醋酸纖維素薄膜電泳法分離血清蛋白質(zhì).

1、生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)醋酸纖維素薄膜電泳法分離血清蛋白質(zhì)一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆沾姿崂w維薄膜電泳法分離蛋白質(zhì)的原理和方法二、實(shí)驗(yàn)原理蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。在 pH 值小于其等電點(diǎn)的溶液中，蛋白質(zhì)為正離子，在電場(chǎng)中向陰極移動(dòng)；在 pH 值大于其等電點(diǎn)的溶液中，蛋白質(zhì)為負(fù)離子，在電場(chǎng)中向陽(yáng)極移動(dòng)。 血清中含有數(shù)種蛋白質(zhì)， 它們所具有的可解離基團(tuán)不同， 在同一 pH 的溶液中，所帶凈電荷不同，故可利用電泳法將它們分離。血清中含有白蛋白、 - 球蛋白、 - 球蛋白、 - 球蛋白等，各種蛋白質(zhì)由于氨基酸祖墳、立體構(gòu)象、相對(duì)分子質(zhì)量、等電點(diǎn)及形狀不同，在電場(chǎng)中遷移速度不同。由表可知，血清中5 種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)大部分低于pH

2、值 7.0 ，所以在pH8.6 的緩沖液中，它們都電離成負(fù)離子，在電場(chǎng)中向陽(yáng)極移動(dòng)。蛋白質(zhì)名稱等電點(diǎn)相對(duì)分子質(zhì)量白蛋白4.8869000 1- 球蛋白5.06200000 2- 球蛋白5.06300000- 球蛋白5.1290000150000- 球蛋白6.857.50156000300000在一定范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)的含量與結(jié)合的燃染料量成正比，故可將蛋白質(zhì)區(qū)帶剪下，分別用 0.4mol/L NaOH 溶液浸洗下來(lái)，進(jìn)行比色，測(cè)定其相對(duì)含量。也可以將染色后的薄膜直接用光密度計(jì)掃描，測(cè)定其相對(duì)含量。腎病、彌漫性肝損害、肝硬化、原發(fā)性肝癌、多發(fā)性骨髓瘤、慢性炎癥、妊娠等都可以使白蛋白下降。腎病時(shí)1、

3、2、 球蛋白升高， - 球蛋白降低。肝硬化時(shí) 2、- 球蛋白降低，而 1、 - 球蛋白升高。三、實(shí)驗(yàn)器材1、醋酸纖維薄膜（ 2cm*8cm，厚度 120m）2、人血清；3、燒杯及培養(yǎng)皿數(shù)只；4、點(diǎn)樣器；5、竹鑷子；6、玻璃棒；7、電吹風(fēng)；8、試管六只；9、恒溫水浴鍋；10、電泳槽；11、直流穩(wěn)壓電泳儀；12、7220 型分光光度計(jì)；13、剪刀四、實(shí)驗(yàn)試劑1、巴比妥 - 巴比妥鈉緩沖液：取兩個(gè)大燒杯，分別稱取巴比妥鈉和巴比妥溶解于 500ml 蒸餾水中；2、染色液，可反復(fù)使用；3、漂洗液：取乙醇45ml，冰醋酸 10ml，混勻；4、浸出液： 0.4mol/L NaOH 溶液；5、透明液：取冰醋酸

4、25ml、無(wú)水乙醇 75ml，混勻。五、實(shí)驗(yàn)操作1、準(zhǔn)備和點(diǎn)樣取一條醋酸纖維薄膜，浸入緩沖液中，完全浸透后，用鑷子輕輕取出，將薄膜無(wú)光澤的一面向上，平放在干凈濾紙上，再放一張干凈濾紙吸取多余的緩沖液；用玻棒蘸取少量血清，涂在點(diǎn)樣器上，然后輕輕于距纖維薄膜一端 1.5cm 處接觸，樣品即呈一條狀突于纖維膜上。 待血清透入膜內(nèi)， 將薄膜平貼于已放在電泳槽上、并已浸透緩沖液的紗布上，點(diǎn)樣端為陰極；2、電泳接通電源，設(shè)定電泳電壓為100V，通電 50 分鐘；3、染色電泳完畢，將薄膜浸于染色液中 10 分鐘，取出，用漂洗液漂至背景無(wú)色，再浸于蒸餾水中；4、定量將漂凈的薄膜用濾紙吸干，剪下薄膜上各條蛋白質(zhì)

