紅細胞檢驗的基本方法

1、鐵指標檢驗的幾個概念1.1.血清鐵血清鐵(serum iron )(serum iron )。2.2.血清轉(zhuǎn)鐵蛋白血清轉(zhuǎn)鐵蛋白(serum transferrin)(serum transferrin)。3.3.血清鐵蛋白血清鐵蛋白(serum ferritin)(serum ferritin)。4.4.血清總鐵結(jié)合力血清總鐵結(jié)合力(TIBC)(TIBC)。5.5.轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度。轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度。 一、一、 1.1.原理原理SF SF PHPH+還原劑還原劑 FeFe2+2+ +顯色劑顯色劑絡(luò)合物絡(luò)合物成年男性成年男性11.611.631.3mol31.3molL L 成年女性成年女性9.09

2、.030.4mol30.4molL L降低：見于缺鐵性貧血（降低：見于缺鐵性貧血（IDAIDA）、慢性失血和）、慢性失血和 感染等。感染等。增高：見于肝疾病、鐵粒幼細胞貧血、慢性增高：見于肝疾病、鐵粒幼細胞貧血、慢性 溶血和反復輸血等。溶血和反復輸血等。二、二、 （125125I I標記標記SF+SF+待測血待測血SFSF）+ +定量抗體定量抗體 125125I I復合物復合物1+1+復合物復合物2 2125125I I標記標記SF+SF+定量抗體定量抗體 125125I I復合物復合物3 32 2、參考值：、參考值：成人男性成人男性1515200g200gL L， 女性女性1212150g1

3、50gL ,L ,小兒低于成人；小兒低于成人；3 3、臨床評價：、臨床評價：降低：見于降低：見于IDAIDA早期、失血、慢性貧血等。早期、失血、慢性貧血等。增高：見于肝疾病、血色病、急性感染和惡增高：見于肝疾病、血色病、急性感染和惡 性腫瘤等。性腫瘤等。 三、三、 1.1.過量鐵標準液過量鐵標準液+ +血清血清SFSF2.SF 2.SF PHPH+還原劑還原劑FeFe2+2+ +顯色劑顯色劑有色絡(luò)合物有色絡(luò)合物TIBCTIBC：男性：男性505077mol77molL L 女性女性54 54 77mol77molL LUIBCUIBC：25.125.151.9mol51.9molL L 增高：

4、見于增高：見于IDAIDA和紅細胞增多癥等。和紅細胞增多癥等。 降低或正常：見于肝疾病、惡性腫瘤、溶降低或正常：見于肝疾病、惡性腫瘤、溶 血性貧血、慢性感染和腎病綜合征等。血性貧血、慢性感染和腎病綜合征等。四、鐵吸收率測定四、鐵吸收率測定當體內(nèi)缺鐵時，鐵蛋白的利用加快，腸道對鐵吸收也增當體內(nèi)缺鐵時，鐵蛋白的利用加快，腸道對鐵吸收也增加?？诜派湫约?。口服放射性5959FeFe，測定體內(nèi)，測定體內(nèi)5959Fe Fe 放射性量比率的放射性量比率的變化，可推算出鐵吸收率。變化，可推算出鐵吸收率。正常值正常值:26.0:26.035.035.0增加：見于增加：見于IDAIDA，可高達，可高達50508

5、080。降低：見于腸道吸收不良綜合征。降低：見于腸道吸收不良綜合征。正常：見于正常人、再障、巨幼細胞貧血、正常：見于正常人、再障、巨幼細胞貧血、 急性失血等。急性失血等。五、血清轉(zhuǎn)鐵蛋白測定五、血清轉(zhuǎn)鐵蛋白測定免疫散射比濁法：利用抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白血清與免疫散射比濁法：利用抗人轉(zhuǎn)鐵蛋白血清與待檢測的轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合形成抗原抗體復合物，待檢測的轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合形成抗原抗體復合物，其光吸收和散射濁度增加，與標準曲線比較，其光吸收和散射濁度增加，與標準曲線比較，可計算出轉(zhuǎn)鐵蛋白含量?？捎嬎愠鲛D(zhuǎn)鐵蛋白含量。免疫散射比濁法為免疫散射比濁法為28.628.651.9mol51.9molL L。增高：見于增高：見于IDA

6、IDA和妊娠。和妊娠。降低：常見于腎病綜合征、肝硬化、惡性腫降低：常見于腎病綜合征、肝硬化、惡性腫 瘤、炎癥等。瘤、炎癥等。六、血清轉(zhuǎn)鐵蛋白受體測定六、血清轉(zhuǎn)鐵蛋白受體測定雙抗體夾心法。雙抗體夾心法。1.1.血清中轉(zhuǎn)鐵蛋白受體血清中轉(zhuǎn)鐵蛋白受體+ +抗體抗體2.2.抗原抗體復合物抗原抗體復合物+ +酶抗體；酶抗體；3.3.加入底物和顯色劑，其顏色的深淺與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的量加入底物和顯色劑，其顏色的深淺與轉(zhuǎn)鐵蛋白受體的量成正比。以不同濃度標準品的吸光度值繪制標準曲線，成正比。以不同濃度標準品的吸光度值繪制標準曲線，通過標準曲線查出未知標本的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體通過標準曲線查出未知標本的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體水平。水

