包埋PLGA微球殼聚糖支架的構(gòu)建及其對(duì)蛋白釋放的調(diào)節(jié)

1、藥學(xué)學(xué)報(bào)ActaPharmaceuticaSinica2006,41(6):493-497493研究論文包埋PLGA微球殼聚糖支架的構(gòu)建及其對(duì)蛋白釋放的調(diào)節(jié)韓鋼1,2,陳海靚,孫曉譯,高建青,梁文權(quán)11113(1.浙江大學(xué)藥物制劑研究所,浙江杭州310031;2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院邵逸夫醫(yī)院,浙江杭州310016)摘要:目的制備能緩慢釋放蛋白類藥物的細(xì)胞生長支架。方法采用冷凍干燥制備殼聚糖支架,測定支架的孔隙率和吸水率。以牛血清白蛋白(BSA)為模型藥物,制備乳酸2羥乙醇酸共聚物(PLGA)微球,并包埋于殼聚糖支架中,用掃描電鏡觀察微球和支架的形態(tài),考察藥物在各種支架上的體外釋放。結(jié)果殼聚糖支架為

2、多孔結(jié)構(gòu),當(dāng)預(yù)凍溫度為-70時(shí),支架的孔隙率和吸水率分別為7816%±115%和8511%±612%。PLGA微球能夠較均勻地覆在殼聚糖支架上。單用殼聚糖支架,BSA在24h累積釋放達(dá)90%以上,制成PLGA微球后,再包埋于殼聚糖支架中,則藥物釋放明顯緩慢,168h的累積釋放量為3315%。通過改變殼聚糖的用量和PLGA材料的型號(hào),可以調(diào)控藥物在復(fù)合支架上的釋放。結(jié)論包埋PLGA放。關(guān)鍵詞:支架;殼聚糖;PLGA微球;牛血清白蛋白;中圖分類號(hào):R943.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A:-)-0493-05Preparatichitosanscaffoldsencapsulatinginl

3、oadedinPLGAmicrospheresHANGang,CHENHai2liang,SUNXiao2yi,GAOJian2qing,LIANGWen2quan(1.InstituteofPharmaceutics,ZhejiangUniversity,Hangzhou310031,China;2.AffiliatedSirRunRunShawHospital,MedicalCollege,ZhejiangUniversity,Hangzhou310016,China)1,211113Abstract:AimTopreparecellsscaffoldswiththecharacteris

4、ticsofsustainedreleaseofproteins.MethodsChitosanscaffoldswaspreparedbyfreeze2drying.Porosityandwatercontentofscaffoldsweredetermined.Bovineserumalbum(BSA)wasselectedasamodelprotein.Poly(lactic2co2glycolicacid)(PLGA)microsphereswerepreparedbydoubleemulsionsolventevaporationandencapsulatedintochitosan

5、scaffolds.ThemorphologyofPLGAmicrospheresandvariousscaffoldswereobservedusingscanningelectronmicroscope.ReleasebehaviorofBSAfromvariouschitosanscaffoldswasinvestigated.ResultsThechitosanscaffoldrepresentsporous.Atthe-70ofquenchingtemperature,theporosityandwatercontentofchitosanscaffoldswere7816%

6、7;115%and8511%±612%,respectively.PLGAmicrospherescanbeuniformlyencapsulatedintoscaffoldswithoutanymorphologychange.SignificantsustainedreleaseofBSAfromPLGAmicrospheresencapsulatedintoscaffoldswasobtained.Thecumulativereleaseat168hwasonly3315%,whilethatofBSAfromchitosanscaffoldsat24hwasabove90%.

7、ThereleasebehaviorcanbecontrolledbyadjustingtheamountofchitosaninscaffoldsandthetypeofPLGA.ConclusionThenovelchitosanscaffoldsencapsulatingPLGAmicrospheresprovedtobeapromisingcellsscaffoldswithcontrollingthereleaseofgrowthfactorsintissueengineering.Keywords:scaffold;chitosan;PLGAmicrosphere;BSA;invi

8、trorelease收稿日期:2005209219.基金項(xiàng)目:國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(30171113).3通訊作者Tel/Fax:86-571-87217376,E2mail:wqliang494藥學(xué)學(xué)報(bào)ActaPharmaceuticaSinica2006,41(6):493-497組織工程的核心要素包括種子細(xì)胞、細(xì)胞支架和生長因子。其中,細(xì)胞支架的功能是為細(xì)胞的增殖提供三維空間和新陳代謝的環(huán)境,并決定新生組織、器官的形狀和大小。生長因子則誘導(dǎo)和刺激細(xì)1胞增殖、維持細(xì)胞存活和促進(jìn)組織的再生。殼聚糖(chitosan)是一種可生物降解、生物相容性好的陽離子多聚糖,與細(xì)胞具有很好的親和性,已

