聚合酶鏈反應技術分析家蠅抗性基因的研究

1、    聚合酶鏈反應技術分析家蠅抗性基因的研究*        摘要目的：家蠅對擬除蟲菊酯抗藥性與細胞色素 P450的CYP6D1基因有關，采用分子生物學的特異性基因聚合酶鏈反應技術分析家蠅抗藥性的發(fā)生、發(fā)展規(guī)律，探討早期預測及防治策略。方法：提取雄性家蠅腹部DNA作為反應模板，根據(jù)CYP6D1基因序列設計特異性基因引物，進行30個循環(huán)擴增，電泳分析擴增產(chǎn)物與生物測試結果比較。結果：D-R品系擴增陽性率100%，敏感品系擴增陽性率為0，深圳、汕頭、韶關、廣州、茂名品系擴增陽性

2、率分別為59%、56.3%、54%、55%及25%。擴增陽性率與家蠅對擬除蟲菊酯抗性倍數(shù)呈正相關(r0.8344，P0.05)。結論：聚合酶鏈反應技術應用于家蠅抗性發(fā)生、發(fā)展規(guī)律分析，早期診斷及抗藥性發(fā)生機理研究有重要意義。關鍵詞聚合酶鏈反應細胞色素 P450抗藥性基因家蠅 Study on a Polymerase Chain Reaction (PCR) Analysing the Insecticide Resistance in the Housefly,Musca domesticaLin LifengZhang ZihongLiu Liping(Health and Anti-Ep

3、idemic Station of Guangdong Province,Guangzhou,510300 )AbstractA cytochrome P450 is responsible for pyrethroid resistance in the housefly. A PCR was used for measuring the relativity between the amplificative frequency of specific resistant alleles in Musca domestica and the pyrethroid resistance ra

4、tio. The results showed that the positive rate of amplification of specific resistant alleles were 100%,0,59%,56.3%,54%,55% and 25% in the deltamethrin resistant strain, susceptible strain, Shenzhen,Shantou,Shaoguan,Guangzhou,Maoming strains respectively. There was positive relativity between the am

5、plificative frequency of individual housefly and resistance ratio to deltamethrin.Key wordsPolymerase chain reactionCytochrome P450ResistanceGeneHousefly掌握衛(wèi)生害蟲自然群體中抗性水平對預測抗性發(fā)展、制訂控制措施有重要意義?？剐詼y定常用生物測定法，從整體水平測定抗藥性，廣為應用的也有生化方法測定酶活性、分子生物學方法測定抗性基因分析抗藥性發(fā)展趨勢等1-2。家蠅對擬除蟲菊酯抗藥性與細胞色素P450單氧化酶有關，特別是與P450的特異基因CYP6D

6、1變異有關3。本實驗首次應用聚合酶鏈反應(PCR)技術檢測廣東省家蠅特異抗性基因出現(xiàn)頻率，從分子生物學水平探討分析家蠅抗藥性的發(fā)生發(fā)展規(guī)律。1材料與方法1.1家蠅來源抗溴氰菊酯品系(D-R)家蠅、敏感品系(S)家蠅，均為本站昆蟲室培養(yǎng)品系；還有深圳、茂名、韶關、廣州及汕頭品系(SZ、MM、SG、GZ及ST)家蠅。同批家蠅雌蟲用于生物測定，雄蟲用液氮冷凍保存?zhèn)溆谩?.2生物測定自動微量點滴法4。1.3特異抗性基因的聚合酶鏈反應(SPCR)1.3.1家蠅DNA模板制備參照基因公司的QIAamp組織試劑盒提純DNA方法5：(1)家蠅組織溶解：取液氮保存的雄蠅腹部置于1.5ml離心管，加180l AT