7、平。升高：常見于缺鐵性貧血和溶血性貧血。升高：常見于缺鐵性貧血和溶血性貧血。降低：見于再障、慢性病貧血、腎功能衰竭等。降低：見于再障、慢性病貧血、腎功能衰竭等。用于臨床觀察骨髓增生狀況和治療反應(yīng)。用于臨床觀察骨髓增生狀況和治療反應(yīng)。小低貧的初步診斷1.HGB（g/L） 男性120 女性1102.HCT 0.35 男性0.40 女性3.RBC （1012/L） 男性4.0 女性3.5 4.MCV(fl) 80 fl=10-15L5.MCH (pg)27 pg=10 12g6.MCHC 0.32血清鐵指標檢驗的應(yīng)用 小細胞低色素性貧血的鑒別小細胞低色素性貧血的鑒別 鐵鐵 總鐵結(jié)合力總鐵結(jié)合力 鐵飽

8、和度鐵飽和度 鐵蛋白鐵蛋白缺鐵貧缺鐵貧 減低減低 增高增高 減低減低 減低減低地貧地貧 正常正常 正常正常 正常正常 正正/ /高高慢感貧慢感貧 減低減低 正正/ /低低 減低減低 增高增高鐵粒貧鐵粒貧 增高增高 減低減低 增高增高 增高增高一、血清和紅細胞葉酸測定一、血清和紅細胞葉酸測定葉酸測定（葉酸測定（measurement of folacin）RIARIA，核素核素+ +葉酸葉酸放射碘葉酸化合物。放射碘葉酸化合物。血清葉酸：成年男性血清葉酸：成年男性8.618.6123.8nmol23.8nmolL L 葉酸減低：巨幼細胞貧血，紅細胞過度增生葉酸減低：巨幼細胞貧血，紅細胞過度增生 （

9、如溶貧、骨髓增生性疾病等）。（如溶貧、骨髓增生性疾病等）。 女性女性7.937.9320.4nmol20.4nmolL L紅細胞與血清中的紅細胞與血清中的葉酸濃度相差幾十倍，當葉酸濃度相差幾十倍，當未發(fā)生巨幼細胞貧血時，紅細胞葉酸測定對未發(fā)生巨幼細胞貧血時，紅細胞葉酸測定對判斷葉酸缺乏尤其有價值。判斷葉酸缺乏尤其有價值。紅細胞葉酸：成人紅細胞葉酸：成人3403401020nmol1020nmolL L紅細胞紅細胞第二節(jié)第二節(jié) 葉酸和維生素葉酸和維生素B12 B12 的檢驗的檢驗二、血清維生素二、血清維生素B B1212測定測定RIARIA法，用抗氧化劑和氰化鉀在堿性環(huán)法，用抗氧化劑和氰化鉀在堿

10、性環(huán)境下（境下（pHpH1212）, ,將人血清中的維生素將人血清中的維生素B B1212從載體蛋白中釋放出從載體蛋白中釋放出來。加入來。加入5757Co Co 標記的維生素標記的維生素B B1212, ,與固定在微晶纖維顆粒上純與固定在微晶纖維顆粒上純化的維生素化的維生素B B1212結(jié)合物競爭結(jié)合，檢測其放射活性，其量與受結(jié)合物競爭結(jié)合，檢測其放射活性，其量與受檢血清的維生素檢血清的維生素B B1212含量成反比，與標準管作對照，換算出維含量成反比，與標準管作對照，換算出維生素生素B B1212含量。含量。成人成人148148660pmol660pmolL L降低：巨幼細胞貧血。降低：巨幼

11、細胞貧血。增高：白血病患者增高：白血病患者 真性紅細胞增多癥真性紅細胞增多癥 惡性腫瘤和肝細胞損傷惡性腫瘤和肝細胞損傷四、血清內(nèi)因子阻斷抗體測定四、血清內(nèi)因子阻斷抗體測定用用5757CoCo標記的維生素標記的維生素B12B12與血清中的內(nèi)因子結(jié)與血清中的內(nèi)因子結(jié)合，形成合，形成5757CoCo標記的維生素標記的維生素B12B12內(nèi)因子復合內(nèi)因子復合物；當存在內(nèi)因子抗體時物；當存在內(nèi)因子抗體時, ,形成的復合物的形成的復合物的量減少。檢測其放射活性，與陽性對照管進量減少。檢測其放射活性，與陽性對照管進行比較，可得知內(nèi)因子抗體的存在。陰性：行比較，可得知內(nèi)因子抗體的存在。陰性：正常人，比值正常人，

12、比值1.001.000.100.10陽性：比值陽性：比值陽性對照血清比值陽性對照血清比值0.100.10內(nèi)因內(nèi)因子阻斷抗體陽性：多見于由維生素子阻斷抗體陽性：多見于由維生素B12 B12 缺缺乏引起的巨幼細胞貧血、惡性貧血等。乏引起的巨幼細胞貧血、惡性貧血等。紅細胞壽命測定（紅細胞壽命測定（erythrocyte life span determination）是將放射性核素（）是將放射性核素（5151CrCr）標記）標記的紅細胞注入血循環(huán)后，逐日觀察其消失率，的紅細胞注入血循環(huán)后，逐日觀察其消失率，記錄成活曲線，計算出紅細胞壽命。記錄成活曲線，計算出紅細胞壽命。半壽期為半壽期為2525323

13、2天天紅細胞壽命縮短：紅細胞壽命縮短：（1 1）溶血性貧血，約為）溶血性貧血，約為1414天。天。（2 2）再生障礙性貧血，約為）再生障礙性貧血，約為15152929天。天。第三節(jié)第三節(jié) 溶血的檢驗溶血的檢驗四、血漿高鐵血紅素白蛋白檢測四、血漿高鐵血紅素白蛋白檢測高鐵血紅素白蛋白高鐵血紅素白蛋白+ +硫化銨硫化銨 銨血色原銨血色原用光譜儀在綠光區(qū)用光譜儀在綠光區(qū)558nm 558nm 處有一最佳吸收區(qū)帶。處有一最佳吸收區(qū)帶。正常人呈陰性正常人呈陰性血管內(nèi)溶血時，血漿中游離血紅蛋白大量增血管內(nèi)溶血時，血漿中游離血紅蛋白大量增加，血漿中可檢測出高鐵血紅素白蛋白。加，血漿中可檢測出高鐵血紅素白蛋白。