9、廣泛用作2細(xì)胞支架材料。然而,由于生長因子在人體內(nèi)的半衰期大約為數(shù)秒至數(shù)分鐘,很容易失去活性,單獨(dú)應(yīng)用殼聚糖支架材料時(shí),生長因子釋放較快,難以達(dá)到預(yù)期的生理效應(yīng),反而有可能表現(xiàn)出其全身性的3作用。因此,實(shí)現(xiàn)生長因子在細(xì)胞支架中的可控制釋放是組織工程成功的關(guān)鍵之一。乳酸2羥乙醇酸共聚物(PLGA)是一種能逐步降解而無毒性的高分子材料,已成功應(yīng)用于蛋白類藥4物的緩釋載體。由于目前應(yīng)用于組織工程的生長因子種類繁多,但本質(zhì)都是多肽蛋白質(zhì)。因此,本文以牛血清白蛋白(BSA)作為模型,制成PLGA微球后包埋于殼聚糖中,形成復(fù)合細(xì)胞支架,算其平均值。載藥率精密稱取3種PLGA微球各10mg,加-1乙腈1mL

10、,渦旋溶解,離心(12000rmin,10min),棄去上清液,再加乙腈1mL,重復(fù)上述操作。沉淀物真空干燥過夜,次日用pH714的PBS溶液1mL提取,離心后收集上清液。殘余物加入011-1molLNaOH溶液1mL水解,振搖過夜。收集上-1清液(d3),用011molLHCl水溶液1mL中和。合并所有上清液,用微量法于570nm處測定BSA6含量,計(jì)算載藥率。殼聚糖支架的制備及其表征7支架的制備用1%醋酸溶液配成濃度為1%的殼聚糖溶液,取該溶液013mL,置24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,分別于-20,-70和液氮(-196)條件下預(yù)凍過夜后,冷凍干燥24h,用80%乙醇固化,再次冷凍干燥,。8a,2

11、4h,用濾紙吸干表面的Wb,計(jì)算不同預(yù)凍溫度的支架吸水率,X(%)=(Wb-Wa)/Wa×100%?？紫堵视门乓悍y定多孔支架的孔隙率。在10mL量瓶中裝入乙醇,精密稱取烘干至衡重的各種支架(W1),抽真空至不再有氣泡溢出。精密稱定含有酒精和殼聚糖支架的量瓶(W2),再將含有乙醇的支架取出,精密稱定剩余乙醇和量瓶(W3),則孔隙率為P(%)=(W2-W3-W1)/(W2-W3)×100%。9材料與方法儀器與設(shè)備FJ200高速分散均質(zhì)機(jī)(上海標(biāo)本模型廠);LGJO52II型冷凍干燥機(jī)(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)儀器廠);XL2302ESEM掃描電鏡(飛利浦公司);Elx2800型酶標(biāo)儀(B

12、IOTEC)藥品與試劑牛血清白蛋白(BSA,華美生物工程公司);PLGA(山東醫(yī)療器械研究所);殼聚糖(Mr450,脫乙酰度90%,青島海盈生物科技有限公司);BSA測定試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)。其余均為分析純。PLGA微球的制備及其性質(zhì)5微球的制備稱取BSA30mg溶于水200L中,作為內(nèi)水相;另稱取PLGA(PLAPGA=5050,Mr=6000)330mg溶于二氯甲烷4mL中作為油相,探頭超聲,充分乳化后加入1%PVA溶液-140mL,以8000rmin的轉(zhuǎn)速乳化3min,減壓旋轉(zhuǎn)除去有機(jī)溶劑,離心后用蒸餾水洗滌3次,收集微球,冷凍干燥,即得。另取PLGA(PLAPGA=505

13、0,Mr=10000)和PLGA(PLAPGA=7030,Mr=50000),同法制備。含BSA和PLGA微球的殼聚糖支架的制備用1%殼聚糖醋酸溶液配制質(zhì)量濃度為1mg-1mL的BSA溶液,取該溶液013mL加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,以-70預(yù)凍,按上述方法制備,即得含BSA的殼聚糖支架。另根據(jù)各種PLGA微球的載藥率,稱取含相同BSA量的微球,置24孔板中,加1%殼聚糖溶液013mL,攪拌均勻,同法制備,即得包埋PLGA微球的殼聚糖支架。形態(tài)學(xué)用掃描電鏡觀察PLGA微球、空白殼聚糖支架和包埋PLGA微球的殼聚糖支架的形態(tài)。體外釋放研究精密稱取一定量PLGA(PLAPGA=5050,Mr=600

