白塞病患者口腔潰瘍處血鏈球菌dna檢測結(jié)果分析

1、白塞病患者口腔潰瘍處血鏈球菌dna檢測結(jié)果分析摘要 目的:檢測白塞病患者口腔潰瘍組織標(biāo)本內(nèi)是否存在血鏈球菌dna。方法: 8例白塞病患者, 8例阿弗他潰瘍患者和5例正?？谇徽衬φ者M(jìn)入本研究。采用原位巢式多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測口腔潰 瘍標(biāo)本是否存在血鏈球菌dna。采用限制性片段長度多態(tài)性分析對擴(kuò)增片段進(jìn)行特異性確證。本研 究還對15例白塞病血標(biāo)本進(jìn)行了巢式多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測。采用四格表資料的確切概率法進(jìn)行統(tǒng)計 學(xué)分析。結(jié)果: 8例白塞病患者口腔潰瘍標(biāo)本中, 5例患者血鏈球菌dna的表達(dá)陽性。8例阿弗他潰瘍 患者口腔潰瘍標(biāo)本中, 2例陽性。5例正常人口腔粘膜全部陰性。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析:白塞病組與阿弗他潰

2、 瘍組有統(tǒng)計學(xué)差異( p = 010343) ;白塞病組與正常對照組有顯著統(tǒng)計學(xué)差異( p 0101) 。15例白塞病 血標(biāo)本全部陰性。結(jié)論:白塞病患者口腔潰瘍中存在血鏈球菌dna,提示血鏈球菌慢性感染可能與白 塞病發(fā)病相關(guān)。 關(guān)鍵詞 白塞病; 血鏈球菌; 感染; 原位巢式多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 白塞病是一種以細(xì)小血管炎為病理基礎(chǔ)的全 身性疾病。典型表現(xiàn)是由復(fù)發(fā)性口腔潰瘍、陰部 潰瘍和眼色素膜炎組成三聯(lián)征。口、皮膚、生殖 器、關(guān)節(jié)和眼為常見發(fā)病部位。心血管系統(tǒng)、神經(jīng) 系統(tǒng)和消化系統(tǒng)等亦可受累。其病因仍不清楚。 關(guān)于感染是否是白塞病的誘發(fā)因素一直受到許多 學(xué)者的密切關(guān)注。早在1920年gilbert就提

3、出了 細(xì)菌感染學(xué)說。國內(nèi)研究發(fā)現(xiàn),部分白塞病患者 的發(fā)病可能與結(jié)核菌慢性感染有關(guān),給予抗結(jié)核 治療后,部分患者病情可顯著改善。日本學(xué)者提 出血鏈球菌 1 - 2 ;白塞病患者的皮損內(nèi)可見血鏈 球菌抗原和血鏈球菌dna 3 - 4 ;白塞病患者的嗜 中性細(xì)胞對血鏈球菌抗原的趨化移動增強(qiáng) 5 。 其它國家的研究也提示本病與血鏈球菌感染有 關(guān) 6 。國內(nèi)尚未見到關(guān)于白塞病患者的口腔潰 瘍內(nèi)是否有血鏈球菌感染的報告。本研究采用原 位巢式多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng),檢測了口腔潰瘍標(biāo)本內(nèi) 血鏈球菌dna的表達(dá)?，F(xiàn)報道如下: 1材料方法 1. 1研究對象共有8 例白塞病患者(診斷符 合國際協(xié)作組白塞病診斷標(biāo)準(zhǔn) 7 )進(jìn)

4、入本研究, 阿弗它口炎患者8例,均為多次復(fù)發(fā)的病例;正常 人口腔粘膜對照5例,為口腔頜面外科外傷手術(shù) 為保證良好縫合切下的粘膜組織。所有患者都給 與激素和/或美滿霉素治療,并根據(jù)病情給與相應(yīng) 治療。本研究獲得我院倫理委員會同意,取材在 獲得患者同意后進(jìn)行。標(biāo)本經(jīng)常規(guī)福爾馬林固定 后,制成石蠟標(biāo)本,保存?zhèn)溆谩?1. 2原位巢式pcr方法 3 載玻片經(jīng)apes處 理; 12 m 切片常規(guī)脫蠟; 0. 2 mol /l hcl處理 10 min; 10g/ml蛋白酶k 37消化20 min,蒸 餾水洗;滅活殘存的蛋白酶。原位巢式多聚酶鏈 式反應(yīng)在一個25l 的小室內(nèi)進(jìn)行( takara, 日 本生產(chǎn)

5、) 。采用英國thermo hybaid原位pcr儀。 血鏈球菌原位巢式pcr 反應(yīng)體系含有: 10 mm tris /hcl, 50 mm kcl, 315 mm mgcl2 , 200 mm dntp, 15 mm d ig - 標(biāo)記的dutp, 1 單位taq多 聚酶( takara, 日本生產(chǎn)和25 pmol引物。反應(yīng) 條件是:第一次變性溫度為80 10 min,繼而為 變性95 1 min,退火55 3 min和延伸72 for 3 min。20個循環(huán)。隨后一個循環(huán)是變性95 1 min,退火55 3 min和延伸72 10 min。引物 序列為( forward / reverse