14、1 1、原理、原理 五、五、血清結(jié)合珠蛋白(Hp)測定1.待側(cè)血清待側(cè)血清+Hb液液Hp-Hb復合物復合物+未結(jié)合未結(jié)合Hb。2.電泳分離出電泳分離出Hp-Hb復合物。復合物。電泳法電泳法 0.51.6g/L1.減低：常見于各種溶血，尤其是血管內(nèi)溶血。減低：常見于各種溶血，尤其是血管內(nèi)溶血。排除嚴重肝病及傳單。排除嚴重肝病及傳單。2.增高：感染、增高：感染、SLE、創(chuàng)傷、惡腫、妊娠等。、創(chuàng)傷、惡腫、妊娠等。六、尿卟啉檢測六、尿卟啉檢測尿中卟啉類物質(zhì)在酸性條件尿中卟啉類物質(zhì)在酸性條件下，經(jīng)乙醚提取，于下，經(jīng)乙醚提取，于405nm405nm處顯紅色熒光，處顯紅色熒光，從而可對尿卟啉進行定性檢測。正

15、常人呈從而可對尿卟啉進行定性檢測。正常人呈陰性陰性增加：先天性紅細胞生成性卟啉病、遲發(fā)增加：先天性紅細胞生成性卟啉病、遲發(fā)性皮膚型卟啉病、肝紅細胞生成型卟啉病性皮膚型卟啉病、肝紅細胞生成型卟啉病等。等。對缺鐵性貧血、鉛中毒、鐵粒幼細胞貧血對缺鐵性貧血、鉛中毒、鐵粒幼細胞貧血和珠蛋白生成障礙性貧血等的診斷有一定和珠蛋白生成障礙性貧血等的診斷有一定價值。價值。 五、尿含鐵血黃素試驗五、尿含鐵血黃素試驗又稱又稱Rous試驗。當血紅蛋白通過腎試驗。當血紅蛋白通過腎濾過時，濾過時，部分鐵離子以含鐵血黃素的形式沉積于上皮部分鐵離子以含鐵血黃素的形式沉積于上皮細胞，并隨尿液排出。尿中含鐵血黃素是不細胞，并隨

16、尿液排出。尿中含鐵血黃素是不穩(wěn)定的鐵蛋白聚合體，其中的高鐵離子與亞穩(wěn)定的鐵蛋白聚合體，其中的高鐵離子與亞鐵氰化鉀作用，在酸性環(huán)境下產(chǎn)生普魯士藍鐵氰化鉀作用，在酸性環(huán)境下產(chǎn)生普魯士藍色的亞鐵氰化鐵沉淀。尿沉渣腎小管細胞內(nèi)色的亞鐵氰化鐵沉淀。尿沉渣腎小管細胞內(nèi)外可見直徑外可見直徑1 13 3m的藍色顆粒。的藍色顆粒。正常人呈陰性正常人呈陰性陽性提示慢性血管內(nèi)溶血，尿中有鐵排出。無論有無血紅陽性提示慢性血管內(nèi)溶血，尿中有鐵排出。無論有無血紅蛋白尿，只要存在慢性血管內(nèi)溶血如蛋白尿，只要存在慢性血管內(nèi)溶血如PNHPNH，本試驗結(jié)果即，本試驗結(jié)果即呈陽性，并可持續(xù)數(shù)周。呈陽性，并可持續(xù)數(shù)周。溶血初期，雖然

17、有血紅蛋白尿，此時本試驗可呈陰性反應(yīng)。溶血初期，雖然有血紅蛋白尿，此時本試驗可呈陰性反應(yīng)。 一、紅細胞滲透脆性試驗一、紅細胞滲透脆性試驗滲透脆性試驗（滲透脆性試驗（osmotic fragility test）檢測紅細胞對不同濃度低滲鹽溶液的抵抗力。紅細胞在低滲檢測紅細胞對不同濃度低滲鹽溶液的抵抗力。紅細胞在低滲鹽溶液中，當水滲透其內(nèi)部達一定程度時，紅細胞發(fā)生膨脹鹽溶液中，當水滲透其內(nèi)部達一定程度時，紅細胞發(fā)生膨脹破裂。破裂。開始溶血：開始溶血：75.275.282.1mmol82.1mmolL L（4.44.44.8g4.8gL L）NaCl NaCl 完全溶血：完全溶血：47.947.95

18、4.7mmol54.7mmolL L（2.82.83.2g3.2gL L）NaClNaCl脆性增加：遺傳性球形紅細胞增多癥、橢圓形紅細胞增多癥脆性增加：遺傳性球形紅細胞增多癥、橢圓形紅細胞增多癥和部分自身免疫性溶血性貧血。和部分自身免疫性溶血性貧血。脆性降低：珠蛋白生成障礙性貧血、血紅蛋白脆性降低：珠蛋白生成障礙性貧血、血紅蛋白C C、D D、E E病，低病，低色素性貧血、肝疾病等。色素性貧血、肝疾病等。第四節(jié)第四節(jié) 紅細胞膜缺陷的檢驗紅細胞膜缺陷的檢驗二、自身溶血試驗及其糾正試驗二、自身溶血試驗及其糾正試驗紅細胞在紅細胞在3737孵育孵育4848小時，其間由小時，其間由于膜異常引起鈉內(nèi)流傾向

