等位基因特異性多重PCR快速檢測結(jié)核分枝桿菌喹諾酮耐藥性的初

1、基金項目:國家 十一五 重大傳染病防治科技重大專項基金資助項目(2008ZX100/03-010-02作者單位:421001 衡陽,南華大學(xué)病原生物研究所(夏強、劉劼;102206 北京,中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所/傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室(夏強、趙麗麗、劉志廣、萬康林(注:夏強、趙麗麗為共同第一作者通訊作者:萬康林,教授,博士生導(dǎo)師,電子信箱:wank angli ni c -dc .cn等位基因特異性多重PCR 快速檢測結(jié)核分枝桿菌喹諾酮耐藥性的初步研究夏 強 趙麗麗 劉志廣 劉 劼 萬康林摘 要 目的 建立等位基因特異性多重聚合酶鏈反應(yīng)(mu lti plex a lle

2、l e-spec ifi c PCR,MA S-PCR 技術(shù),以快速檢測結(jié)核分枝桿菌對喹諾酮的耐藥性。方法 根據(jù)結(jié)核分枝桿菌gyrA 基因序列,分別設(shè)計4條特異性寡聚核苷酸引物,優(yōu)化PCR 條件,建立針對gyr A 基因90和94位點突變進行檢測的M A S-PCR 技術(shù),對臨床分離菌株進行喹諾酮耐藥性檢測,同時以比例法和DNA 直接測序法做對照。結(jié)果 共對144株喹諾酮敏感株和56株喹諾酮耐藥株進行了M A S-PCR 檢測。M AS -PCR 與比例法比較,敏感性為53.57%(30/56;與DNA 測序比較,敏感性為71.43%(30/42,特異性均為100%(144/144。結(jié)論 MA

3、 S -PCR 技術(shù)檢測結(jié)核分枝桿菌對喹諾酮耐藥性簡便、快速、特異性高,但敏感性需進一步提高。關(guān)鍵詞 結(jié)核分枝桿菌 喹諾酮 耐藥 等位基因特異性多重聚合酶鏈反應(yīng)Prelim i nary St udy on Mu lti p l ex A llel e-specific PCR A ss ay for the D etection ofM ycobacteri u m Tuberculosis R es istance to Q ui noli nes D rug s . X i a Q iang,Zhao L ili ,Liu Zhi guang,Liu J ie ,W an K angli

4、n .Institution of Pathogenic B io logy,N anhua University,H unan 421001,ChinaAbstrac t O b jective T o develop and evaluate the mu lti p l ex a lle l e-spec ifi c PCR (M A S-PCR for rap i d detec tion o f M y cobacte -riu m tubercu l osis (M.tuberculosis resistannce to quino l one drug s .M ethods B

5、ased on the sequence o f gyr A gene in M.t uberculosis ,four pairs o f specific pri m ers w ere desi gned for detec ting t he mo st comm o m m utations at the condon 90and 94o f gyr A g ene .PCR cond-i ti ons we re opti m i zed .DNA direct sequenci ng and conven ti ona l propo rtion m ethods w ere u

6、sed to eva l uate the new m ethod .Resu lts 144stra i ns of qu i no li nes-res i stan t and 56stra i ns of qu i no li nes-sensiti ve c li n ica l M.tuberculosis stra i ns w ere detected by M AS-PCR.Co m-pared w ith results of t he propo rti on m ethod and DNA sequenc i ng ,t he sensiti v ity ofM A S

7、-PCR we re 53.57%(30/56,71.43%(30/42respectively ,wh ile t he specific it y we re all 100%.Conc l usion M AS -PCR coul d be used to detect M.t uberculo sis resistance t oqui no l ones drug s rapidl y .It i s a si m ple and spec ific m ethod ,bu t the sens i tiv it y needs to be i m proved .K ey word

8、 s M.tuberculosis ;Q u i no li nes ;D rug resi stance ;MA S-PCR近年來,耐多藥結(jié)核病(m ulti d rug -resistant t u -bercu l o sis ,MDR-TB及廣泛耐藥結(jié)核病(ex tensively drug-resistan t tubercu losis ,XDR-TB 的產(chǎn)生和傳播使得遏制結(jié)核病的流行成為結(jié)核病防治工作的最大難題和挑戰(zhàn)。目前,二線抗結(jié)核藥物如環(huán)丙沙星、氧氟沙星、左氧氟沙星、克林沙星等喹諾酮類藥物已用于各類耐藥結(jié)核病的治療,特別對一線藥物異煙肼和利福平不敏感的MDR -TB 有良好的

