RNA干擾在眼底疾病中的新進(jìn)展

1、RNA干擾在眼底疾病中的新進(jìn)展         11-03-04 14:34:00     作者：孟博，雷寧玉    編輯：studa20【摘要】  RNA干擾（RNAi）發(fā)現(xiàn)，改變了人們對細(xì)胞基因調(diào)控的傳統(tǒng)理解。這種技術(shù)具有傳統(tǒng)治療方法無可比擬的優(yōu)勢和潛力，因此近些年來越來越受全世界眼科醫(yī)師的重視。目前，雖然在臨床應(yīng)用中還存在不少問題，但是RNAi必將為眼科疾病的治療帶來新的前景。我們就RNAi在眼底方面的研究進(jìn)行綜述。 【

2、關(guān)鍵詞】  RNA干擾；眼底?。换虺聊琒tudy on RNA interference technology in fundus diseases    Bo Meng, NingYu Lei    Foundation item:Program of Department of Education in Shandong Province, China(No.J05L12)    Department of Ophthalmology, the Affiliated Hospital of

3、 Binzhou Medical College, Binzhou 256603, Shandong Province, ChinaAbstractThe discovery of RNA interference(RNAi)has changed people's traditional concepts of the gene.This technique posseses advantages and potentials that traditional therapies can not compare especially in terms of its specifici

4、ty and efficiency,and it is drawing more and more attentions from ophthalmologists all over the world these year. Although there are still a lot of problems in clinical use at present,various kinds of related experimental results make us firmly believe that RNAi will surely bring a new epoch for cur

5、ing diseases in ophthalmology.This article provides an overview on some of the latest advances in fundus.    KEYWORDS: RNA interference; fundus diseases; gene silencing0引言        RNA干擾（RNA Interference,RNAi）是指mRNA降解所引起的轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默（Posttranscriptional

6、Gene Silencing,PTGS）1。這種技術(shù)的應(yīng)用為體內(nèi)和體外基因表達(dá)的抑制提供了新的方法1。盡管siRNAs和反義寡核苷酸都是通過WastonCrick堿基互補(bǔ)配對原理和目標(biāo)mRNA結(jié)合2,3，但是相比之下，siRNAs具有更強(qiáng)的優(yōu)勢和潛力4，可能為眼底方面疾病的治療帶來新的前景。我們就RNAi在眼底方面的研究進(jìn)行綜述。    1RNA干擾技術(shù)    1.1RNAi的發(fā)現(xiàn) 1995年，康乃爾大學(xué)的Su Guo博士在試圖阻斷秀麗新小桿線蟲（C.elegans）的par1基因時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)意想不到的現(xiàn)象。她們本想利用反

7、義RNA技術(shù)特異性地阻斷上述基因的表達(dá)，而同時(shí)在對照實(shí)驗(yàn)中給線蟲注射正義RNA以期觀察到基因表達(dá)的增強(qiáng)，但得到的結(jié)果是二者都同樣地切斷了par1基因的表達(dá)途徑5。這是與傳統(tǒng)上對反義RNA技術(shù)的解釋正好相反。1998年， Fire和Mello通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，正義RNA抑制基因表達(dá)的現(xiàn)象及過去的反義RNA技術(shù)對基因表達(dá)的阻斷，都是由于體外轉(zhuǎn)錄所得RNA中污染了微量雙鏈RNA（dsRNA）1,6而引起。他們將單鏈RNA純化后注射線蟲時(shí)，基因抑制效應(yīng)變得十分微弱，而經(jīng)過純化的雙鏈RNA卻正好相反69。他們將這種現(xiàn)象稱作RNAi1。1999年，人們發(fā)現(xiàn)RNA干擾現(xiàn)象廣泛存在于幾乎所有的真核生物中細(xì)胞。20