19、明顯增加，于膜異常引起鈉內(nèi)流傾向明顯增加，ATPATP消耗過多；或糖酵解途消耗過多；或糖酵解途徑酶缺乏所引起徑酶缺乏所引起ATPATP生成不足等原因可導致溶血，稱為自身溶血生成不足等原因可導致溶血，稱為自身溶血試驗。在孵育時，加入葡萄糖或試驗。在孵育時，加入葡萄糖或ATPATP作為糾正物，觀察溶血可否作為糾正物，觀察溶血可否有一定的糾正，稱為糾正試驗。有一定的糾正，稱為糾正試驗。正常人紅細胞孵育正常人紅細胞孵育4848小時小時, ,不加糾正物的溶血率不加糾正物的溶血率3.53.5，加葡萄糖，加葡萄糖的溶血率的溶血率1.01.0，加，加ATPATP糾正物的溶血率糾正物的溶血率0.80.8。遺傳性

20、球形紅細胞增多癥自身溶血率增加，加入葡萄糖或遺傳性球形紅細胞增多癥自身溶血率增加，加入葡萄糖或ATPATP后后明顯糾正。明顯糾正。G G6 6PDPD缺乏癥等戊糖旁路代謝缺陷的病人自身溶缺乏癥等戊糖旁路代謝缺陷的病人自身溶血率增加，能被葡萄糖糾正。丙酮酸激酶缺乏癥時不能利用葡血率增加，能被葡萄糖糾正。丙酮酸激酶缺乏癥時不能利用葡萄糖產(chǎn)生萄糖產(chǎn)生ATP ,ATP ,其自身溶血率明顯增加，加葡萄糖不能糾正，加其自身溶血率明顯增加，加葡萄糖不能糾正，加ATPATP可糾正。獲得性溶血性貧血或自身免疫性溶血時試驗結(jié)果可糾正。獲得性溶血性貧血或自身免疫性溶血時試驗結(jié)果常各有不同，對診斷意義不大。本試驗不夠

21、敏感和特異，僅對常各有不同，對診斷意義不大。本試驗不夠敏感和特異，僅對遺傳性球形紅細胞增多癥有較大診斷價值遺傳性球形紅細胞增多癥有較大診斷價值. . 三、紅細胞膜三磷酸腺苷活性測定三、紅細胞膜三磷酸腺苷活性測定NaNaK KATPATP酶、酶、CaCa2 2MgMg2 2ATPATP酶和酶和MgMg2 2ATP ATP 酶都是紅細胞膜上的酶都是紅細胞膜上的ATPATP酶。為測定酶的活酶。為測定酶的活性可分別測定酶作用于性可分別測定酶作用于ATPATP的水解產(chǎn)物無機磷含量，若在基質(zhì)中的水解產(chǎn)物無機磷含量，若在基質(zhì)中只加入只加入CaCa2 2MgMg2 2ATPATP酶可測定酶可測定CaCa2 2

22、MgMg2 2ATPATP酶的活性，若酶的活性，若在基質(zhì)中加入在基質(zhì)中加入NaNa、K K、MgMg2 2和和ATPATP，測定的為，測定的為NaNaK KATPATP酶酶和和MgMg2 2ATPATP酶的共同含量，再在基質(zhì)中加入酶的共同含量，再在基質(zhì)中加入NaNaK KATPATP酶的酶的抑制劑，測定結(jié)果僅為抑制劑，測定結(jié)果僅為MgMg2 2ATPATP酶活性，兩者的差為酶活性，兩者的差為NaNaK KATPATP酶活性。酶活性。紅細胞膜紅細胞膜NaNaK KATPATP酶：（酶：（2.932.930.670.67）mUmU10109 9紅細胞紅細胞CaCa2 2MgMg2 2ATPATP酶

23、：酶：0.40.42.5mol2.5molL L1 1.mg .mg 膜蛋白膜蛋白.h.h1 1遺傳性球形紅細胞增多癥：遺傳性球形紅細胞增多癥：NaNaK KATPATP酶活性增加，酶活性增加，CaCa2 2MgMg2 2ATPATP酶活性減低。酶活性減低。蠶豆病：蠶豆?。篊aCa2 2MgMg2 2ATPATP酶活性降低。酶活性降低。許多藥物作用于紅細胞時，許多藥物作用于紅細胞時，NaNaK KATPATP酶和酶和CaCa2 2MgMg2 2ATPATP酶酶活性改變。活性改變。四、酸化甘油溶血試驗四、酸化甘油溶血試驗當甘油存在于低滲溶液氯化鈉磷酸緩沖當甘油存在于低滲溶液氯化鈉磷酸緩沖液時，可

24、阻止其中的水快速進入紅細胞內(nèi)，使溶血過程緩液時，可阻止其中的水快速進入紅細胞內(nèi)，使溶血過程緩慢。但甘油與膜脂質(zhì)又有親和性，可使膜脂質(zhì)減少。當紅慢。但甘油與膜脂質(zhì)又有親和性，可使膜脂質(zhì)減少。當紅細胞膜蛋白及膜脂質(zhì)有缺時，它們在細胞膜蛋白及膜脂質(zhì)有缺時，它們在pH6.85pH6.85的甘油緩沖液的甘油緩沖液中比正常紅細胞溶解速度快，導致紅細胞懸液的吸光度降中比正常紅細胞溶解速度快，導致紅細胞懸液的吸光度降至至5050的時間（的時間（AGLT50AGLT50）明顯縮短。正常人）明顯縮短。正常人AGLT50AGLT50290s290s遺傳性球形紅細胞增多癥遺傳性球形紅細胞增多癥AGLT50AGLT50