9、效果1。然而由于喹諾酮藥物投入臨床時間較長、抗菌范圍廣泛,耐藥形勢日趨嚴(yán)重,如果不能合理進行監(jiān)控后果不堪設(shè)想。早期檢測結(jié)核的耐藥性對治療具有指導(dǎo)性的作用,傳統(tǒng)的藥敏實驗需要長達48周的時間,遠不能滿足臨床的需要,建立對耐藥菌快速診斷的方法至關(guān)重要。本文旨在研究建立針對gyr A 基因90和94位點突變進行檢測的等位基因特異性多重PCR (m u lt-i plex allele-spec ific PCR,MAS -PCR 技術(shù),探討其作為二線抗結(jié)核藥喹諾酮類藥物的分子藥敏試驗方法的應(yīng)用價值。材料與方法1.菌株來源:結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H 37R v (ATCC 27294購自中國藥品生物制品

10、鑒定所,200株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株,包括144株喹諾酮敏感株和56株喹諾酮耐藥株,由中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所結(jié)核病室傳代培養(yǎng)、保藏。2.藥敏實驗:參照中國防癆協(xié)會制定的結(jié)核病診斷細菌 學(xué)檢驗規(guī)程2進行藥敏實驗。藥敏實驗采用比例法,含藥培養(yǎng)基內(nèi)藥物氧氟沙星的終濃度為2 g /m ,l 氧氟沙星購于S i g -m a 公司。3.分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株和臨床株DNA 的制備:采用CTAB 法3,生理鹽水收集結(jié)核分枝桿菌新鮮培養(yǎng)物50100m g(濕重,用溶菌酶,10%SD S /蛋白酶K 混合液及CTA B 破除細胞壁,去除蛋白,脂類等物質(zhì),然后用氯仿萃取,冰乙醇洗滌DNA 沉淀,最后用T

11、E 溶解DNA 沉淀,-20 保存。4.M A S-PCR 方法檢測gyr A 基因突變:(1引物設(shè)計及突變?yōu)辄c檢原理:根據(jù)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H 37R v 基因組中g(shù)y r A 基因的全序列(NC _000962設(shè)計4條引物,包括2條正向和2條反向引物,序列如下:gy raF 5 -TATGCGATGAGCGT-GAT -3 ;gy raR 5 -GA TATTGGTTGCCATG CC -3 ;gy raF 15 -ACCACCCGCACGGCCATG C-3 ;gyraR15 -GCCATGCG-C A CCAGGTTGT -3 。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。其中g(shù)y r

12、aF 1與gy raR 1的3 端分別正對90位GCG 、94位密碼子GAC 的第2個核苷酸。gyraF1末端堿基與正常DNA 相同,gyraR1末端堿基與正常DNA 互補,引物下劃線處為引入一個錯配堿基。根據(jù)PCR 原理,野生型菌可擴出478bp 、317bp 和210bp3條片段,而突變株相應(yīng)的條帶缺失(圖1。(2PCR 擴增:采用20 l 擴增體系,包括1 easy taq PCR Bu ffer (TRAN S ,1.25U easy taq DNA 聚合酶(TRAN S ,0 125mm o l/L dNTP ,g ryaF 、gyra R 各0.15 m ol/L,gy raF 1

13、、gy -raR 1分別為0.6 m o l/L 和0.25 mo l/L ,模板DNA 40100ng 。反應(yīng)條件為采用降落PCR,反應(yīng)條件:95 預(yù)變性5m i n ;95 30s ,5730s ,7240s ,5個循環(huán);9530s ,5530s ,7240s ,5個循環(huán);95 30s ,5330s ,7240s ,20個循環(huán),最后72 延伸3m i n 。擴增產(chǎn)物用4%瓊脂糖凝膠電泳120V,25m i n ,EB 染色,紫外燈下觀察結(jié)果(圖2。 圖1 MA S-PCR 檢測gyrA 基因90、94位點突變原理示意圖5.對gy r A 基因耐藥決定區(qū)測序:根據(jù)結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H 37R

14、 v 基因組中g(shù)y r A 基因的全序列設(shè)計1對引物,對gyrA 基因進行擴增,片段長度為858bp ,包含喹諾酮類藥物作用的DNA 旋轉(zhuǎn)酶主要區(qū)域(即gy r A 基因耐藥決定區(qū),測序。引物序列如下:上游引物為5 -T C GACTATGCGATGAGCGTG -3 ,下游引物為5 -CGATGCGTAAA CCGACCC-3 。PCR產(chǎn)物送圖2 M AS-PCR 檢測結(jié)核分枝桿菌90、94位點突變圖M.100bp DNA 相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.H 37Rv ;2.敏感株;3.90位點GCG GTG ;4.94位點GAC GGC;5.94位點GAC GCC;6.90+94位點GCG GTG

