大黃素影響鈣敏感性調(diào)節(jié)機(jī)制的研究

1、    【摘要】  目的 研究大黃素對(duì)G蛋白耦聯(lián)的鈣敏感性調(diào)節(jié)影響的機(jī)制。方法 用酶解法分離大鼠胃平滑肌細(xì)胞，采用鈣鉗制技術(shù)控制平滑肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子水平。 用圖像分析系統(tǒng)測量平滑肌細(xì)胞長度。采用激光掃描共聚焦顯微鏡和免疫熒光技術(shù)分析RhoA在細(xì)胞內(nèi)的時(shí)空分布變化。結(jié)果 大黃素在平滑肌細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子水平固定時(shí)劑量依賴性收縮細(xì)胞。G蛋白降解產(chǎn)物GDP類似物GDPs劑量依賴性對(duì)抗大黃素收縮胃平滑肌細(xì)胞作用。 C3-transferase（RhoA抑制劑）抑制大黃素引起的細(xì)胞收縮，大黃素可引起RhoA膜移位。 結(jié)論 大黃素對(duì)G蛋白耦聯(lián)的鈣

2、敏感性調(diào)節(jié)有影響，并且是通過RhoA途徑。 【關(guān)鍵詞】  大黃素 胃平滑肌細(xì)胞 鈣敏感性    【Abstract】  Objective  It has been noted that emodin can influence calcium sensibitity but its precise mechanism remains unsolved.To investigate how emodin influence calcium sensibitity.Methods  Cells w

3、ere isolated from the muscle layers of Wistar rat stomach by enzymatic digestion. Intracellular free calcium ions level of smooth muscle cell was controlled by the technique of calcium claw cell length was measured by computerized image micrometry. RhoA distribution at rest state or after stimulatio

4、n was measured with immuoflurescence confocal microscopy.Conclusion  Emodin can influence calcium sensibitity by the approach of RhoA route.    【Key words】  emodim;gastric smooth muscle cell;calcium sensibility    目前的研究表明平滑肌細(xì)胞的收縮機(jī)制為：（1）Ca2+i的升高：鈣升高后，通過肌球蛋白輕鏈激酶

5、（MLCK）途徑磷酸化肌球蛋白輕鏈（MLC20）引發(fā)收縮。（2）鈣敏感性的升高：這一機(jī)制是通過抑制肌球蛋白輕鏈磷酸酶（MLCP）的活性來實(shí)現(xiàn)的1。鈣敏感性的增加使得在相同的Ca2+i濃度條件下，細(xì)胞可以產(chǎn)生更大的收縮力。調(diào)節(jié)鈣敏感性的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑被認(rèn)為是：激動(dòng)劑通過G蛋白耦聯(lián)受體激活RhoA（一種22-26-kDa的small GTPase），隨之激活其下游的激酶ROK（RhoA kinase），磷酸化MLCP的調(diào)節(jié)亞單位，從而抑制MLCP的活性抑制MLC20脫磷酸化2。    大黃（Rhubarb）是通里攻下中藥中的代表性藥物，具有明確增強(qiáng)腸道蠕動(dòng)的作用，被廣泛用于急腹癥

6、的治療中。大黃素是大黃的重要有效成分，為蒽醌類化合物，具有多種藥理作用。Cheng等人的研究發(fā)現(xiàn)大黃素通過升高Ca2+i促進(jìn)大鼠膈肌的收縮。林秀珍等研究表明大黃素可以促進(jìn)離體腸道平滑肌條的收縮，楊文修等證實(shí)大黃素可促進(jìn)細(xì)胞膜去極化，縮短膜電位振蕩周期，增加峰電位發(fā)放頻率，增加分節(jié)律收縮的幅值指數(shù)。    我們?cè)谥暗难芯恐幸炎C實(shí)大黃素對(duì)大鼠胃平滑肌細(xì)胞有收縮作用，并也證實(shí)能夠影響Ca2+i，但是否影響鈣敏感性尚未證實(shí)，本實(shí)驗(yàn)將初步解決這一問題。    1  材料與方法    1.1  實(shí)驗(yàn)材料和

7、儀器  健康成年Wistar大鼠（天津市醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供），清潔級(jí)，雌雄各半，鼠齡34個(gè)月，體重（205±25）g，Emodin、GDPs、GTPs、C3-transferase、-escin、DMEM（sigma）,一抗 mouse monoclonal anti-RhoA IgG（SANTA CRUZ）,二抗、抗體稀釋液、Triton-100、多聚甲醛（北京中山生物公司），余試劑均為國產(chǎn)分析純。Bio-rad Radiance2000型激光掃描共聚焦顯微鏡，超凈工作臺(tái)，細(xì)胞培養(yǎng)箱，Olympus倒置顯微鏡，Cmais2000圖像分析系統(tǒng)，Naro超純水系統(tǒng)