25、明顯縮短（明顯縮短（2525150s150s）。自身）。自身免疫性溶血性貧血、腎功能衰竭、妊娠等免疫性溶血性貧血、腎功能衰竭、妊娠等AGLT50AGLT50也可縮短。也可縮短。五、高滲冷溶血試驗五、高滲冷溶血試驗在高滲狀態(tài)下，溫度驟然變化影響紅細在高滲狀態(tài)下，溫度驟然變化影響紅細胞膜脂質(zhì)的流動性，并可能累及膜磷脂與膜骨架蛋白結(jié)合胞膜脂質(zhì)的流動性，并可能累及膜磷脂與膜骨架蛋白結(jié)合位點，紅細胞容易破裂而發(fā)生溶血。當膜蛋白缺陷致膜表位點，紅細胞容易破裂而發(fā)生溶血。當膜蛋白缺陷致膜表面積與體積比值降低，溶血率明顯增加。而膜表面積與體面積與體積比值降低，溶血率明顯增加。而膜表面積與體積比值增加，溶血率降

26、低。高滲冷溶血試驗積比值增加，溶血率降低。高滲冷溶血試驗（hyperosmotic cold hemolysis testhyperosmotic cold hemolysis test）即測定紅細胞在）即測定紅細胞在不同濃度的高滲緩沖液中，從不同濃度的高滲緩沖液中，從3737水浴立即置于水浴立即置于00水浴一水浴一定時間的最大溶血率。定時間的最大溶血率。9mmol9mmolL L或或12mmol12mmolL L蔗糖蔗糖 最大溶血率最大溶血率66.566.574.174.17mmol7mmolL L蔗糖蔗糖 大溶血率大溶血率0.10.116.916.9遺傳性球形紅細胞增多癥明顯增加。遺傳性球

27、形紅細胞增多癥明顯增加。珠蛋白生成障礙性貧血和異常血紅蛋白病明顯降低。珠蛋白生成障礙性貧血和異常血紅蛋白病明顯降低。自身免疫性溶血性貧血基本正常。自身免疫性溶血性貧血基本正常。2 2、參考值：、參考值： 六、紅細胞膜蛋白電泳分析六、紅細胞膜蛋白電泳分析將制備的紅細胞膜樣品進行將制備的紅細胞膜樣品進行SDSSDSPAGE(SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠) )電泳，根據(jù)樣品中各蛋白相對分子質(zhì)電泳，根據(jù)樣品中各蛋白相對分子質(zhì)量的不同，分離得到紅細胞膜蛋白的電泳圖譜，從而可見各膜蛋量的不同，分離得到紅細胞膜蛋白的電泳圖譜，從而可見各膜蛋白組分百分率。白組分百分率。各種膜蛋白組分

28、百分率變化較大，多以正常紅細胞膜蛋白電泳圖各種膜蛋白組分百分率變化較大，多以正常紅細胞膜蛋白電泳圖譜作比較；或以帶譜作比較；或以帶3 3蛋白為基準，各膜蛋白含量以與帶蛋白為基準，各膜蛋白含量以與帶3 3蛋白的比蛋白的比例表示。例表示。許多溶血性疾病常見紅細胞膜蛋白異常。各種膜缺陷疾病如遺傳許多溶血性疾病常見紅細胞膜蛋白異常。各種膜缺陷疾病如遺傳性球形紅細胞增多癥有收縮蛋白等含量減低或結(jié)構(gòu)異常。某些血性球形紅細胞增多癥有收縮蛋白等含量減低或結(jié)構(gòu)異常。某些血紅蛋白病骨架蛋白等可明顯異常。紅蛋白病骨架蛋白等可明顯異常。一、高鐵血紅蛋白還原試驗一、高鐵血紅蛋白還原試驗在血液中加入亞硝酸鹽使紅細胞中的在

29、血液中加入亞硝酸鹽使紅細胞中的亞鐵血紅蛋白變成高鐵血紅蛋白，正常紅細胞的亞鐵血紅蛋白變成高鐵血紅蛋白，正常紅細胞的G G6 6PDPD催化催化戊糖旁路使戊糖旁路使NADPNADP變成變成NADPHNADPH，其脫的氫通過亞甲藍試劑的遞氫，其脫的氫通過亞甲藍試劑的遞氫作用而使高鐵血紅蛋白（作用而使高鐵血紅蛋白（FeFe3 3）還原成亞鐵血紅蛋白（）還原成亞鐵血紅蛋白（FeFe2 2），），通過比色可觀察還原的多少。當通過比色可觀察還原的多少。當G G6 6PDPD缺乏時，高鐵血紅蛋缺乏時，高鐵血紅蛋白還原率下降。白還原率下降。正常人高鐵血紅蛋白還原率正常人高鐵血紅蛋白還原率7575（臍帶血（臍帶

30、血77 77 ）G G6 6PDPD缺乏時，高鐵血紅蛋白還原率下降。缺乏時，高鐵血紅蛋白還原率下降。中間缺乏（雜合子）為中間缺乏（雜合子）為31317474，嚴重缺，嚴重缺乏（半合子或純合子）乏（半合子或純合子）3030。第五節(jié)第五節(jié) 紅細胞酶缺陷的檢驗紅細胞酶缺陷的檢驗二、變性珠蛋白小體生成試驗二、變性珠蛋白小體生成試驗G G6 6PDPD缺乏的病人血樣加缺乏的病人血樣加入乙酰苯肼于入乙酰苯肼于37 37 孵孵2 24 4小時，用煌焦油藍染色觀察小時，用煌焦油藍染色觀察紅細胞中珠蛋白小體的生成情況，計算含紅細胞中珠蛋白小體的生成情況，計算含5 5個及以上珠個及以上珠蛋白小體的紅細胞的百分率。