15、+GAC GGC北京擎科生物技術(shù)有限公司測序。結(jié) 果1.比例法檢測藥敏結(jié)果:200株結(jié)核分枝桿菌中喹諾酮類藥物氧氟沙星敏感株為144株,耐藥株為56株。2.測序結(jié)果:144株敏感菌株未發(fā)現(xiàn)基因突變。56株耐藥菌株中,gyr A 基因未發(fā)現(xiàn)突變的14株,42株發(fā)生基因突變,其中90位點GCG GTG 8株;91位點TCG CCG 7株;94點GAC AAC 1株、GAC TAC 3株、GAC CAC 1株;94位點GAC GGC 9株、GAC GCC 11株。另外發(fā)現(xiàn)2株雙位點突變,分別為90(GCG GTG +94(GAC GGC 位點和91(TCG CCG+94(GAC GCC 位點(表1。

16、3.MAS -PCR 檢測喹諾酮耐藥性結(jié)果:應(yīng)用MAS-PCR 檢測,144株喹諾酮敏感株顯示為陰性,56株耐藥菌中30株為陽性。與比例法比較,敏感性為53.57%;與DNA 測序比較,敏感性為71.43%,而特異性均為100%(表2。表1 56株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株gyr A 基因突變位點結(jié)果突變位點突變形式突變株數(shù)突變率(%90GCG GTG (A la Va l 814.491TCG CCG(S er Pro712.594GAC AAC (A s p A s n 1 1.894GAC TAC (Asp Tyr3 5.494GAC CAC (A s p H i s1 1.894GAC G

17、GC(Asp G l y915.894GAC GCC (Asp A l a1119.790+94GCG GTG (A la Va l 11.8GAC GGC(Asp G l y91+94TCG CCG (Ser Pro11.8GAC GCC (Asp A l a合計4275表2 M AS-PCR與測序、藥敏結(jié)果比較M AS-PCRgyr A基因測序喹諾酮藥敏突變未突變耐藥敏感陽性300300陰性1215826144合計4215856144討 論等位基因特異性多重PCR方法(MAS-PCR又稱擴增阻礙突變系統(tǒng)(a m plifi c ation refractory mu tation syst

18、e m,ARM S,常用于對已知突變基因進行檢測4。本實驗設(shè)計原理基于耐熱T aq DNA聚合酶缺乏3 5 外切酶校正活性的特點,設(shè)計兩條外引物和兩條內(nèi)引物,其中內(nèi)引物3 端末端位于待測突變位點。若此堿基對形成錯配,鏈延伸反應(yīng)就會因3 ,5 -磷酸二酯鍵形成障礙而受阻。為了提高MAS-PCR檢出率,避免發(fā)生錯誤延伸的現(xiàn)象,我們在引物gyraF1與gyr R1的3 端的倒數(shù)第3個堿基引入一個錯配堿基,使之與模板之間形成雙重錯配以阻止錯誤延伸5。優(yōu)化反應(yīng)條件時采用降落PCR。據(jù)研究報告DNA解旋酶是喹諾酮類藥物作用結(jié)核分枝桿菌的靶點6,7。該酶是一種與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄有關(guān)的 型拓撲異構(gòu)酶,編碼基因

19、為gy r A和gyrB。gyr A可以切斷DNA雙鏈,使松弛狀態(tài)的DNA 雙鏈進入負超螺旋狀態(tài),便于DNA進一步復(fù)制;gyrB 能夠水解ATP提供能量。喹諾酮類藥物的水解產(chǎn)物能與DNA解旋酶和DNA形成三聯(lián)復(fù)合物,干擾細菌DNA解旋酶與DNA雙鏈的結(jié)合,從而抑制DNA復(fù)制、修復(fù)、重組。目前認為,結(jié)核分枝桿菌對喹諾酮產(chǎn)生耐藥主要與gyr A基因發(fā)生突變有關(guān),75%94%的基因突變主要集中于一段長度為320bp保守序列上,即喹諾酮類藥物耐藥決定區(qū)(QRDR8,9。本實驗中我們設(shè)計的外引物作為實驗對照,內(nèi)引物旨在檢測gyr A基因90位點以及94位點突變。測序結(jié)果顯示,42株喹諾酮耐藥突變株中90

20、位點GCG CTG突變占19.0%;94位點GAC GGC突變占21.5%,GAC GCC突變占25.7%,這說明上述3種突變形式是gyr A基因突變的主要形式,這與Takiff、I gorM okr ousov等人的研究結(jié)果一致10,11。另外,經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)有兩株菌具有雙位點突變,我們對其中的90+94雙位點突變能夠成功檢測和判斷。由于91位點與90距離很近,在同一個體系中無法再設(shè)計91位點引物,因此91+94位點突變株我們僅僅能夠判斷為突變株,但結(jié)果顯示為單位點突變株。結(jié)合常規(guī)藥敏結(jié)果分析,MAS-PCR對喹諾酮敏感株的檢出率為100%(144/144,即特異性為100%;而對耐藥株的檢出率