8、。    1.2  實(shí)驗(yàn)方法    1.2.1  胃平滑肌細(xì)胞的分離  大鼠禁食2天,脫頸處死, 無菌操作取胃, 生理鹽水徹底沖凈, 刮去黏膜，將肌肉組織剪成約12mm3體積大小，放于15ml含膠原酶型（0.1%的膠原酶）的DMEM消化液中，37振搖約30min，吸出上清液，置于冰浴離心管中備用。同等條件下再消化一次，收集二次上清液離心，用DMEM再洗一次。最后重新懸浮于含15%20%的胎牛血清和抗生素的DMEM培養(yǎng)液中。50目篩網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度。4%臺(tái)盼藍(lán)染色判斷細(xì)胞活力在95%

9、以上，細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，放入CO2孵箱培養(yǎng)。    1.2.2  可通透胃平滑肌細(xì)胞的制備  當(dāng)酶消化過程完成后,將消化液吸出,并用細(xì)胞質(zhì)緩沖液（mmol/L: NaCl 20,KCl 100,MgSO4 5,NaH2PO40.96,CaCl2 0.61,EGTA 1,2%BSA,pH 7.2）洗3次,洗液與消化液一起,1000r/min離心5min,棄上清,用2ml細(xì)胞質(zhì)緩沖液懸浮沉淀,并吹打成細(xì)胞懸液。細(xì)胞分散后,加入75g/ml的皂苷孵育4min,離心1000r/min 5min,沉淀重新懸浮于無皂苷含1.5mmol/L AT

10、P,5mmol/L磷酸肌酸,10U/ml肌酸磷酸激酶的細(xì)胞質(zhì)緩沖液中。    1.2.3  平滑肌細(xì)胞鈣鉗制技術(shù)  如上處理細(xì)胞后,根據(jù)Ca2+EGTA的平衡結(jié)合常數(shù)K進(jìn)行計(jì)算,將高濃度（10mmol/L）和具一定Ca2+濃度的溶液按一定比例混合,可獲得所需Ca2+濃度的溶液，將胞漿游離Ca2+濃度鉗制在某一要求的水平，這樣可以觀察不依賴胞漿游離Ca2+濃度的細(xì)胞活動(dòng)過程， 據(jù)國外文獻(xiàn)報(bào)道我們把Ca2+濃度鉗制在Pka=6.3這一最佳水平。 分四組：（1）大黃素；（2）大黃素+GDP類似物GDPs；（3）GDP類似物GDPs；（4）正

11、常對(duì)照組。各組均分5個(gè)濃度梯度，大黃素組為1、5、10、50、100mol/L；GDPs組為10、50、100、500、1000mol/L；大黃素+ GDPs組為前兩組濃度相應(yīng)一一配伍而成。    1.2.4  平滑肌細(xì)胞收縮的測定  取0.25ml細(xì)胞懸液，加入相應(yīng)濃度的實(shí)驗(yàn)試劑。30s后加入2.5%戊二醛終止反應(yīng)。對(duì)照組加入相同體積緩沖液，亦于30s后加入戊二醛終止反應(yīng)。應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)測定平滑肌細(xì)胞長度，隨機(jī)測定50個(gè)細(xì)胞的長度。平滑肌細(xì)胞的收縮反應(yīng)的計(jì)算公式為：收縮變化百分?jǐn)?shù)（用藥組平均長度對(duì)照組平均長度）對(duì)照組細(xì)胞平均長度&

12、#215;100。    1.2.5  免疫熒光共聚焦顯微鏡RhoA成像  收集按上述方法分散的細(xì)胞接種于六孔板中的蓋玻片上，培養(yǎng)基為含20胎牛血清的DMEM。用免疫熒光方法標(biāo)記：4%多聚甲醛固定10min，用PBS沖洗3次，每次5min；然后0.2%Triton-100作用10min，PBS沖洗3次，每次5min；一抗mouse monoclonal anti-RhoA IgG 37孵育1h，PBS沖洗3次，每次5min；二抗Goat anti-Rabbit IgG FITC孵育1h，PBS沖洗3次，每次5 min；緩沖甘油封片，Bio-Rad Radiance 2000激光共聚焦顯微鏡檢測，F(xiàn)ITC激發(fā)波長為488nm，發(fā)射波長為520nm?？瞻讓?duì)照組與第二抗體孵育。沿平滑肌細(xì)胞Z軸以0.4m間距行斷層掃描，收集各Z軸平面PKC分布信息。設(shè)定膜周邊區(qū)（peripheral）為細(xì)胞