31、正常人含蛋白小體的紅細胞的百分率。正常人含5 5個及以上珠蛋個及以上珠蛋白小體的紅細胞，一般白小體的紅細胞，一般3030。G G6 6PDPD缺乏癥常高于缺乏癥常高于4545，故可作為，故可作為G G6 6PDPD缺乏的篩缺乏的篩檢試驗。但還原型谷胱甘肽缺乏癥也增高；不穩(wěn)定血紅檢試驗。但還原型谷胱甘肽缺乏癥也增高；不穩(wěn)定血紅蛋白病含小體的細胞百分率為蛋白病含小體的細胞百分率為75758484，HbHHbH病和化病和化學物質(zhì)中毒時也增高。學物質(zhì)中毒時也增高。三、葡萄糖三、葡萄糖-6-6-磷酸脫氫酶熒光斑點試磷酸脫氫酶熒光斑點試 驗和活性測定驗和活性測定在在G-6-PDG-6-PD和和NADPNA

32、DP存在下，存在下，G-6-PDG-6-PD能使能使NADPNADP還原成還原成NADPHNADPH，后者在紫外線照射下會發(fā)出熒光。后者在紫外線照射下會發(fā)出熒光。NADPHNADPH的吸收峰在波長的吸收峰在波長340nm340nm處，可通過單位時間生成的處，可通過單位時間生成的NADPHNADPH的量來測定的量來測定G-6-PDG-6-PD活性?；钚浴ＵＨ擞泻軓姷臒晒庹Ｈ擞泻軓姷臒晒?。 G-6-PDG-6-PD缺陷者熒光很弱或無熒光；雜缺陷者熒光很弱或無熒光；雜合子或某些合子或某些G-6-PDG-6-PD變異者則可能有輕到中度熒光。正常人變異者則可能有輕到中度熒光。正常人酶活性為（酶活性為

33、（12.112.12.092.09）U/gHbU/gHb。四、丙酮酸激酶熒光斑點試驗和活性測定四、丙酮酸激酶熒光斑點試驗和活性測定在二磷酸腺苷在二磷酸腺苷（ADPADP）存在的條件下丙酮酸激酶（）存在的條件下丙酮酸激酶（pyruvate kinase pyruvate kinase ，PKPK）催化磷酸烯醇丙酮酸（催化磷酸烯醇丙酮酸（PEPPEP）轉(zhuǎn)化成丙酮酸，在輔酶）轉(zhuǎn)化成丙酮酸，在輔酶還原還原型（型（NADHNADH）存在的情況下丙酮酸被）存在的情況下丙酮酸被LDH LDH 轉(zhuǎn)化為乳酸，若標轉(zhuǎn)化為乳酸，若標記熒光于記熒光于NADHNADH上，此時有熒光的上，此時有熒光的NADHNADH變?yōu)?/p>

34、無熒光的變?yōu)闊o熒光的NADNAD。正常人丙酮酸激酶活性斑點在正常人丙酮酸激酶活性斑點在2525分鐘內(nèi)消失。分鐘內(nèi)消失。酶活性（酶活性（15.015.01.991.99）U UgHb gHb 。熒光斑點不消失或時間延。熒光斑點不消失或時間延長說明丙酮酸激酶活性缺乏，中間缺乏（雜合子）時，熒長說明丙酮酸激酶活性缺乏，中間缺乏（雜合子）時，熒光光25256060分鐘消失，嚴重缺乏（純合子）時，熒光分鐘消失，嚴重缺乏（純合子）時，熒光6060分鐘分鐘不消失。不消失。 五、谷胱甘肽還原酶缺陷檢測五、谷胱甘肽還原酶缺陷檢測谷胱甘肽還原酶（谷胱甘肽還原酶（GRGR）催化反）催化反應(yīng)中應(yīng)中NADPHNADPH

35、轉(zhuǎn)變?yōu)檗D(zhuǎn)變?yōu)镹ADPNADP，熒光消失，通過在，熒光消失，通過在365nm365nm處觀察處觀察熒光斑點消失的時間（熒光斑點消失的時間（GRGR熒光斑點試驗）反映谷胱甘肽還熒光斑點試驗）反映谷胱甘肽還原酶的活性，或直接測定吸光度的變化（原酶的活性，或直接測定吸光度的變化（GRGR活性定量試驗）活性定量試驗）計算計算GRGR的活性的活性。GRGR熒光斑點試驗：正常人熒光斑點熒光斑點試驗：正常人熒光斑點15min15min內(nèi)消失內(nèi)消失GRGR活性定量：（活性定量：（7.177.171.091.09）U UgHbgHb谷胱甘肽還原酶缺乏時，谷胱甘肽還原酶缺乏時，GRGR熒光斑點試驗熒光斑點試驗15

36、15 分鐘以后還有熒光存在，分鐘以后還有熒光存在，GRGR活性定量試驗活活性定量試驗活性低于性低于7.17U7.17UgHb gHb 。一、紅細胞包涵體試驗一、紅細胞包涵體試驗紅細胞包涵體試驗（紅細胞包涵體試驗（Heinzbody forming test） 是將煌焦油藍液與新鮮血液一起孵育，不穩(wěn)定是將煌焦油藍液與新鮮血液一起孵育，不穩(wěn)定血紅蛋白易變性沉淀形成包涵體。血紅蛋白易變性沉淀形成包涵體。正常人（正常人（1 1）不穩(wěn)定血紅蛋白病：孵育不穩(wěn)定血紅蛋白?。悍跤? 13 3小時多數(shù)紅細胞內(nèi)可出現(xiàn)變性珠小時多數(shù)紅細胞內(nèi)可出現(xiàn)變性珠蛋白肽鏈沉淀形成的包涵體。蛋白肽鏈沉淀形成的包涵體。G G6 6

