動物胚胎工程復習資料(共7頁)

1、精選優(yōu)質文檔-傾情為你奉上補充內容：一動物細胞培養(yǎng)（animal cell culture）就是從動物機體中取出相關的組織，將它分散成單個細胞（使用胰蛋白酶或膠原蛋白酶）然后，放在適宜的中，讓這些和增殖。動物細胞培養(yǎng)的條件1.無菌、無毒的環(huán)境：對培養(yǎng)液和所有培養(yǎng)用具進行無菌處理，通常還要在培養(yǎng)液中加入一定量的的抗生素，以防被污染。此外應定期更換培養(yǎng)液，以便清除代謝產物防止細胞代謝產物累積對細胞自身產生危害。2.營養(yǎng)物質：無機物（無機鹽、微量元素等），有機物（糖、氨基酸、促生長因子等）3.血清和血漿 (提供細胞生長必須的營養(yǎng)成份)4.和（36.50.5，7.27.4）5.氣體環(huán)境（95%的空氣+

2、5%CO 2的混合氣體）其中5%CO2氣體是為保持培養(yǎng)液的pH穩(wěn)定體外細胞培養(yǎng)所需營養(yǎng)物質與體內基本相同，例如，需要、促生長因子、微量元素等。將細胞所需的上述物質按其種類和所需數量嚴格配制而成的培養(yǎng)基，稱為。由于動物細胞生活的內環(huán)境還有一些成分尚未研究清楚，所以需要加入動物血清以提供一個類似生物體內的環(huán)境，因此在使用合成培養(yǎng)基時，通常需加入血清、血漿等一些天然成分?；具^程取動物胚胎或幼齡動物器官、組織。將材料剪碎，并用胰蛋白酶（或用膠原蛋白酶）處理（消化），形成分散的單個細胞，將處理后的細胞移入培養(yǎng)基中配成一定濃度的細胞懸浮液。懸液中分散的細胞很快就貼附在瓶壁上，成為細胞貼壁。當貼壁生長到互

3、相接觸時，細胞就會停止分裂增殖，出現。此時需要將出現的細胞重新使用胰蛋白酶處理。再配成一定濃度的細胞懸浮液。另外，原代培養(yǎng)就是從取出后立即進行的細胞、組織培養(yǎng)。當細胞從動植物中生長遷移出來，形成并增大以后，科學家接著進行，即將原代培養(yǎng)細胞分成若干份，接種到若干份培養(yǎng)基中，使其繼續(xù)生長、增殖。通過一定的選擇或純化方法，從物或細胞系中獲得的具有特殊性質的細胞稱為。當培養(yǎng)超過50代時，大多數的細胞已經衰老死亡，但仍有部分細胞發(fā)生了遺傳物質的改變出現了無限傳代的特性，即癌變。此時的稱為。方法消化法 消化分離的方法是最基本的方法，在該方法的基礎上，可進一步分離不同細胞。的方法各室不同，所采用的消化酶也不

4、相同（如，透明質酶等）。1、器材：將孕鼠或新生小鼠拉頸椎致死，置75%酒精泡23秒鐘（時間不能過長、以免酒精從口和肛門浸入體內）再用消毒腹部，取胎鼠帶入超凈臺內（或將新生小鼠在超凈臺內）解剖取肝臟，置平皿中。2、用Hanks液洗滌三次，并剔除脂肪，結締，血液等雜物。3、用手術剪將肝臟剪成小塊（1mm2），再用Hanks液洗三次，轉移至小青霉素瓶中。4、視塊量加入56倍的0.25%胰酶液，37中消化2040分鐘，每隔5一次，或用吹打一次，使。5、加入35ml培養(yǎng)液以終止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制劑）。6、靜置510分鐘，使未分散的塊下沉，取懸液加入到中。7、1000rpm，離心10分鐘，棄。8

5、、加入Hanks液5ml，沖散細胞，再離心一次，棄上清液。9、加入培養(yǎng)液l2 ml（視細胞量），計數。10、將細胞調整到5105/ml左右，轉移至25ml細胞中，37下培養(yǎng)。組織塊法 自上方法第3步后，將塊轉移到，貼附與瓶底面。翻轉瓶底朝上，將培養(yǎng)液加至瓶中，培養(yǎng)液勿接觸塊。于37靜置35小時，輕輕翻轉，使浸入培養(yǎng)液中（勿使組織漂起），37繼續(xù)培養(yǎng)。分類根據細胞種類：原代細胞培養(yǎng)， 傳代細胞培養(yǎng)原代培養(yǎng)是指直接從機體取下細胞、和器官后立即進行培養(yǎng)。因此，較為嚴格地說是指成功之前的培養(yǎng)，此時的細胞保持原有細胞的基本性質，如果是正常細胞，仍然保留二倍體數。但實際上，通常把第一代至第十代以內的培養(yǎng)細

