氫氧化鋁類化合物在制備治療微生物持續(xù)性感染藥物中的用途發(fā)明專利

1、氫氧化鋁類化合物在制備治療微生物持續(xù)性感染藥物中的用途發(fā)明專利 PAGE3 氫氧化鋁類化合物在制備治療微生物繼續(xù)性感染藥物中的用途 技術(shù)領(lǐng)域 本發(fā)明屬化學(xué)藥物領(lǐng)域，涉及氫氧化鋁Al(OH)3類化合物的新的藥用用途，具體涉及氫氧化鋁類化合物在制備治療微生物繼續(xù)性感染藥物中的用途。尤其涉及氫氧化鋁類化合物在制備治療慢性乙型肝炎藥物中的用途。? 背景材料? 據(jù)研究報(bào)道，乙型肝炎病毒(HBV)可引起人類慢性乙型肝炎(慢性乙肝)，其中部分可發(fā)展為肝硬化，甚至肝癌。迄今，用于治療慢性乙肝的藥物中的一大類為針對(duì)HBV聚合酶的核苷(酸)類藥物，如Lamivudine，Entecavir，Telbivudine

2、及Adefovir等，其作用為抑制HBV核酸的復(fù)制。這類藥物必須長(zhǎng)期服用，停藥后常發(fā)生病毒血癥，并可出現(xiàn)耐藥毒株；另一類治療藥物為免疫調(diào)節(jié)劑，如已上市的干擾素，分別為一般干擾素(IFN)與長(zhǎng)效干擾素(Peg-IFN)。這類制品一方面通過(guò)誘生細(xì)胞產(chǎn)生的多種抗病毒蛋白，如2-5A合成酶等阻止病毒蛋白的合成而起抗病毒作用；另一方面也具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用，如可加強(qiáng)巨噬細(xì)胞的作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞表面MHC類分子的表達(dá)，以及調(diào)節(jié)T細(xì)胞的功能等。干擾素的作用沒(méi)有針對(duì)某種病毒的特異性，但有種屬特異性，但干擾素在乙肝治療中存在的主要問(wèn)題是可出現(xiàn)骨髓抑制如白細(xì)胞下降等副作用。而且，施行顯示，僅有約30的乙肝患者對(duì)干擾

3、素治療有應(yīng)答，即使長(zhǎng)效干擾素也必須要每周注射一次，價(jià)格昂貴。但是應(yīng)用干擾素后停止治療的反跳率較藥物治療為低。以上兩種治療的費(fèi)用均較高。? 氫氧化鋁類化合物(統(tǒng)稱為Alum)是一類有三價(jià)鋁的鹽類，最早1926年用于破傷風(fēng)類毒素疫苗作為佐劑，以后則用于小兒麻痹滅活疫苗(Salk疫苗)，至今已作為甲肝、乙肝疫苗等許多微生物疫苗中不可缺少的佐劑，此作用表現(xiàn)為可以加入后用更少量的微生物抗原，從Alum的歷史來(lái)看，作為人用疫苗的佐劑，其有激活人體的B細(xì)胞提升抗體效果的作用以及有安全性。關(guān)于Alum作為佐劑促進(jìn)抗體產(chǎn)生的機(jī)制已在近年有較多研究，最早是由于Alum與抗原蛋白結(jié)合可以在局部沉積并延長(zhǎng)汲取抗原的時(shí)

4、間，發(fā)展為加入Alum后可以激活B細(xì)胞母細(xì)胞化，而進(jìn)一步延伸至Alum本身可激活免疫應(yīng)答，近來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)，注射Alum，一天后可有免疫炎癥細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、炎性單核細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞即可聚集在局部，Alum可以作用于人的外周血單核細(xì)胞，上調(diào)MHC-II類分子，CD40與CD83。在小鼠腹腔內(nèi)注入Alum后，DC和B細(xì)胞即可內(nèi)吞抗原，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Alum可以促進(jìn)活化caspase-1與IL-1B。而且即使沒(méi)有發(fā)生佐劑作用，Alum介導(dǎo)的IL-1B分泌是通過(guò)Nlrp3炎癥抗體(inflammasome)所實(shí)現(xiàn)的。由于發(fā)現(xiàn)抗體的產(chǎn)生必須要Th細(xì)胞介導(dǎo)，對(duì)不同Th細(xì)胞的分析發(fā)現(xiàn)，Alum主要作用于T