37、PDPD缺乏或紅細胞還原酶缺缺乏或紅細胞還原酶缺乏及化學物質(zhì)中毒等，紅細胞中也可出現(xiàn)包涵體。乏及化學物質(zhì)中毒等，紅細胞中也可出現(xiàn)包涵體。HbHHbH病：孵育?。悍跤? 1小時就可出現(xiàn)包涵體，也叫小時就可出現(xiàn)包涵體，也叫HbHHbH包涵體。包涵體。第六節(jié)第六節(jié) 血紅蛋白異常的檢驗血紅蛋白異常的檢驗1 1、原理：、原理： 二、血紅蛋白電泳檢測二、血紅蛋白電泳檢測血紅蛋白電泳（血紅蛋白電泳（hemoglobin electrophoresis） 是根據(jù)不同的血紅是根據(jù)不同的血紅蛋白所帶電荷不同、相對分子質(zhì)量不同，其泳動方向和速度蛋白所帶電荷不同、相對分子質(zhì)量不同，其泳動方向和速度不同，經(jīng)一定電壓和時

38、間的電泳，可分離出各自的區(qū)帶，同不同，經(jīng)一定電壓和時間的電泳，可分離出各自的區(qū)帶，同時對電泳出的各區(qū)帶進行電泳掃描，可進行各種血紅蛋白的時對電泳出的各區(qū)帶進行電泳掃描，可進行各種血紅蛋白的定量分析。定量分析。2 2、參考值：、參考值：（1 1）pH8.6TEBpH8.6TEB緩沖液醋酸纖維膜電泳。正常血紅蛋白電泳區(qū)帶：緩沖液醋酸纖維膜電泳。正常血紅蛋白電泳區(qū)帶：HbAHbA9595、HbFHbF2 2、HbAHbA2 2為為1.01.03.13.1。通過與正常人的血紅蛋白電泳圖譜進行比較，可發(fā)現(xiàn)異常血紅通過與正常人的血紅蛋白電泳圖譜進行比較，可發(fā)現(xiàn)異常血紅蛋白區(qū)帶。如蛋白區(qū)帶。如HbHHbH、

39、HbEHbE、HbBatrsHbBatrs、HbSHbS、HbDHbD和和HbCHbC等異常血等異常血紅蛋白異常。紅蛋白異常。HbAHbA2 2增多，見于增多，見于珠蛋白生成障礙性貧血，為雜合子的重要實珠蛋白生成障礙性貧血，為雜合子的重要實驗室診斷指標。驗室診斷指標。HbEHbE病時也在病時也在HbAHbA2 2區(qū)帶位置處增加，但含量很區(qū)帶位置處增加，但含量很大（在大（在1010以上）。以上）。HbAHbA2 2輕度增加亦可見于肝病、腫瘤和某些輕度增加亦可見于肝病、腫瘤和某些血液病。血液病。三、抗堿血紅蛋白檢測三、抗堿血紅蛋白檢測將待檢的溶血液與一定量的將待檢的溶血液與一定量的NaOHNaOH

40、溶液混合，溶液混合，作用作用1 1分鐘后加入半飽和硫酸銨中止堿變性反應(yīng)。胎兒血紅蛋分鐘后加入半飽和硫酸銨中止堿變性反應(yīng)。胎兒血紅蛋白（白（HbFHbF）抗堿變性作用強，沒有變性存在于上清液中，）抗堿變性作用強，沒有變性存在于上清液中，HbAHbA變變性沉淀，取上清液于性沉淀，取上清液于540nm540nm處測定吸光度，檢測出處測定吸光度，檢測出HbFHbF的濃度。的濃度。此試驗也稱為堿變性試驗，成人此試驗也稱為堿變性試驗，成人2 2；新生兒；新生兒4040HbFHbF絕對增多：珠蛋白生成障礙性貧血，重型者達絕對增多：珠蛋白生成障礙性貧血，重型者達30309090，中間型常為中間型常為5 530

41、30，輕型小于，輕型小于5 5。遺傳性胎兒血紅蛋白持。遺傳性胎兒血紅蛋白持續(xù)綜合征患者，可高達續(xù)綜合征患者，可高達100100。HbFHbF相對增多可見于骨髓纖維化、白血病、漿細胞瘤等惡性疾病相對增多可見于骨髓纖維化、白血病、漿細胞瘤等惡性疾病及再生障礙性貧血、及再生障礙性貧血、PNHPNH、卟啉病等。、卟啉病等。HbFHbF生理性增多見于孕婦和新生兒。生理性增多見于孕婦和新生兒。 四、四、HbFHbF酸洗脫法檢測酸洗脫法檢測HbFHbF具有抗堿和抗酸作用，其抗酸能力比具有抗堿和抗酸作用，其抗酸能力比HbAHbA強。將血涂片于酸性緩沖液中孵育，含強。將血涂片于酸性緩沖液中孵育，含HbFHbF的