6、 ) : 外引物5- taata2 accctgaccaagccta - 3 , 5 - ccctttcaaaagtcataaatc - 3( 999 bp ) 和 內(nèi)引物5- agctatggactgaagaaa - 3, 5 - aagctgctggagattggt - 3( 276 bp ) 。反 應(yīng)結(jié)束后,采用地高辛顯色試劑盒(roche diag2 nostics,德國)進(jìn)行顯色。 113限制性片段長度多態(tài)性分析 酶切反應(yīng)體系總體積為20l,其中含10l 的pcr 產(chǎn)物,加無菌雙蒸水至17 l, 2 l ( 10 ) 酶解緩沖液然, pst - i內(nèi)切酶用量為10個單 位,在37條件

7、下反應(yīng)6小時。瓊脂糖凝膠電泳 后,在紫外線檢測儀上拍照,并記錄結(jié)果。 114統(tǒng)計學(xué)分析方法 采用四格表資料的確切概率法進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分 析。 2結(jié)果 經(jīng)原位巢式多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測,本研究發(fā) 現(xiàn)8例白塞病患者口腔潰瘍標(biāo)本中,血鏈球菌 dna的表達(dá)為5例陽性, 3例陰性。8例阿弗他 潰瘍患者口腔潰瘍標(biāo)本中, 2 例陽性。5 例正常 人口腔粘膜對照標(biāo)本全部陰性。白塞病組與正 常對照組有顯著統(tǒng)計學(xué)差異( p 0101) 。陽性 白塞病患者結(jié)果見圖1;陽性阿弗他潰瘍患者代 表結(jié)果見圖2;正常人對照結(jié)果見圖3。經(jīng)四格 表資料的確切概率法進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析: 白塞病 組與阿弗他潰瘍組有統(tǒng)計學(xué)差異( p = 0103

8、43) 。 同時,本研究還對15 例白塞病患者的血標(biāo)本來 源dna內(nèi)有無血鏈球菌dna 的表達(dá)進(jìn)行了檢 測。結(jié)果15例白塞病患者全部陰性。另外,本 研究還對陽性結(jié)果進(jìn)行了限制性片段長度多態(tài) 性分析,對擴(kuò)增片段進(jìn)行了特異性確證。結(jié)果 見圖4。限制性片段長度多態(tài)性分析實(shí)驗(yàn)證實(shí) 擴(kuò)增是特異擴(kuò)增。 308 southern china journal of dermato2venereology,december 2008. vol. 15, no. 6 圖1白塞病患者口腔潰瘍標(biāo)本原位pcr結(jié)果 圖2阿弗他潰瘍患者口腔潰瘍標(biāo)本原位pcr結(jié)果 圖3正常人口腔粘膜對照結(jié)果 圖4限制性片段長度多態(tài)性分析 3

9、討論 關(guān)于感染和自身免疫病的關(guān)系,一直是基礎(chǔ) 免疫和臨床免疫研究的熱點(diǎn)。關(guān)于白塞病的病因 目前認(rèn)為是一些具有特殊遺傳傾向的個體,對致 病性和導(dǎo)致感染能力較弱病原血鏈球菌的超強(qiáng)免 疫反應(yīng)所致。本研究發(fā)現(xiàn)8例白塞病患者口腔潰 瘍標(biāo)本中, 5例血鏈球菌dna 的表達(dá)陽性。8例 阿弗他潰瘍患者口腔潰瘍標(biāo)本中, 2例陽性。5例 正常人口腔粘膜全部陰性。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析:白塞 病組與阿弗他潰瘍組有統(tǒng)計學(xué)差異;白塞病組與 正常對照組有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。這一結(jié)果與日本 學(xué)者isogai 和tojo 等人的研究結(jié)果是一致 的 2 - 3 。他們研究發(fā)現(xiàn)白塞病患者口腔內(nèi)存在有 特殊類型血鏈球菌和皮損內(nèi)有血鏈球菌dna的

10、 表達(dá)。因此,本研究結(jié)果支持了日本學(xué)者提出的 觀點(diǎn):血鏈球菌感染可能與白塞病的發(fā)病相關(guān)。 進(jìn)一步研究血鏈球菌感染與白塞病患者體內(nèi)免疫 學(xué)異常的關(guān)系,將有利于揭開白塞病發(fā)病的機(jī)制。 本研究的缺陷在于:開始設(shè)計實(shí)驗(yàn)時,沒有切取患 者非潰瘍部位粘膜標(biāo)本進(jìn)行實(shí)驗(yàn),以進(jìn)一步明確 血鏈球菌dna在粘膜非潰瘍部位是否陽性。補(bǔ) 充實(shí)驗(yàn)檢測發(fā)現(xiàn)1例非潰瘍處血鏈球菌dna 表 達(dá)陰性, 1例非發(fā)病期白塞病患者正?？谇徽衬?血鏈球菌dna表達(dá)陰性。 參考文獻(xiàn) 1 yokota k, hayashi s, araki y, et al. characterization of streptococcus sanguis isolated from patients with behcets diseasej . microbiol immunol 1995, 39 (9) : 729 - 732. 2 isogai e, ohno s, kotake s, et al. chemiluminescence of neutrophils from patientswith behcets dis