8、00年，Hammond和Zamore提出了RNAi作用機(jī)制模型3,10。2001年，人們利用RNAi技術(shù)成功誘導(dǎo)出培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因沉默現(xiàn)象11。2006年，美國科學(xué)家Fire和Mello1214發(fā)現(xiàn)了RNAi1，獲得了諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。    1.2RNAi的作用機(jī)制 RNAi的作用機(jī)制尚不十分清楚，目前普遍認(rèn)為RNAi很可能都是通過dsRNA的介導(dǎo)而特異地降解靶mRNA，抑制相應(yīng)基因的表達(dá)，屬于PTGS6。現(xiàn)已初步闡明dsRNA介導(dǎo)的同源性靶mRNA降解過程主要分為兩步：（1）一種稱為Dicer的RNase樣核酸酶在ATP參與下把dsRNA1

9、,6切割加工成長2123nt的由正義和反義鏈組成的小干擾RNA（small interfering RNA,siRNAs）1517。（2）siRNAs在ATP參與下被RNA解旋酶解旋成單鏈，并由其中反義鏈指導(dǎo)形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RNAinduced silencing complex,RISC）18,19。RISC在單鏈siRNAs引導(dǎo)下識別互補(bǔ)的mRNA20，并在RISC中的核酸內(nèi)切酶作用下從siRNAs引導(dǎo)鏈中心所對應(yīng)的靶基因位置切割靶mRNA18,21,22。    1.3RNAi的重要特征    1.3.1轉(zhuǎn)錄后水平的

10、基因沉默 DNA能夠在細(xì)胞核中被穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄，但由dsRNA介導(dǎo)形成的RISC18特異地降解靶mRNA，使細(xì)胞質(zhì)里無相應(yīng)的mRNA存在,抑制了相應(yīng)基因的表達(dá)，導(dǎo)致了轉(zhuǎn)錄后水平的基因沉默。    1.3.2高特異性 dsRNA特異地抑制干擾RNA同源序列的靶基因表達(dá)，而對不相關(guān)序列的表達(dá)無干擾作用，這是由siRNAs的反義鏈19,23,24與mRNA同源區(qū)互補(bǔ)配對所決定的。siRNAs除正義鏈3端的兩個(gè)堿基在序列識別中不起主要作用外，其他單個(gè)堿基改變就可能使RNAi失效，而針對同源基因共有序列的RNAi則導(dǎo)致同源基因共同失活3,18,21,22。&#

11、160;   1.3.3高效性 RNAi抑制基因表達(dá)具有很高的效率，這是通過催化放大的方式進(jìn)行的。siRNAs不僅可引導(dǎo)RISC切割靶RNA，而且可作為引物在RNA依賴的RNA聚合酶（RdRP）作用下以靶mRNA為模板合成新的dsRNA。新合成的長鏈dsRNA同樣可被RNase樣核酸酶切割、降解而生成大量的次級siRNAs。次級siRNAs又可進(jìn)入合成切割的循環(huán)過程，進(jìn)一步放大RNAi作用。另外，當(dāng)mRNA降解時(shí)，siRNAs可連續(xù)地發(fā)揮降解作用。    1.3.4遺傳性 Fire等1將dsRNA注射入秀麗新線蟲的性腺后，在

12、其第1子代中也誘導(dǎo)出了同樣的基因抑制現(xiàn)象，這說明在原核生物中RNAi具有可遺傳性。隨后Clemens等在果蠅培養(yǎng)細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象。    2RNAi在眼底病中的研究進(jìn)展        由于RNAi在疾病治療方面具有潛在的優(yōu)勢4,25，近年來備受眼科醫(yī)師的重視。目前，國內(nèi)外在眼底疾病方面已經(jīng)開展了大量的相關(guān)研究。    2.1眼底新生血管性疾病 血管內(nèi)皮生長因子（ vascular endothelial growth factor,VEGF）是功能

13、最強(qiáng)的血管形成促進(jìn)因子，在脈絡(luò)膜新生血管性疾病和缺血性視網(wǎng)膜病變的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。Forooghian等26通過RNAi在RPE中分別促成了VEGF和低氧誘導(dǎo)因子（HIF1）的基因沉默，低氧環(huán)境下培養(yǎng)RPE，然后用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測培養(yǎng)基中有VEGF和HIF1存在,最后將此培養(yǎng)基提取出來用于培養(yǎng)人臍靜脈血內(nèi)皮細(xì)胞。通過定量檢測毛細(xì)血管的形成，得出了針對VEGF的RNAi使VEGF和一些其它的臨床上重要的血管形成因子，如血管形成因子、IL6，IL8、單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP1）、TGF1等的減少；而針對HIF1的RNAi雖然使VEGF、血管形成因子、TGF1的表達(dá)量減少，但是其它