42、紅細胞不被的紅細胞不被酸洗脫，可被伊紅染成紅色，而含酸洗脫，可被伊紅染成紅色，而含HbAHbA的紅細胞均被酸洗脫，的紅細胞均被酸洗脫，不能被伊紅著色。正常血片中含不能被伊紅著色。正常血片中含HbFHbF的著色紅細胞：成人的著色紅細胞：成人0.010.01（1 1）新生兒）新生兒0.550.550.850.85（55558585）以后漸漸下）以后漸漸下降，降，2 2歲后幼兒歲后幼兒0.020.02（2 2）孕婦可有輕度增加。著色細胞）孕婦可有輕度增加。著色細胞增加：珠蛋白合成障礙性貧血重型患者大多數(shù)紅細胞染成紅增加：珠蛋白合成障礙性貧血重型患者大多數(shù)紅細胞染成紅色；輕型患者可見少數(shù)染成紅色的細胞

43、；遺傳性胎兒血紅蛋色；輕型患者可見少數(shù)染成紅色的細胞；遺傳性胎兒血紅蛋白持續(xù)綜合征紅細胞均為紅色白持續(xù)綜合征紅細胞均為紅色。五、異丙醇沉淀試驗五、異丙醇沉淀試驗不穩(wěn)定血紅蛋白較正常血紅蛋白更容易裂不穩(wěn)定血紅蛋白較正常血紅蛋白更容易裂解，在異丙醇這種能降低血紅蛋白分子內(nèi)部氫鍵的非極性溶解，在異丙醇這種能降低血紅蛋白分子內(nèi)部氫鍵的非極性溶劑中，不穩(wěn)定血紅蛋白更快地沉淀。通過觀察血紅蛋白液在劑中，不穩(wěn)定血紅蛋白更快地沉淀。通過觀察血紅蛋白液在異丙醇中的沉淀現(xiàn)象對不穩(wěn)定血紅蛋白進行篩檢。正常人血異丙醇中的沉淀現(xiàn)象對不穩(wěn)定血紅蛋白進行篩檢。正常人血紅蛋白液為陰性（紅蛋白液為陰性（3030分鐘內(nèi)不沉淀）分

44、鐘內(nèi)不沉淀）不穩(wěn)定血紅蛋白存在時，常于不穩(wěn)定血紅蛋白存在時，常于5 5分鐘時出現(xiàn)沉淀，分鐘時出現(xiàn)沉淀，2020分鐘開始出分鐘開始出現(xiàn)絨毛狀沉淀。血液中含有較多現(xiàn)絨毛狀沉淀。血液中含有較多HbFHbF、HbHHbH、HbEHbE時也可出現(xiàn)陽時也可出現(xiàn)陽性結(jié)果。性結(jié)果。六、熱變性試驗六、熱變性試驗熱變性試驗（熱變性試驗（heat instability test）是根據(jù)不穩(wěn)）是根據(jù)不穩(wěn)定血紅蛋白比正常血紅蛋白更容易遇熱變性，觀察血紅蛋白定血紅蛋白比正常血紅蛋白更容易遇熱變性，觀察血紅蛋白液在液在5050時是否出現(xiàn)沉淀，對不穩(wěn)定血紅蛋白進行篩檢。時是否出現(xiàn)沉淀，對不穩(wěn)定血紅蛋白進行篩檢。正常人熱沉淀

45、的血紅蛋白正常人熱沉淀的血紅蛋白1 1血紅蛋白沉淀率增加，說明不穩(wěn)定血紅蛋白存在。血紅蛋白沉淀率增加，說明不穩(wěn)定血紅蛋白存在。七、聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測七、聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測尿素或?qū)β裙郊姿崮芷茐难蛩鼗驅(qū)β裙郊姿崮芷茐难t蛋白的空間紅蛋白的空間結(jié)構(gòu)，血紅蛋白的珠蛋白可被裂解成肽鏈亞結(jié)構(gòu)，血紅蛋白的珠蛋白可被裂解成肽鏈亞單位，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳可分離出各單位，通過聚丙烯酰胺凝膠電泳可分離出各肽鏈區(qū)帶。正常血紅蛋白肽鏈區(qū)帶。正常血紅蛋白HbAHbA裂解后出現(xiàn)裂解后出現(xiàn)、HbAHbA、HbA2HbA2和和四條帶。四條帶。本試驗若有異常血紅蛋白肽鏈的區(qū)帶出現(xiàn)，本試驗若有異常血紅蛋白肽鏈的

46、區(qū)帶出現(xiàn)，表示有異常血紅蛋白存在。對珠蛋白生成障表示有異常血紅蛋白存在。對珠蛋白生成障礙性貧血的診斷和鑒別有參考價值。礙性貧血的診斷和鑒別有參考價值。2 2、參考值：、參考值： 正常人：陰性正常人：陰性一、酸化血清溶血試驗一、酸化血清溶血試驗酸化血清溶血試驗，也稱酸化血清溶血試驗，也稱Hams test ，即紅細即紅細胞在酸性（胞在酸性（pH6.4pH6.46.56.5）的正常血清中孵育，）的正常血清中孵育，補體被激活，補體被激活，PNHPNH紅細胞破壞而產(chǎn)生溶血。而紅細胞破壞而產(chǎn)生溶血。而正常紅細胞不被溶解，無溶血現(xiàn)象。本試驗陽性主要見于正常紅細胞不被溶解，無溶血現(xiàn)象。本試驗陽性主要見于PNHPNH，某些自身免疫性血性貧血發(fā)作嚴重時可呈陽性。某些自身免疫性血性貧血發(fā)作嚴重時可呈陽性。第七節(jié)第七節(jié) PNHPNH的檢驗的檢驗1 1、原理：、原理： 二、蔗糖溶血試驗二、蔗糖溶血試驗蔗糖溶血試驗（蔗糖溶血試驗（sucrose hemolysis test）是根據(jù)）是根據(jù)