6、胞統稱為原代細胞培養(yǎng)。最常用的原代培養(yǎng)有塊培養(yǎng)和分散細胞培養(yǎng)。傳代培養(yǎng)中的細胞傳代培養(yǎng)（subculture），當原代培養(yǎng)成功以后，隨著培養(yǎng)的延長和細胞不斷分裂，一則細胞之間相互接觸而發(fā)生接觸性抑制，生長速度減慢甚至停止；另一方面也會因營養(yǎng)物不足和積累而不利于生長或發(fā)生中毒。此時就需要將分割成小的部分，重新接種到另外的培養(yǎng)（瓶）內，再進行培養(yǎng)。這個過程就稱為傳代（passage）或者再培養(yǎng)（subculture）。對單層培養(yǎng)而言，80%匯合或剛匯合的細胞是較理想的傳代階段。原代細胞：將動物各種組織從機體中取出，經各種酶(常用胰蛋白酶)、螯合劑(常用EDTA) 或機械方法處理，分散成單細胞，在合

7、適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞得以生存、生長和繁殖，這一過程稱原代培養(yǎng)。培養(yǎng)的細胞為正常的動物細胞，一般培養(yǎng)3-5代后不再增殖，死亡。傳代細胞：傳代培養(yǎng)是細胞培養(yǎng)常規(guī)保種方法之一，也是所有細胞生物學實驗的基礎。當細胞在培養(yǎng)瓶中長滿后就需要將其稀釋分種成多瓶，細胞才能繼續(xù)生長，這一過程就叫傳代。傳代培養(yǎng)可獲得大量供實驗所需細胞。細胞傳代要在嚴格的無菌條件下進行，每一步都需要認真仔細地無菌操作。培養(yǎng)的細胞為癌變或人為癌化的細胞，理論上可以無限增殖。癌化的方式有很多：進行癌基因突變，感染病毒，從癌癥供體體內分離，物理或化學方法（如紫外，化學試劑）等。2 根據培養(yǎng)方式：貼壁細胞培養(yǎng)，半懸浮細胞培養(yǎng)，懸浮細胞

8、培養(yǎng)細胞轉染細胞技術是指將外源分子如DNA，RNA等導入真核細胞的技術。隨著分子生物學和細胞生物學研究的不斷發(fā)展，轉染已經成為研究和控制真核細胞基因功能的常規(guī)工具。在研究基因功能、調控基因表達、突變分析和蛋白質生產等生物學試驗中，其應用越來越廣泛。方法：ppt二胚胎發(fā)育精子發(fā)生血睪屏障是動物睪丸中血管和精細管之間的物理屏障。 一屏障是由精細管支持細胞塞爾托利氏細胞（Sertoli Cell）之間的緊密連接形成。它為精原細胞提供營養(yǎng)。血睪屏障防止細胞毒性物質（對細胞有毒的個體或物質）進入精細管。作用：形成免疫屏障。因為精子是一種抗原，血睪屏障能夠阻擋精子的抗原性，不讓身體產生抗精子的抗體，避免發(fā)

9、生自身免疫反應。 防止有害物質干擾精子發(fā)生和損害已形成的精子。 為精子產生創(chuàng)造良好環(huán)境，保證精子發(fā)生有一個正常的微環(huán)境。 睪丸的支持細胞是血睪屏障組成的一個重要結構，睪丸的支持細胞，分布在各期生精細胞之間，呈錐體形，底部較寬，貼附于基膜，頂部狹窄，伸入管腔。細胞頂部和側壁形成許多凹陷，其中鑲嵌著生精細胞。細胞核呈不規(guī)則形，染色淺，核仁明顯。相鄰的支持細胞基部側突相接，兩側細胞膜形成緊密連接。此連接位于精原細胞上方，可阻擋間質內的一些大分子物質穿過曲細精管上皮細胞之間的間隙進入管腔，因而起到屏障作用。全部精子發(fā)生過程可以被分為 3 個過程：位于的基底部，分為 A 、 B 兩種類型。 A 型進一步