14、0)微球、含BSA的殼聚糖支架以及包埋不同PLGA微球的殼聚糖支架(BSA的量均為013mg),以pH714的PBS1mL作為釋放介質(zhì),加入0101%疊氮化鈉作防腐劑。于37恒-1溫振蕩(100rmin),每隔一定時(shí)間取出部分上清液,并補(bǔ)充定量的釋放介質(zhì),用BCA法測定BSA粒徑光鏡下隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)微球的粒徑,計(jì)韓鋼等:包埋PLGA微球殼聚糖支架的構(gòu)建及其對(duì)蛋白釋放的調(diào)節(jié)495含量,計(jì)算累積釋放率。結(jié)果1PLGA微球的粒徑和載藥率以3種PLGA(PLAPGA=5050,Mr=6000;PLAPGA=5050,Mr=10000;PLAPGA=7030,Mr=50000)為材料制備的BSA微球的

15、載藥率分別為7185%,7190%和7149%;粒徑分別為(5145±0136)m,(4139±0145)m和(4144±0147)m。2殼聚糖支架的性質(zhì)表1是預(yù)凍溫度對(duì)殼聚糖支架的孔隙率和吸水率的影響。當(dāng)預(yù)冷凍溫度為-20和-70時(shí),支架的孔隙率和吸水率相接近,而當(dāng)冷凍溫度進(jìn)一步降為-196時(shí),孔隙率和吸水率明顯下降。Table1Effectofquenchingtemperature(Tq)ontheporosityandwatercontentofchitosanscaffoldspreparedbyfreeze2dryingTq/Figure1Thesca

16、nningelectronmicrographsofPLGAmicrospheres.Scalebar:10mPorosity/%7811±12785±3Water%64±43-20-70-196n=3,x ±s.P133P<0101vs-20groupFigure2Thescanningelectronmicrographsofporouschitosanscaffolds.Scalebar:200m3支架的形態(tài)圖1和圖2分別是掃描電鏡下觀察到的含BSA的PLGA微球和殼聚糖支架。由圖可見,PLGA微球呈圓形,表面光滑,不粘連,大小較均勻。用冷凍

17、干燥法制得的殼聚糖支架具有多孔的結(jié)構(gòu),孔徑大多在100m左右。圖3是在制備殼聚糖支架時(shí),加入PLGA微球,再冷凍干燥后的掃描電鏡?？梢?PLGA微球能夠較均勻的覆在殼聚糖支架上(圖3A),微球的形態(tài)未發(fā)生變化(圖3B)。4體外釋放圖4是BSA從殼聚糖支架、PLGA微球和包埋PLGA微球的殼聚糖支架上的釋放曲線。從圖中可以看出,單獨(dú)采用殼聚糖支架,藥物釋放較快,24h釋放即達(dá)90%以上。PLGA微球能顯著延緩藥物的釋放,因此,包埋于殼聚糖支架后藥物也呈緩慢釋放,168h的累積釋放量為3315%±019%。圖5是制備支架的殼聚糖用量對(duì)包裹相同PLGAFigure3Thescanninge

18、lectronmicrographsofPLGAmicrospheresencapsulatedintochitosanscaffolds.ArrowsindicatesPLGAmicrospheres.A:Scalebar50m;B:Scalebar10m496藥學(xué)學(xué)報(bào)ActaPharmaceuticaSinica2006,41(6):493-4972013%和1415%,至168h的累積釋放量分別為3315%和3312%。表明支架的用量對(duì)釋放曲線的前期影響較顯著,而后期差別不大。當(dāng)支架一定時(shí),采用不同PLGA材料包埋微球的殼聚糖支架對(duì)BSA的釋放曲線見圖6。由此可見,與普通PLGA蛋白微球

19、的釋放情況一致,包埋微球的殼聚糖支架隨PLGA相對(duì)分子質(zhì)量的增大釋放減慢,當(dāng)共聚物PLAPGA=7030時(shí),釋放進(jìn)一步減緩。Figure4InvitroreleaseprofilesofBSAfromchitosanscaffolds,PLGA(PLAPGA=5050,Mr=6000)microspheresandPLGAmicrospheresencapsulatedintochitosanscaffolds(n=3)討論作為組織工程中的細(xì)胞支架生物材料,不僅應(yīng)具有良好的生物相容性、生物可降解性和可塑性,而且為了使細(xì)胞更好地在支架材料上貼壁和生長,要求支架材料具有三維立體結(jié)構(gòu),即材料必須是多