7、L液勻漿，再加20l蛋白酶K，搖勻，55培養(yǎng)至組織溶解，加入20l RNaseA(20g/l)室溫培養(yǎng)2min，加200l AL緩沖液，70培養(yǎng)10min；(2)DNA固定結合：加210l 98%酒精到上述培養(yǎng)液，混勻后加到QIAamp管(置于2ml收集管內)，8 000rpm離心1min；(3)沖洗：用500l Aw緩沖液沖洗QIAamp管2次；(4)DNA洗出：將70預熱的200l AE緩沖液加入QIAamp管(置于2ml收集管內)，70培養(yǎng)5min，8 000rpm離心1min，連續(xù)沖洗2次。洗出液為DNA模板，保存?zhèn)溆谩?.3.2PCR反應(1)引物設計參照N.Liu和T.Tomita

8、6根據(jù)抗擬除蟲菊酯家蠅的CYP6D1基因序列設計的3個引物，委托上海生工生物工程公司合成。引物1：5-CACAAAATGACCGGCAACTA-3非特異性基因；引物2：5-ACATTGTCGACTTCTTTGGG-3；引物3：5-ACGGCCATTTGGCCTGGTTA-3特異性基因。引物1，2所含的序列為830bp，引物2，3所含的序列為580bp，使用前配成10pmol/l。(2)擴增在0.5ml Eppendoff管中終濃度為10mM Tris-HCl(pH8.3)，50mM KCl，2mM MgCl2，0.2m引物1和2或引物2和3，0.2mM的各種dNTP及1.5U的Taq聚合酶(上

9、海生工產(chǎn)品)。加入3l DNA模板，加雙蒸去離子水至終體積為25l。混勻后加入20l石蠟油，離心10s，分層。在基因擴增儀(PE480，美國)自動擴增反應。反應參數(shù)：95預變性2min，再進行30個循環(huán)：95×45s、55×45s、67×45s、72×45s，最后一個循環(huán)72延伸7min。1.3.3擴增產(chǎn)物電泳及檢查取10l擴增產(chǎn)物加2l 6倍加樣緩沖液(0.25%溴酚藍，0.25%二甲苯青FF，40%蔗糖水)，加到2%瓊脂糖凝膠(含0.5g/ml的溴化乙錠)電泳，并加入Bio-Rad低分子量標準DNA(上海生工提供)對照，電泳結果在紫外光燈檢測并攝影。

10、2結果2.1家蠅對溴氰菊酯的抗藥性結果見表1。表1家蠅對溴氰菊酯的抗藥性種群檢查蟲數(shù)(只)LD50(g/蟲)RRS480 0.00201D-R4802.0001000.00MM4800.01115.55GZ4800.01527.60SG4800.01849.22ST4800.021510.80SZ4800.034617.302.2家蠅CYP6D1基因的擴增結果見表2及14。 1S品系家蠅基因PCR擴增結果a、e、b、f、c、g、d、h分別是同一家蠅各用引物1/2及2/3擴增結果；M：Bio-Rad低分子量標準DNA；下同2D-R品系家蠅基因PCR擴增結果3茂名品系家蠅基因PCR擴增結果4深圳品

11、系家蠅基因PCR擴增結果表2家蠅CYP6D1基因的擴增結果種群非特異性基因抗性特異性基因檢查只數(shù)陽性只數(shù)陽性率(%)檢查只數(shù)陽性只數(shù)陽性率(%)S201050.02000.0D-R302583.33030100.0MM24937.524625.0GZ201785.0201155.0SG241875.0241354.0ST322681.3321856.3SZ342882.4342059.0茂名種群特異性基因的擴增陽性率比廣州、韶關、汕頭、深圳種群的低(23.84，P0.05)，廣州、韶關、汕頭、深圳種群的擴增陽性率差異無顯著性(23.84，P0.05)。特異性基因的擴增比非特異性基因強(14)。