10、分為 Ad 型和 Ap 型精原細胞。在正常情況下， Ad 型不發(fā)生任何有絲分裂，應該被視為精子發(fā)生的； Ap 型精原細胞則通常為兩個 B 型精原細胞。 B 型分裂增殖為，隨后，初級精母細胞開始 DNA 合成過程。精母細胞經歷了的不同階段。時 RNA 的合成十分活躍。的結果產生單倍體生精細胞，又稱。在精子生發(fā)過程中，是一個非常關鍵的過程，在這個階段，相互重組、染色體數目減少并最終形成。次級精母細胞產生于第一次后。這些生精細胞含有雙份單倍體染色體。在第二次精母細胞演變?yōu)閱伪扼w的。第一次前期大概持續(xù) 1 3 周，而除此之外的第一次的其他階段和第二次減數分裂在 1 2 天之內完成。第二次減數分裂后形成

11、，是沒有減數分裂活性的圓形細胞。圓形的經過復雜的顯著變化轉變?yōu)椴煌L度的精子細胞和精子。在第二次中，細胞核發(fā)生的聚縮和塑性，同時鞭毛形成和胞漿明顯擴張。全部變形的過程稱為精子形成。卵子發(fā)生卵子發(fā)生(oogenesis)從胚胎發(fā)育早期開始，經過胚胎期、出生、直至性成熟才完成。具體變化為，由形成到(oogonia)，再由卵原細胞形成成熟的過程。變化過程1原始生殖細胞的起源與遷移（primordial germ cells，PGCs）在尾端部形成，后到達內胚層，隨后以阿米巴樣運動遷移到胚胎兩側的上皮內。遷移過程中PGCs不斷分裂增殖。2卵原細胞的形成PGCs進一步遷移到未分化性腺的原始皮質中，與其他

12、生殖一起形成原始性索。之后PGCs發(fā)生形態(tài)學變化轉化為，并進入卵原細胞的增殖期(proliferation phase)，在該期，卵原細胞通過有絲分裂增加細胞數量。3初級卵母細胞的形成和原始卵泡發(fā)生卵原到一定時期，有些細胞開始進入第一次的成為初級卵母細。初級卵母細胞從經、到達后被打斷，此時卵母細胞的核較大，成為（germinal vesicle），并處于靜止狀態(tài)。此時卵母細胞周圍包有一層扁平的前，形成，并由他們形成初級卵泡。此后卵泡進入生長和，而卵母細胞在卵泡內生長發(fā)育直至成熟排卵。受精：精子與融合成為受精卵的過程，叫做受精作用。在受精作用進行時，通常是精子的頭部進入。尾部留在外面。緊接著，在

13、細胞膜的外面出現一層特殊的膜，以阻止其他精子再進入。精子的頭部進入后不久，里面的就與卵細胞的細胞核相遇，使彼此的染色體會合在一起。這樣，受精卵中的染色體數目又回復到體細胞中的數目，其中有一半的染色體來自（父方），另一半來自（母方）。受精過程大致是：需發(fā)育至第二次分裂中期才具備受精能力。的精子與該時期的次級卵母細胞相遇后。發(fā)生，釋放出頂體酶，溶解細胞間的物質，形成一條通道。隨后，與接觸，在透明帶中再次溶出一條孔道。精子通過溶解出的兩條通道與接觸，立即發(fā)生以妨礙其他精子通過透明帶，這是防止多個精子進入的第一道屏障。精子與卵黃膜接觸后，被其表面大量的抱合，隨后，精子外膜與卵黃膜發(fā)生融合（利用了細胞膜

14、的流動性這一特征），精子的尾脫落，進入卵細胞。精子入卵后，卵細胞隨即發(fā)生卵黃膜封閉作用（是阻止的第二道屏障）并被激活進行減數第二次分裂，排出。同時發(fā)生的還有，精子的細胞核核膜破裂，重新形成一個更大的細胞核，稱雄原核。減數第二次分裂后的卵細胞形成的細胞核，稱雌原核（通常雄原核比雌原核大）。兩原核相互靠近并彼此融合，最后則形成了一個二倍體（對人和大多數哺乳動物而言），受精過程基本完成。注：受精過程在輸卵管中完成。卵裂：與卵子結合之后會形成受精卵，由于卵黃的分布具有不對稱的特性，因此受精卵可以分為（會發(fā)展成外胚層）和（會發(fā)展成中胚層與內胚層）。在卵裂時期，會先分裂成兩個細胞，之后細胞通常會逐次倍增，

