枸杞總黃酮類化合物抗脂質(zhì)過氧化研究

1、枸杞總黃酮類化合物抗脂質(zhì)過氧化研究    黃元慶魯建華沈泳盧景古麗賀晨霞 摘要利用Fe2+-Cys-His體系誘發(fā)鼠肝線粒體和紅細胞產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化的方法，研究了枸杞總黃酮類化合物(TFL)的抗脂質(zhì)過氧化作用。結(jié)果表明，TFL可阻斷該體系誘發(fā)的鼠肝線粒體脂質(zhì)過氧化，當TFL終濃度在0.0252.0mg/ml范圍時，對丙二醛(MDA)生成阻斷率為38.38%99.96%，呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，同時具有保持線粒體膜流動性的作用。掃描電鏡觀察到TFL對脂質(zhì)過氧化所致紅細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的破壞有保護作用。 關(guān)鍵詞枸杞總黃酮線粒體脂質(zhì)過氧化 中圖分類號R931.71R544.

2、6 The protective effects of total flavonoids from Lycium Barbarum L. on lipid peroxidation of liver mitochondria and red blood cell in rats Huang Yuanqing, Lu Jianhua, Shen Yong, Lu Jingfen, et al. Department of Nutrition and Food Hygiene, Faculty of Preventive medicine, Ningxia Medical College, Yin

3、chuan 750004, China The protective effects of total flavonoids from Lycium Barbarum L.(TFL) on lipid peroxidation in mitochondria and red blood cells (RBC) induced by oxygen radicals produced by Fe2+ cysteine system were investigated. The mitochondria lipid peroxidation (measured as malondialdehyde,

4、 MDA) was significantly inhibited by TFL with a dose-response relation between the concentrations of 0.025 and 2.0 mg/ml, and the fluidity of mitochondria membrane was also protected effectively. It was observed by scan electron microscope, that the shape of RBC in the Fe2+ system was damaged signif

5、icantly. The shape of RBC was remained with the addition of TFL. Key words:flavonoids of Lycium Barbarum L., lipid peroxidation, mitochondria 枸杞總黃酮(Flavonoids of Lycium Barbarum L.TFL)是從枸杞葉中提取得到的黃酮類化合物。枸杞葉總黃酮含量為5.77mg/g1。TFL的HPLC分離表明它含有9個組分峰，蘆丁為其組分之一2。以往對枸杞抗氧化活性成分的研究表明，按其對氧自由基清除作用的IC50比較，黃酮類化合物作用最強。

6、同時發(fā)現(xiàn)TFL具有抑制癌細胞熱代謝及抑制佛波酯引起的大鼠多形核白細胞呼吸爆發(fā)的作用。ESR研究表明，TFL具有清除O()/(*)2和·OH自由基的作用，所以枸杞總黃酮為枸杞中重要的抗氧化成分。 本研究利用Fe2+-Cys-His體系誘發(fā)大鼠肝臟線粒體及其紅細胞的氧化損傷的模型，分析觀察在體系中加入TFL后，體系中產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA、膜流動性和紅細胞形態(tài)變化來研究TFL的抗脂質(zhì)過氧化作用。 1材料及主要儀器 1.1材料 Wistar大鼠體重200300g，寧夏醫(yī)學(xué)院動物中心提供。TFL從枸杞葉(1997，11采于寧夏農(nóng)科院枸杞研究所)中提取。 1.2試劑 半胱氨酸、組胺酸、硫代巴

7、比妥酸(TBA)、戊二醛均為分析純；1，6-二苯基-1，3，5-己三烯(1，6-dipheny1-1,3,5-hexa-triene DPH)為Sigma產(chǎn)品。 1.3儀器 低溫高速離心機(Beckman)，可見光分光光度計，熒光分光光度計(具偏振器 日立公司850型)，JFM-35C型掃描電鏡。 2方法 2.1鼠肝線粒體(MT)制備 蛋白質(zhì)測定按考馬斯亮蘭顯色法3。 2.2TFL對鼠肝線粒體脂質(zhì)過氧化的保護作用。 2.2.1Fe2+-Cys-His-MT反應(yīng)體系含F(xiàn)e2+0.05mmol/L，Cys 0.2mmol/L, His 0.2mmol/L,MT 1.0mg/ml。在37該體系溫育3

8、0min后，用20%三氯醋酸終止反應(yīng)，按TBA顯色法測定MDA。 2.2.2Fe2+-Cys-His-MT反應(yīng)體系中加入不同濃度的TFL(0.0252.0mg/ml)，同時做空白(體系中不含F(xiàn)e2+)和對照(無TFL)，溫育30min終止反應(yīng)，分別測定MDA，線粒體膜流動性。計算MDA形成阻斷率，按公式：IR(%)=(A對照-ATFL)×100% A對照 2.3DPH熒光探劑標記法測定線粒體膜流動性4 上述不同處理的MT加等體積2×10-6mol/L DPH37溫育30min，在4 3300g離心10min，用PBS洗2次，加等體積PBS。熒光強度的測定：850型熒光分光光