12、2.3家蠅抗性與PCR擴增陽性率的關系見表3。 表3家蠅抗性與PCR擴增陽性率的關系種群對溴氰菊酯的抗性倍數(shù)特異性基因陽性率(%)非特異性基因陽性率(%)S1.000.050.0MM5.5525.037.5GZ7.6055.085.0SG9.2254.075.0ST10.856.381.3SZ17.359.082.43討論 家蠅CYP6D1基因位于第1染色體6，當家蠅對擬除蟲菊酯產(chǎn)生抗性，在cDNA第270點位的核苷酸T變?yōu)锳3，根據(jù)這一特點，將變異點作3-末端設計引物2、3(含580bp)的特異性抗性基因，另用非特異性基因含830bp為對照比較。結果：特異性抗性基因引物產(chǎn)生的擴增特異性強，抗

13、溴氰菊酯品系，擴增陽性率達100%。敏感品系家蠅由于不存在抗性基因，因此沒有出現(xiàn)擴增。非特異性基因引物(1、3)擴增的陽性率差異不大?？剐员稊?shù)與特異性基因陽性率(%)的相關性檢驗：r0.8344(v4)，呈顯著正相關(P0.05)抗性倍數(shù)與非特異性基因陽性率(%)的相關性檢驗：r0.6854(v4)，無相關性(P0.05)本技術應用于現(xiàn)場監(jiān)測，深圳、汕頭、韶關、廣州、茂名株的特異性基因擴增陽性率隨著其敏感性的增高而下降，與對菊酯類的抗性倍數(shù)呈正相關關系，r0.8344(P0.05)。非特異性基因的擴增陽性率與抗性倍數(shù)無顯著相關性，r0.6854(P0.05)，說明特異性基因的PCR監(jiān)測能從分子

14、學水平檢測蠅類抗性水平。本研究發(fā)現(xiàn)家蠅的抗性基因出現(xiàn)頻率大于50%時，家蠅已產(chǎn)生明顯的抗藥性。當擴增陽性率為25%、抗性倍數(shù)是5.5倍時，應用PCR技術能有效、早期發(fā)現(xiàn)家蠅抗性發(fā)生。非特異性基因引物1，2擴增陽性率理論應該是100%，但可能由于合成片段(含830bp)比特異性基因擴增片段(含580bp)較長，不易合成的緣故，所以擴增結果明顯較弱，此現(xiàn)象與張玲敏的研究結果相似7。特異基因PCR技術應用，可進一步通過研究，在實驗室培養(yǎng)家蠅，觀察第幾代次施藥后家蠅出現(xiàn)特異性抗性基因、抗性基因的發(fā)生頻率以及停藥后培養(yǎng)幾代抗性基因頻率出現(xiàn)下降，甚至消失；亦可通過交替用藥或混配施藥方法培養(yǎng)家蠅抗藥性，研究

15、交替用藥的頻度，可以延緩抗性基因產(chǎn)生，這對指導蠅類以及衛(wèi)生害蟲防制、合理用藥具有現(xiàn)實意義。已發(fā)現(xiàn)家蠅對擬除蟲菊酯類殺蟲劑的抗藥性與細胞色素P450單加氧化酶的多個基因有關，其中CYP6D1是一重要的控制基因。本研究發(fā)現(xiàn)該基因突變頻率與抗藥性密切相關。通過PCR技術，分析各有關的抗性基因在家蠅產(chǎn)生抗性中所處的地位，對于了解抗性發(fā)生機制及對于抗性從分子學水平治理有深遠意義。(本課題承蒙中科院動物研究所馮國蕾研究員等指導及本站流研所、寄研所的支持，一并致謝)* 廣東省重大科研項目基金及醫(yī)藥衛(wèi)生科研基金資助課題作者單位：廣東省衛(wèi)生防疫站(廣州 510300)參考文獻1李月明，孫耘芹，龔坤元，等.乙酰膽堿酯酶敏感性的變化與家蠅抗藥性的關系.昆蟲學報，1987，30(3)139-245.2Dmitri Ardreev.A PCR Diagnostic for Cyclodiene Inseticide Resistance in the Red Flour Beetle Tribolium castaneum. Pestic.sci,1994,41345-349.3Tomlta T and Scott JG.Insect Biochem.Molec.Biol.,1994.4張紫