15、但是對哺乳類而言，有時候會有不同時分裂并造成只有奇數個細胞的現象。在這個階段，胚胎的總體積大致不變。細胞分裂成16到32個細胞的階段，稱為桑椹胚（morula），在這個階段，動物極的分裂頻率會超越靠近植物極且具有的細胞群。到了32個以上細胞數目的階段，稱為囊胚（blastula），囊胚內部靠近動物極的區(qū)域會形成一個囊胚腔。體外受精體外受精(In Vitro Fertilization)或（external fertilization）是指的和在體外人工控制的環(huán)境中完成受精過程的技術，英文簡稱為。由于它與(ET)密不可分，又簡稱為。在生物學中，把體外受精到母體后獲得的動物稱(test-tube

16、animal)。這項技術成功于20世紀50年代，在最近20年發(fā)展迅速，現已日趨成熟而成為一項重要而常規(guī)的動物生物技術引。三核移植核移植是將供體細胞核移入的卵母中，使后者不經穿透等有性過程即可被激活、分裂并，讓核供體的得到完全復制。培養(yǎng)一段時間后，在把發(fā)育中的卵母細胞移植到人或動物體內的方法。核移植的細胞來源主要分為：供體細胞來源和受體細胞的來源兩種。核移植主要用于細胞移植和異種器官移植，細胞移植可以治療由于細胞功能缺陷所引起的各種疾病。1 培養(yǎng)的動物細胞一般當傳代至1050代左右時，部分細胞核型可能會發(fā)生變化，其細胞遺傳物質可能會發(fā)生突變，而10代以內的細胞一般能保持正常的二倍體核型。因此，在

17、體細胞核移植中，為了保證供體細胞正常的遺傳基礎，通常采用傳代10代以內的細胞。2用M中期卵母細胞做受體細胞原因： 細胞體積大,易于操作; 含有促進細胞核全能性表達的物質和 營養(yǎng)條件。 為使核移植的胚胎或動物的遺傳物質全部來自有重要利用價值的動物提供的體細胞，在供體細胞的細胞核移至受體細胞之前，必須將受體細胞的遺傳物質去掉或將其破壞。3 4 5克隆先將含有遺傳物質的供體細胞的核移植到去除了細胞核的卵細胞中，利用微電流刺激等使兩者融合為一體，然后促使這一新細胞分裂繁殖發(fā)育成胚胎，當到一定程度后，再被植入動物中使動物懷孕，便可產下與提供細胞核者基因相同的動物。這一過程中如果對供進行，那么無性繁殖的動

18、物后代基因就會發(fā)生相同的變化。 克隆技術不需要雌雄交配，不需要精子和卵子的結合，只需從動物身上提取一個單細胞，用人工的方法將其培養(yǎng)成胚胎，再將雌性動物體內，就可孕育出新的個體。這種以出來的克隆動物，具有與單細胞供體完全相同的特征，是單細胞供體的“復制品”。治療性克?。╰herapeutic cloning）治療性克隆指把患者植體細胞移到去核中形成重組胚，把重組胚體外培養(yǎng)到，然后從囊胚內分離出ES細胞，獲得的ES細胞使之定向分化為所需的特定細胞類型(如，和），用于替代療法。這種方法的最終目的是用于，而非得到克隆個體。運用技術獲得人體早期胚胎，但目的不是將胚胎培育成人，而是為了提取全能型的胚胎，然

19、后在合適的條件下，使其發(fā)育成為人體的任何一個，包括大腦、肌肉、血液和神經，這些器官組織將用于醫(yī)療。目前治療性克隆已獲得不少國家的默許。生殖性克?。╮eproductive cloning）就是以產生新個體為目的的克隆。即用生殖技術制造完整的克隆人。目的是產生一個獨立生存的個體。于此相對的是研究性克隆或醫(yī)學性克隆，指的是產生研究所用的克隆細胞。不產生可獨立生存的個體。，真的如里的魔鬼一樣可怕嗎？實際上，人們不能接受實驗的最主要原因，在于傳統倫理道德觀念的阻礙。千百年來，人類一直遵循著方式，而卻是實驗室里的產物，是在人為操縱下制造出來的生命。尤其在西方，“拋棄了上帝，拆離了亞當與夏娃”的克隆，更是