5、色帶，另取一條與各區(qū)帶近似寬度的無(wú)蛋白附著的空白薄膜， 分別浸于 4.0ml 0.4mol/L NaOH溶液中，37水浴 10 分鐘，色澤浸出后， 用 7220 型分光光度計(jì)在 590nm處比色，以空白膜條洗出液為空白調(diào)零，測(cè)定各管的吸光度。5、透明另外取電泳好的薄膜，待其完全干燥后，浸入透明液中20 分鐘，取出，平貼于干凈玻片上，干燥，即得背景透明的電泳圖譜。六、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄蛋白質(zhì)名稱吸光度各組分比率 %白蛋白0.50465.11- 球蛋白0.0384.92- 球蛋白0.0526.7 - 球蛋白0.09712.5 - 球蛋白0.08310.8設(shè)各部分吸光率為：A白、A 1、A 2、A 、 A

6、 。則吸光度總合為：A總= A白+ A1+A 2+A +A=0.774白蛋白比率 = A白 / A總 =0.6511- 球蛋白比率 = A 1 / A總 =0.0492- 球蛋白比率 = A 2 / A總 =0.067 - 球蛋白比率 = A / A總 =0.125 - 球蛋白比率 = A / A總 =0.108七、實(shí)驗(yàn)討論與總結(jié)1、什么是血清將抽取的血液置入不加抗凝劑的試管中，使血凝固，析出的上清液就是血清。血清中所含的蛋白成分與血漿相比，少了纖維蛋白原， 而主要是白蛋白、球蛋白。2、由于蛋白的絕大部分均由肝臟合成，所以，各種蛋白質(zhì)的質(zhì)與量的變化，除與免疫性疾病等有關(guān)外，主要反映肝臟的生理、

7、病理情況。3、醋酸纖維素薄膜醋酸纖維素（二乙酸纖維素）薄膜具有勻一的泡沫狀結(jié)構(gòu)，是由醋酸纖維素加工制成的。醋酸纖維素薄膜作為是電泳支持體有以下優(yōu)點(diǎn)：電泳后區(qū)帶界限清晰；通電時(shí)間較短（二十分鐘至一小時(shí)）；它對(duì)各種蛋白質(zhì)（包括血清白蛋白，溶菌酶及核糖核酸酶）都幾乎完全不吸附，因此無(wú)拖尾現(xiàn)象；對(duì)染料也沒(méi)有吸附，因此不結(jié)合的染料能完全洗掉，無(wú)樣品處幾乎完全無(wú)色。 它的電滲作用雖高但很均一， 不影響樣品的分離效果， 由于醋酸纖維素薄膜吸水量較低，因此必需在密閉的容器中進(jìn)行電泳，并使用較低有電流避免蒸發(fā)。醋酸纖維素薄膜經(jīng) 1,4 二氧六環(huán)、透明液或液體石蠟處理即透明，因而可得背景為無(wú)色的電泳圖譜。4、血清

8、提取蛋白從血清中提取的蛋白質(zhì)，適用于食品工業(yè)的食品添加劑和醫(yī)藥制劑。通常提取蛋白質(zhì)的方法是離心分離，除去血漿，使二價(jià)鐵血紅素酸化，并將其排除。制作方法 ：取經(jīng)過(guò)穩(wěn)定的血液，作離心分離 1530 分鐘，每分鐘轉(zhuǎn)速為 2 500 3 000 轉(zhuǎn)。從而取得固形物，去除血漿，用水使固形物沉渣溶解。置血紅素于培養(yǎng)基中。為了使培養(yǎng)基酸化而使血紅素分子中的二價(jià)鐵血紅素和血球蛋白的結(jié)合體分離 預(yù)先制備好醋酸和氯化鈉的混合物 并將它加熱到 90110?；旌蠒r(shí)將固形物的溶血產(chǎn)物緩慢地添加到加熱的混合物中。 重新把溫度逐漸地升高到沸點(diǎn)，煮沸 515 分鐘，以便使結(jié)合體完全分離， 接著將混合物逐步冷卻到室溫。為了使二價(jià)鐵