9、度計于Em=377nm,Ex=463nm條件下，分別測定偏振器處于平行和垂直時的熒光強度(,)計算熒光偏振度P和微粘度，按公式： P=(-)(+)，=2P/(0.46-P) 2.4掃描電鏡觀察TFL對RBC脂質(zhì)過氧化損傷的保護作用 誘發(fā)RBC脂質(zhì)過氧化損傷處理同MT，體系中RBC終濃度為含Hb0.1g/ml。處理后各組RBC按常規(guī)電鏡標本方法制備在掃描電鏡下觀察和照相5。 3結(jié)果 3.1TFL對鼠肝線粒體脂質(zhì)過氧的保護作用 3.1.1TFL在Fe2+-Cys-His-MT體系中終濃度在0.00252.0mg/ml時對體系誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化有抑制作用，并呈現(xiàn)劑量-效應(yīng)關(guān)系，如圖1所示(呈直線相關(guān))

10、。 圖1TFL濃度MDA形成阻斷率(%)的劑量-效應(yīng)關(guān)系 每點為三次實驗的平均值，線性方程： =20.796x-14.872R2=0.9428 3.1.2線粒體膜流動性的保護在Fe2+-Cys-His-MT中加入TFL時MT膜的微粘度和熒光偏振度明顯小于陽性對照組，提示TFL組MT脂膜流動性大于陽性對照組(附表)。 附表線粒體膜流動性 指標 對照組(A) TFL組(B) 非處理組(C) 微粘度(泊) 3.1188±0.5582 2.1005±0.3476 2.9069±0.3104 熒光偏振度 0.2767±0.0008 0.2319±0.00

11、09 0.2647±0.0001 P值 0.0080(A:B) 0.1057(B:C) 0.6921(A:C) 3.1.3對RBC氧化損傷的保護作用RBC在Fe2+-Cys-His體系中加入TFL 2.0mg/ml 37溫育30min后分析其過氧化產(chǎn)物MDA及對RBC進行掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，20mg/ml TFL處理組MDA形成阻斷率IR(%)為37%，同時RBC在形態(tài)上與正常RBC一致，對照組RBC出現(xiàn)明顯損傷，2.0mg/ml TFL處理組MDA形成阻斷率IR(%)為5%，同時RBC在形態(tài)受到一定程度的保護(圖2)。 圖2RBC掃描電鏡圖片×4000倍 1.正常RBC2.

12、 2.0mg/mlTFL處理RBC 3.對照組RBC4.20mg/mlTFL處理RBC 4討論      在體內(nèi)代謝過程中，持續(xù)的產(chǎn)生自由基并存在相應(yīng)的清除自由基的機構(gòu)，使自由基的產(chǎn)生和消除處于動態(tài)平衡狀態(tài)，當此平衡因自由基產(chǎn)生增加或清除能力下降而失平衡時，將產(chǎn)生一系列的鏈式反應(yīng)引起機體的脂質(zhì)過氧化損傷。脂質(zhì)過氧化是指不飽和脂肪酸中發(fā)生的一系列自由基反應(yīng)，鐵、銅等過渡組金屬離子可能是“自動”氧化的啟動因子，而且這些金屬復(fù)合物能特異高效地催化脂氫過氧化物的分解引起自由基連鎖反應(yīng)。質(zhì)膜結(jié)構(gòu)中富含不飽和脂肪酸，高氧分壓和金屬絡(luò)合物的存在使生物膜對過氧化作用很敏

13、感，亞細胞器含有的不飽和脂肪酸比質(zhì)膜多，因而對過氧化更敏感。過氧化作用，與線粒體的膨脹、溶解，以及細胞膜受損、細胞自溶等形態(tài)改變完全一致。脂質(zhì)過氧化的中間產(chǎn)物自由基與最終分解產(chǎn)物丙二醛對膜的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生嚴重損傷，影響膜功能。FUFA的脂膜過氧化的啟動直接影響到膜結(jié)構(gòu)以及有關(guān)過氧化產(chǎn)物影響膜流動、交聯(lián)、結(jié)構(gòu)與功能，使膜脆性增加。本實驗中Fe2+誘發(fā)紅細胞和線粒體脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生MDA、引起線粒體膜流動性下降和紅細胞結(jié)構(gòu)的損壞，與上述理論相符。TFL可以抑制Fe2+誘發(fā)的紅細胞脂質(zhì)過氧化所產(chǎn)生的MDA，可以保護線粒體膜流動性和紅細胞結(jié)構(gòu)。結(jié)合以前ESR的研究TFL具有清除和.OH的作用，其作用機制可能是TFL清除和.OH從而阻斷了脂質(zhì)過氧化的鏈式反應(yīng)，抑制了脂質(zhì)過氧化以及MDA產(chǎn)生的細胞毒性作用達到了保護細胞器及紅細胞的作用。 * 國家自然科學(xué)基金資助課題(39160029) 作者簡介：黃元慶，男，學(xué)士，副教授 魯建華蘭州醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院眼科 古麗北京醫(yī)科大學(xué)天然與仿生藥物國家重點實驗室 作者單位：寧夏醫(yī)學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生教研室，銀川750004 參考文獻 1李國莉，黃元慶.寧夏枸杞不同組分黃酮含量