5、h2類細(xì)胞應(yīng)答，然而與正常小鼠不同，在IL-4(Th2類細(xì)胞銀子)、IL-4R及STAT6缺陷鼠中，Alum雖然可以產(chǎn)生低滴度的IgG1，但是，小鼠還可產(chǎn)生高效價(jià)的Th1類抗體(IgG2a)。反映Alum誘生的Th2類型應(yīng)答抑制了Th1類因子的應(yīng)答，然而另有報(bào)道認(rèn)為在體內(nèi)活化炎癥體和Th2的免疫應(yīng)答并不與Alum的佐劑作用及對(duì)T、B細(xì)胞的應(yīng)答是直接相關(guān)的。此外，關(guān)于Alum可通過(guò)尿酸激活及募集炎癥性的DC也是一種機(jī)制。最近，施揚(yáng)等發(fā)現(xiàn)Alum只與DC作用，直接通過(guò)細(xì)胞表面脂類的活化可促使DC攝入抗原，而且通?過(guò)細(xì)胞間粘附分子(ICAM)和淋巴細(xì)胞功能相關(guān)的抗原(Lymphocyte?funct

6、ion-associated?antigen-1，LFA-1)，可作用于CD4+細(xì)胞，并認(rèn)為這一功能過(guò)程可發(fā)生于DC表面，針對(duì)多種的固相結(jié)構(gòu)(如Alum晶體)而起作用。? 雖然Alum作為佐劑的作用機(jī)制在小鼠中及體外做了大量實(shí)驗(yàn)研究，但迄今均未見(jiàn)有關(guān)進(jìn)行人體臨床試驗(yàn)研究的報(bào)道，更未有探究Alum單獨(dú)治療繼續(xù)性感染的作用。? 發(fā)明內(nèi)容 本發(fā)明的目的是提供氫氧化鋁Al(OH)3(統(tǒng)稱為Alum)類化合物的新的藥用用途，尤其是Alum作為單獨(dú)成分在制備治療微生物繼續(xù)性感染藥物中的用途。特別是Alum作為單獨(dú)唯一成分在制備治療慢性乙型肝炎藥物中的用途。? 本發(fā)明的氫氧化鋁類化合物Al(OH)3統(tǒng)稱為A

7、lum及其衍生物(含三價(jià)鋁成分)，其各類制品廣泛用于多種疫苗的佐劑。? 本發(fā)明以復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)分子病毒學(xué)實(shí)驗(yàn)室早在2004年開(kāi)展的乙克(抗原抗體復(fù)合物型治療性乙肝疫苗)免疫人體臨床研究中采納的Alum(KAISO4)硫酸鉀鋁制劑作為對(duì)照并據(jù)此構(gòu)成了本發(fā)明。? 本發(fā)明利用長(zhǎng)期以來(lái)作為免疫佐劑使用的氫氧化鋁類化合物作為單獨(dú)唯一成分在正常小鼠及乙肝表面抗原(HBsAg)轉(zhuǎn)基因鼠中試驗(yàn)，進(jìn)行Grl+細(xì)胞分布及HBsAg水平分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，重復(fù)注射氫氧化鋁可使Grl+細(xì)胞進(jìn)入脾臟以及可以使鼠血清中HBsAg水平下降；在慢性乙型肝炎患者中多次注射氫氧化鋁可致患者血清HBeAg由陽(yáng)性轉(zhuǎn)為陰性，并

8、出現(xiàn)抗HBeAg?的抗體，及血清乙肝病毒DNA下降，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，所述的氫氧化鋁類化合物作為單獨(dú)唯一成分有治療乙肝患者的效果。? 本發(fā)明中，采納Alum及其衍生物作為單獨(dú)唯一成分進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，? 用正常鼠兩次腹腔內(nèi)注射Alum(KAISO4)(已公開(kāi)作用于重組乙肝疫苗的佐劑)，觀察Grl+細(xì)胞在脾內(nèi)分布；? Alum腹腔注射HBsAg陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因鼠(品系#59)，采納ELISA檢測(cè)方法對(duì)Alum免疫鼠進(jìn)行血清HBsAg水平的測(cè)定；? 選取臨床試驗(yàn)對(duì)象：慢性乙肝患者分別為6次與12次(每次間隔四周)Alum肌注；注射12次方案中，首個(gè)6次注射后停止一個(gè)月，再同樣注射第二6次；本發(fā)明中，參照乙肝免疫