20、孔的,類似海綿狀,。這樣一10。采用冷,預(yù)凍溫度對(duì)支架的,這是因?yàn)榻Y(jié)晶過程分兩個(gè)階段:即成核階段和晶核生長階段,過冷會(huì)引起較高的成核速率和較低的晶體生長速率,因而會(huì)有很多的小冰晶生成。所以,預(yù)凍溫度越低,凍干材料孔越小,孔壁越薄。當(dāng)預(yù)凍溫度為-20時(shí),所需預(yù)凍時(shí)間較長,因此,后文研究均采用-70作為預(yù)凍溫度。通過細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)表明:本法制得的殼聚糖支架沒有毒性,人原代肝細(xì)胞可以在支架表面和內(nèi)部正常生長和增殖,而且支架易于修飾(另文發(fā)表)。組織工程是一個(gè)周期較長的過程。一般原代細(xì)胞在支架上的貼壁生長需要數(shù)周,有時(shí)更長。為了促進(jìn)細(xì)胞的生長和組織的再生,在支架中需要加入具有誘導(dǎo)和刺激細(xì)胞增殖、維持細(xì)胞

21、存活等生物效11應(yīng)的蛋白類物質(zhì),即生長因子。若單獨(dú)將生長因子混入殼聚糖支架,則相當(dāng)于形成骨架型的藥物釋放體系。由于支架中殼聚糖的分子鏈段之間具有相當(dāng)大的孔隙率和吸水性,使得蛋白類藥物很容易通過支架中和外周水環(huán)境中形成的濃度梯度差釋放出來,從而失去活性,不利于細(xì)胞在支架上的正常生長和繁殖。為解決以上問題,本實(shí)驗(yàn)以BSA為模型蛋白,首先將其制成PLGA微球,以達(dá)到緩慢釋放和保護(hù)的目的,然后進(jìn)一步包裹于殼聚糖支架中。通過掃描電鏡圖可以證實(shí)已成功的構(gòu)建了包埋PLGA微球的殼聚糖復(fù)合多孔支架,PLGA微球能夠較均勻地Figure5InvitroreleaseprofilesofBSAfromPLGA(P

22、LAPGA=5050,Mr=6000)microspheres2scaffoldspreparedbydifferentamountofchitosan(n=3)Figure6InvitroreleaseprofilesofBSAfrommicrospheres2scaffoldspreparedbydifferentPLGAtypes(n=3)微球的BSA釋放影響。當(dāng)制備支架的殼聚糖溶液用量為013和016mL時(shí),24h的累積釋放量分別為韓鋼等:包埋PLGA微球殼聚糖支架的構(gòu)建及其對(duì)蛋白釋放的調(diào)節(jié)497分布在支架中,復(fù)合支架保持原來殼聚糖支架的多孔性和PLGA微球的形態(tài)。釋放實(shí)驗(yàn)表明:與單用

23、殼聚糖支架相比,包埋微球的復(fù)合支架能夠顯著地減緩藥物的釋放。進(jìn)一步研究表明:通過改變支架的用量和PLGA的材料的性質(zhì),可以獲得具有不同釋藥速率的釋放曲線。因此,本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的包埋微球的殼聚糖復(fù)合多孔支架有望在相當(dāng)長的時(shí)間內(nèi)保持生長因子的生物效應(yīng),而且通過對(duì)復(fù)合支架材料的調(diào)節(jié),可以實(shí)現(xiàn)對(duì)生長因子的控制釋放。References1TabataY.TheimportanceofdrugdeliverysystemsintissueengineeringJ.PharmSciTechnolToday,2000,3:80-89.2DhimanHK,RayAR,PandaAK.Characterization

24、andevaluationofchitosanmatrixforinvitrogrowthofMCF27breastcancercelllinesJ.Biomaterials,2004,25:5147-5154.3HollandTA,MikosAG.AdvancesindrugdeliveryforarticularcartilageJ.JControlRelease,2003,86:9.4YeoY,ParkK.ControlofinitialburstinJ.ArchPharmRes,1-5ZhengCH,LYuHY.Preparationofalginate2678910chitosan2poly(lactic2co2glycolicacid)compositemicrosphereanditsregulation