21、為53.57%(30/56,即耐藥性檢測的敏感性為53.57%。測序結(jié)果顯示,26株MAS-PCR檢測陰性菌株中有12株發(fā)生突變不在我們實驗設(shè)計引物的覆蓋范圍內(nèi),其中91位點TCG CCG突變7株,94位點GAC AAC突變1株、GAC TAC突變3株,GAC CAC突變1株。另外發(fā)現(xiàn),耐藥株中75%(42/56發(fā)生突變,有14株耐藥菌并沒有發(fā)生突變,提示尚可能存在其他耐藥機制,如gyrB基因突變、膜通透性降低和藥物外排泵活化機制改變等,尚需進一步研究1214。利用結(jié)核分枝桿菌耐藥基因突變位點進行分子藥敏試驗在一線藥物如異煙肼kat G基因、利福平rpoB基因中已經(jīng)取得了良好的效果,不過在二線

22、抗結(jié)核藥物中應(yīng)用分子藥敏技術(shù)較少,主要原因是二線抗結(jié)核藥物耐藥機制比較復(fù)雜,耐藥相關(guān)基因突變并不是唯一的機制15,16。目前,分子藥敏試驗使用的技術(shù)主要有PCR-RFLP、PC R-SSCP等。PCR-RFLP方法由于所用的限制性內(nèi)切酶受諸多因素的影響,常常導(dǎo)致酶切反應(yīng)失敗,造成結(jié)果的誤判;PCR-SSCP法耗時、煩瑣、費用高以及實驗條件要求較高等因素影響了對耐藥基因的判斷。與上述兩種方法相比,本實驗MAS-PCR最大的優(yōu)勢在于快速、經(jīng)濟,不需要昂貴的儀器,利用普通PCR儀就能得到相對滿意的結(jié)果,這是其他方法不能比擬的。值得注意的是MAS-PCR檢出率依賴于反應(yīng)條件的優(yōu)化和防止引物與靶DNA錯

23、配時可能發(fā)生的錯配延伸。因此在前期試驗中必須選擇無3 5 外切酶活性的Taq酶,并且需要對Taq酶用量、d NTP濃度,退火溫度等多方面進行優(yōu)化。本實驗在設(shè)計引物中僅覆蓋了最為常見的90位點GCG GTG和94位點GAC GGC、GAC GGC3種突變形式,對于未覆蓋的位點可以進行二次MAS-PCR,以達到更好的效果。參考文獻1 Berning S E.The role of fluoroqu i nol ones i n tubercu l osis today.D rugs,2001,61(1:9-182 中國防癆協(xié)會基礎(chǔ)專業(yè)委員會.結(jié)核病診斷實驗室檢驗規(guī)程.北京:中國教育文化出版社,20

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34、紅門診糖尿病個體化營養(yǎng)干預(yù)實施的后續(xù)研究王 露 高 鍵 唐 紅 金鳳妹摘 要 目的 了解營養(yǎng)干預(yù)間斷對2型糖尿病患者糖尿病相關(guān)知識、態(tài)度、行為、血糖和并發(fā)癥的影響,為構(gòu)建有效而且長期堅持的營養(yǎng)干預(yù)模式提供理論依據(jù)。方法 比較120例2型糖尿病患者干預(yù)間斷前后知識-態(tài)度-行為問卷評分,血糖和并發(fā)癥的變化。結(jié)果 個體化營養(yǎng)干預(yù)治療間斷1年后,患者的糖尿病相關(guān)營養(yǎng)知識評分、學(xué)習(xí)態(tài)度評分、行為改變評分、3項總評分較門診營養(yǎng)干預(yù)間斷前均顯著下降(P <0.001;空腹血糖、餐后2h 血糖、糖化血紅蛋白等指標(biāo)均較干預(yù)后顯著上升(P <0.05。餐后2h 血糖和糖化血紅蛋白上升與知識評分下降和總

35、評分下降的相關(guān)系數(shù)有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.05,糖尿病并發(fā)癥明顯增加(P <0.05。結(jié)論 對糖尿病患者的營養(yǎng)干預(yù)必須長期堅持,營養(yǎng)師應(yīng)該通過各種手段提高隨訪依從性,不斷強化對患者飲食和生活方式的干預(yù)。只有這樣才能真正實現(xiàn)血糖的長期有效控制,預(yù)防糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生。關(guān)鍵詞 2型糖尿病 個體化 營養(yǎng)干預(yù) 血糖 知識-態(tài)度-行為/K -A -PSequential Research on the Practi ce o f I nd i v i duati on Nutriti on Interv ention on D iabetes Outpati ents . W ang Lu ,Gao J i an ,T ang H ong,J inFengm ei .D epart m