14、一些血管生成因子如IL6，IL8，MCP1的量則升高。從而驗(yàn)證了VEGF在新生血管形成中的主要作用，并預(yù)示了RNAi在眼部新生血管性疾病治療的新前景。    2.2視網(wǎng)膜遺傳性疾病 視網(wǎng)膜色素變性（retinitis pigmentosa, RP）屬于視錐、視桿營養(yǎng)不良，是一組以進(jìn)行性感光細(xì)胞及色素上皮功能喪失為共同表現(xiàn)的遺傳性視網(wǎng)膜變性疾病9。遺傳異質(zhì)性是主要以遺傳為主的疾病治療中的一大難題，RP具有典型的遺傳異質(zhì)性。目前已分離出多種致病基因，視紫紅質(zhì)基因是其中的一種，在這一型RP患者中，就有不少于100個(gè)該基因的突變27，在基因水平分別補(bǔ)充缺失的基因

15、或清除異?；蛴型诓∫蛏现斡鶵P。Lewin通過實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)錨定視紫紅質(zhì)P23H突變的核糖體酶可以使轉(zhuǎn)基因鼠延緩感光受體的退變7。由于突變型等位基因和野生型等位基因在RNAi中都可以被抑制，OReilly等9通過將siRNAs或短發(fā)夾RNA（short hairpin RNAs,shRNAs），與不受它們抑制的被密碼子修飾的野生型替代基因，一并轉(zhuǎn)染到腺病毒相關(guān)病毒（AAV）28中，發(fā)現(xiàn)了令人振奮的結(jié)果。因此，RNAi和基因替代技術(shù)的聯(lián)合應(yīng)用，在未來有望克服突變異質(zhì)性帶來的治療障礙，從而治愈眼部遺傳性疾病。    2.3視神經(jīng)疾病 目前視神經(jīng)疾病主要以改善

16、微循環(huán)、積極抗炎等對癥治療為主。但是，單純抗炎及使用非特異性免疫抑制劑常會導(dǎo)致嚴(yán)重毒副作用。并且由于血房水屏障和血視網(wǎng)膜屏障的存在，傳統(tǒng)的藥物很難在病灶部位達(dá)到治療濃度，而用轉(zhuǎn)基因法導(dǎo)入dsRNA產(chǎn)生的RNAi，特別是基于它的特異性和潛力，有望取代反義RNA治療技術(shù)4作為一種新型的治療策略，為眼科視神經(jīng)疾病如視神經(jīng)炎、Leber氏遺傳性視神經(jīng)?。↙HON）29、多發(fā)性硬化的治療帶來新的前景。    2.4近視的治療 近視是一種發(fā)病率非常高的疾病，輕度近視對人們的生產(chǎn)和生活不會造成太大的影響。但是近視度數(shù)較高者可發(fā)生程度不等的眼底改變，如豹紋狀眼底、新生血

17、管膜的形成、黃斑部出血、視網(wǎng)膜脫離等，情況嚴(yán)重者可以導(dǎo)致不可逆性眼底損傷甚至致盲。雖然我們可以通過激光光凝、后鞏膜加固術(shù)等方法進(jìn)行治療，但其中大部分方法因有擴(kuò)大損傷范圍可能或操作復(fù)雜而受到一定限制。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，這種近視主要以遺傳為主，已發(fā)現(xiàn)改變的基因有：Lumican和Fibromodulin30、轉(zhuǎn)化生長因子誘導(dǎo)因子、成骨蛋白2等十多種31,32，表明病理性近視具有遺傳異質(zhì)性，與單純性近視不同。我們可以用RNAi制作多種表型，而且抑制基因表達(dá)的時(shí)間可以控制在發(fā)育的任何階段，產(chǎn)生類似基因敲除的效應(yīng)，具有投入少，周期短，操作簡單等優(yōu)勢。    2.5眼底腫瘤的治療 腫瘤治療是疾病治療的重