氣管內注入脂多糖法建立大鼠慢性支氣管炎模型

1、    氣管內注入脂多糖法建立大鼠慢性支氣管炎模型        氣管內注入脂多糖法建立大鼠慢性支氣管炎模型                     組別動物數(shù)氣管壁厚度(m)腺體厚度/氣管壁厚度對照組7359±500.04±0.03模型組7521±

2、25*0.41±0.04*注：與對照組比較?P<0.01，*P<0.001表2模型組與對照組纖毛超微結構改變的比較(±s)組別動物數(shù)纖毛數(shù)(根)(根/6.5 m)纖毛長度(m)纖毛直徑(m)腫脹纖毛(%)對照組7573.33±0.110.200±0.0102(7%)模型組7321.84±0.15*0.330±0.030*8(25%)注：與對照組比較?P<0.001，*P<0.01 表3模型組與對照組BALF白細胞計數(shù)及分類比較(±s)組別動物數(shù)白細胞計數(shù)(108/L)細胞分類(%)AMNLM對照組71

3、.42±0.2061±46.1±0.915.53±2.9115.35±1.70模型組78.07±1.90?39±439.5±6.46.87±2.1014.74±2.24注：AM：肺泡巨噬細胞，N：中性粒細胞，L：淋巴細胞，M：單核細胞；與對照組比較?P<0.001，P<0.001，P<0.001 慢性支氣管炎(慢支)是呼吸系統(tǒng)常見病,其防治研究已受到國內外普遍重視。為探索一種簡便可靠的制作慢支動物模型的方法，我們參考Li等1在1996年歐洲呼吸協(xié)會年會上報告的氣管內注入脂多糖(

4、LPS)，以觀察杯狀細胞轉化的方法并加以改進，摸索制作大鼠慢性支氣管炎和阻塞性肺氣腫模型。材料與方法大鼠慢支模型的制備：雄性SD大鼠14只(軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供)，體重190250 g，鼠齡12周，隨機分為：（1）慢支模型組（模型組，7只）：用1戊巴比妥納（50 mg/kg）腹腔注射麻醉，仰臥位固定于操作臺，暴露聲門，以靜脈套管針代替氣管導管，拔除針芯，快速插入氣管，將LPS（美國Sigma公司)200 g注入氣管內,飼養(yǎng)3周；（2）健康對照組（對照組，7只）：不做任何干預，為空白對照，飼養(yǎng)3周。支氣管肺泡灌洗液（BALF）細胞計數(shù)及分類：兩組大鼠均用1戊巴比妥納50 mg/kg腹腔

5、注射麻醉，仰臥固定，暴露氣管，在環(huán)甲軟骨處剪一“V”形小口，將靜脈套管針套管插入左主支氣管；用10 ml Hank液分2次灌洗，總回收率為50%80。灌洗液離心，細胞用Hank液洗滌后，用血細胞計數(shù)板做細胞計數(shù)。余液制成細胞片（每片80 l），瑞氏染色行細胞分類計數(shù)。病理標本的制作：棄左肺，取1 cm×1 cm×1 cm右中葉肺組織連同部分支氣管和氣管留作電鏡標本（日本JEM1200EM電鏡），余右肺作光鏡標本（Olympus光學顯微鏡）。氣管壁厚度及腺體厚度與氣管壁厚度比值的測量：氣管組織切片置于10倍物鏡下，標尺為每小格10 m， 測量5個氣管環(huán)，取平均值。纖毛超微結構

6、的觀察：應用真彩色醫(yī)學像分析系統(tǒng)（空軍總醫(yī)院，北京航空航天大學提供）對兩組氣管纖毛電鏡底片（×10 000倍）做像分析，計算纖毛數(shù)量、長度、直徑和腫脹纖毛所占的百分率。統(tǒng)計學:用SAS軟件行t檢驗。結果（1）模型組大鼠的臨床表現(xiàn):出現(xiàn)倦怠，毛發(fā)失去光澤，進食、飲水減少，體重增長較對照組顯著減慢第21天各為（18±7）g及（66±19）g，P<0.05。（2）模型組氣管、支氣管及肺組織病理表現(xiàn):肉眼見肺組織呈灰白色，膨脹狀態(tài)，表面無出血，無液體滲出。光鏡下見氣管、支氣管纖毛柱狀上皮細胞部分剝脫，粘液腺肥大，分泌旺盛，漿液腺發(fā)生粘液化（1），杯狀細胞增生（2），

