮素的作用，對(duì)抗交感神經(jīng)興奮和RAAS激活所致的血管收縮效應(yīng)，故作者認(rèn)為心肌組織中CGRP含量減

16、少可能在心肌頓抑的發(fā)生中有一定作用。基金項(xiàng)目軍隊(duì)九五科研基金資助吳宏超（第一軍醫(yī)大學(xué)珠江醫(yī)院心內(nèi)科）錢學(xué)賢（第一軍醫(yī)大學(xué)珠江醫(yī)院心內(nèi)科）李立平（消化科，廣東 廣州 510282）參考文獻(xiàn)1Braunwald E, Kloner RA. The stunned myocardium: prolonged, post ischemic ventricular dysfunctionJ. Circulation, 1983,66（6）:11461149.2 Mulderry PK, Ghatei MA, Rodrigo J, et al. Calcitonin gene-related peptid

17、e in cardiovascular tissues of the ratJ. Neuroscience ,1985,41（3）:947954.3Lappe RW, Slivjak JA, Todt JA, et al. Hemodynamic effects of calcitonin gene-related peptide in conscious ratsJ. Regul Pept,1987,19:307312.4Saito A, Kimura S, Goto K. Calcitonin gene-related peptide as potential neurotransmitter in guinea-pig right atriumJ. Am J Physiol, 1986,250:H693H698.5陳金明，龔肖奇，陳思聰，等.大鼠可逆性心肌缺血后功能障礙致心肌頓抑的模型J.中國(guó)病理生理雜志，1996,12(2):223224.6吳宏超，錢學(xué)賢，劉宏