9、治療的常用技術(shù)，無(wú)論6次與12次方案，注射后均隨訪24周；? 注射Alum后進(jìn)行療效檢測(cè)：包括血清HBeAg定量，抗HBe測(cè)定，血清HBV?DNA定量以及HBsAg定量檢測(cè)。? 本發(fā)明中，用于注射Alum后的療效檢測(cè)試劑等，包括血清HBeAg定量(Abbott試劑)，抗HBe測(cè)定(Abbott試劑)，血清HBV?DNA定量(PCR法定量技術(shù))，HBsAg定量(Abbott試劑)均為市售認(rèn)可的商品。? 本發(fā)明經(jīng)上述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，多次注射Alum后，9-18慢性乙肝患者發(fā)生e抗原血清轉(zhuǎn)換，63出現(xiàn)HBeAg陰轉(zhuǎn)，同時(shí)伴有血清HBVDNA下降，與未通過(guò)注射Alum治療的HBeAg自然

10、轉(zhuǎn)換率5-8比較，說(shuō)明本發(fā)明采納Alum及其衍生物作為單獨(dú)唯一成分能抑制微生物繼續(xù)性感染。? 本發(fā)明的氫氧化鋁可進(jìn)一步修飾改造以提升療效，或用于其它有病毒抗原血癥的繼續(xù)性感染疾病，以及與其它藥物聯(lián)合后用于實(shí)驗(yàn)及臨床研究。? 進(jìn)一步本發(fā)明的Alum及其衍生物作為單獨(dú)唯一成分能制備治療慢性乙型肝炎藥物。? 該Alum及其衍生物作為單獨(dú)唯一成分制備的藥物，治療慢性乙肝患者分別為6次與12次(每次間隔四周)Alum肌注；注射12次方案中，首個(gè)6次注射后停止一個(gè)月，再同樣注射第二6次，注射后均隨訪24周。? 本發(fā)明的Alum及其衍生物作為單獨(dú)唯一成分制備的藥物，可用于治療不同類型的慢性乙肝患者；尤其適用

11、于HBeAg陽(yáng)性的慢性乙肝患者。? 為了便于理解，以下將通過(guò)具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的進(jìn)行具體地描述。必須要特別指出的是，具體實(shí)例僅是為了說(shuō)明，顯然本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員可以依據(jù)本文說(shuō)明，在本發(fā)明的范圍內(nèi)對(duì)本發(fā)明做出各種各樣的修正和改變，這些修正和改變也納進(jìn)本發(fā)明的范圍內(nèi)。? 具體實(shí)施方式 實(shí)施例1正常小鼠注射Alum兩次后Grl+細(xì)胞在脾內(nèi)的數(shù)目比較? 兩組C57/B1小鼠每組10只，將0.25ul?Alum(KAISO4)懸浮于250ul生理鹽水內(nèi)，或僅用生理鹽水250ul分別腹腔注射，4周后再注射1次，6天后殺鼠取脾。用熒光標(biāo)記的Grl抗體進(jìn)行兩組脾細(xì)胞染色，同時(shí)用CD11b熒光抗體染色，用流

12、式細(xì)胞儀檢測(cè)CD11b/Grl+雙陽(yáng)性細(xì)胞及Grl+細(xì)胞數(shù)，同時(shí)用抗CD3抗體染色作為對(duì)照，表1是C57/B1小鼠注射Alum兩次后脾內(nèi)Grl+細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果。? 結(jié)果證實(shí)經(jīng)上述Alum免疫的C57/BL鼠中脾臟中Grl+與CD11/Grl雙陽(yáng)性的細(xì)胞數(shù)增多，而CD3+細(xì)胞無(wú)變化。? 實(shí)施例2Alum免疫HBsAg陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因鼠(#59)后對(duì)HBsAg水平的影響? 24只HBsAg陽(yáng)性鼠隨機(jī)分為3組，A組注射鹽水，B組注射Alum，C組用HBsAg-抗HBs不加Alum。各組均腹腔內(nèi)注射，共注射兩次，劑量同實(shí)例1，間隔期為4周。三組均以WHO的HBsAg標(biāo)準(zhǔn)品，用科華試劑來(lái)定量檢測(cè)。表2是Alum免疫HBsAg陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因鼠后HBsAg水平結(jié)果。? 結(jié)果顯示，單獨(dú)注射Alum兩針后，HBsAg有下降，但單獨(dú)注射鹽水或不加Alum的抗原抗體復(fù)合物，均無(wú)降低HBsAg的作用，說(shuō)明Alum有一定作用，而HBs?Ag-抗HBs必須有Alum加入方可發(fā)揮作用。? 實(shí)施例3對(duì)比多次注射Alum后在乙肝患者中的特異性免疫應(yīng)答? 對(duì)78名與130名HBs?Ag/HBeAg雙陽(yáng)性，且抗-HBs、抗-HBe均為陰性的慢性乙肝患者分別給予6劑與12劑的Alum，每次注射間隔1個(gè)月。其中注射12劑分為兩個(gè)