7、粘膜層、粘膜下層及肌層淋巴細胞、漿細胞、單核細胞及少量的中性粒細胞浸潤，支氣管平滑肌增厚（3），管腔及纖毛導管內充滿大量中性粒細胞、肺泡巨噬細胞及粘液（4）、肺泡擴張（5），肺間質及肺泡內無蛋白水腫液和出血。電鏡下見氣管粘膜上皮細胞變性，線粒體腫脹，內質網(wǎng)部分擴張成囊狀，纖毛減少、脫落、變短或融合為復合纖毛，纖毛表面水皰形成，部分末梢微管變性、濃縮、吸收（6），杯狀細胞胞漿內充滿粘液顆粒，氣管上皮細胞連接間隙增寬，粘膜下層可見浸潤的淋巴細胞、漿細胞、單核細胞和少量的中性粒細胞（7，8）。模型組氣管壁較對照組顯著增厚，腺體厚度/氣管壁厚度的比值顯著增加（表1）。模型組氣管纖毛數(shù)量較對照組減少、顯

8、著變短、增粗，腫脹纖毛顯著增多（表2）。（3）BALF白細胞計數(shù)及分類：模型組BALF白細胞總數(shù)及中性粒細胞數(shù)較對照組顯著增高，肺泡巨噬細胞所占構成比顯著降低（表3）。討論大鼠慢支模型的制備方法有10余種，最常用的是SO2氣體刺激法2，所需設備及操作較復雜，耗時費力。文獻報道的模型組病理改變主要為氣管粘膜層和粘膜下層炎細胞浸潤及杯狀細胞增生，很難復制出腺體增生的形態(tài)學改變。多數(shù)作者認為這主要是因大鼠、小鼠和豚鼠的氣管和支氣管腺體不發(fā)達之故3。LPS是革蘭陰性菌細胞壁的最外層結構，系類脂質、多糖及蛋白質的復合物，即所謂的內毒素。它可刺激單核細胞、內皮細胞及中性粒細胞等合成釋放一系列炎性介質，介導

9、多種組織、細胞的損傷。我們參照Li等1的方法，以氣管內注入LPS誘發(fā)氣管支氣管炎癥和損傷，模擬慢性支氣管炎，以期建立大鼠慢性支氣管炎模型。已知氣管內注入LPS可制備大鼠急性肺損傷（ALI）或成人型呼吸窘迫綜合征（ARDS）的模型，但所用LPS濃度很高（500 g/200 l），須引起內毒素血癥后方可出現(xiàn)ALI或ARDS改變4。我們刻意摸索注入LPS的劑量，發(fā)現(xiàn)200 g/200 l的較小劑量最為恰當，可制備出大鼠慢支模型而又不致引起ALI。操作上采用靜脈套管針作氣管插管，其長度、管徑及質地適宜，易插入氣管且不損傷氣道粘膜。模型的氣道壁、氣道腔及肺組織表現(xiàn)出典型的人類慢支及肺氣腫的病理改變。BA

10、LF白細胞總數(shù)及中性粒細胞所占比例顯著增高，也與文獻報道的慢支BALF所見相符。我們首次在國內采用氣管內注入脂多糖法，初步建立了大鼠慢支模型。這一制備方法較簡便，省時省力，費用較低廉，更適于慢性支氣管炎的實驗研究。作者單位：100037 北京，解放軍第三四醫(yī)院呼吸科參考文獻：1Li D, Godfrey R, Rogers AV, et al. Endotoxin-induced airway intro-epithelial neutrophilia, goblet cell hyperplasia and metaplasia in the rat: a light and electro

11、n microscopic study. Eur Respir J, 1996,9:424.2Shore S, Kobzik L, Long NC, et al. Increased airway responsiveness to inhaled methacholine in a rat model of chronic bronchitis. Am J Respir Crit Care Med, 1995,151:1931.3施新猷. 醫(yī)學動物實驗方法. 第1版，北京:人民衛(wèi)生出版社 ,1980.223.4O'leary EC , Marder P, Zuckerman SH.

12、Glucocorticoid effects in an endotoxin-induced rat pulmonary inflammation model : differential effects on neutrophil influx, integrin expression, and inflammatory mediators. Am J Respir Cell Mol Biol, 1996, 15: 97.收稿:1998-12-05修回:1999-02-07本文編輯:戎建琴1慢支炎大鼠組氣管組織切片、粘膜下腺體增生，分泌旺盛HE×2002慢支炎組大鼠氣管組織切片，杯狀細胞增生HE×4003慢支炎組大鼠肺組織切片支氣管平滑肌增厚HE×2004慢支炎組大鼠氣管組織切片，纖毛導管內充滿大量中性粒細胞及粘液HE