20、遭到了許多宗教組織的反對。而且，與被克隆人之間的關系也有悖于傳統的由血緣確定親緣的倫理方式。所有這些，都使得無法在人類傳統倫理道德里找到合適的安身之地。但是，正如中科院院士所言：“出現的倫理問題應該正視，但沒有理由因此而反對科技的進步”。人類社會自身的發(fā)展告訴我們，科技帶動人們的觀念更新是歷史的進步，而以陳舊的觀念來束縛科技發(fā)展，則是僵化。歷史上輸血技術、器官移植等，都曾經帶來極大的倫理爭論，而當首位試管嬰兒于1978年出生時，更是掀起了軒然大波，但現在，人們已經能夠正確地對待這一切了。這表明，在科技發(fā)展面前不斷更新的思想觀念并沒有給人類帶來災難，相反地，它造福了人類。就克隆技術而言，“治療性

21、克隆”將會在生產移植器官和攻克疾病等方面獲得突破，給生物技術和醫(yī)學技術帶來革命性的變化。比如，當你的女兒需要骨髓移植而沒有人能為她提供；當你不幸失去5歲的孩子而無法擺脫痛苦；當你想養(yǎng)育自己的孩子又無法生育也許你就能夠體會到克隆的巨大科學價值和現實意義。治療性克隆的研究和完整的實驗之間是相輔相成、互為促進的，治療性克隆所指向的終點就是完整克隆人的出現，如果加以正確的利用，它們都可以而且應該為人類社會帶來福音。四RNA 沉默(RNA silencing)或基因沉默(gene silencing)是廣泛存在于植物、動物、線蟲和真菌等真核生中的一種高度保守的、序列特異的 RNA 降解機制. RNA 沉

22、默對于調控發(fā)育、維持基因組的穩(wěn)定性以響應生物和非生物脅迫等具有重要作用.作用植物可利用 PTGS 和 TGS 來抵抗病毒侵染, 病毒侵染植物后會產生大量病毒來源的小 RNA (virus-derived small interfering RNAs, vsiRNA), 介導對病毒 RNA 的降解或抑制病毒基因的轉錄; 而在與植物長期共進化過程中, 病毒編碼一個或多個RNA沉默抑制子(viral suppressor of RNA silencing, VSR)來抑制植物的基因沉默, 從而逃脫植物的這種防衛(wèi)反應. 近年來, 針對病毒基因沉默抑制子作用機制的研究表明, 病毒編碼的基因沉默抑制子通過

23、與植物基因沉默通路中的RNA或者關鍵蛋白分子相互作用, 抑制植物對病毒的抵抗, 干擾植物正常的基因表達調控. 深入了解 vsiRNAs 的起源與組成、調控基因表達的潛力, 以及病毒編碼的基因沉默抑制子的作用機制, 將有助于我們更好地了解植物與病毒之間是通過怎樣復雜的相互作用來實現共同進化的, 進而為植物病毒控制提供新的策略.五轉基因動物乳腺生物反應器是基于轉基因技術平臺，使外源基因導入動物基因組中并定位表達于動物乳腺，利用動物乳腺天然、高效合成并的能力，在動物的乳汁中生產一些具有重要價值產品的轉基因動物的總稱?，F有的應用于動物乳腺生物反應器制備的轉基因技術主要有：1 顯微注射法2 逆轉錄病毒介

24、導法3 配子介導法4 胚胎干細胞（ES）介導法5 核移植介導法還有利用同源重組原理發(fā)展起來的基因打靶（敲除）技術，結合體細胞克隆，正成為動物乳腺生物反應器制備的新研究熱點。轉基因技術（Genetically Modified，簡稱GM），是指運用手段，將轉入特定生物中，并最終獲取具有特定性狀個體的技術。轉基因技術的理論基礎來源于分子生物學?；蚱蔚膩碓纯梢允翘崛√囟ㄖ兴枰模部梢允呛铣芍付ㄐ蛄械钠?。基因片段被轉入特定生物中，與其本身的基因組進行，再從重組體中進行數代的人工選育，從而獲得具有特定的遺傳個體。該技術可以使重組生物增加人們所期望的新性狀，培育出新品種。轉基因過程(1)從生物復

25、雜的基因組中,分離出帶有目的基因的片段；或者人工合成目的基因。(2)在體外, 將帶有的DNA片段連接到能夠自我復制并具有選擇標記的載體分子上， 形成重組DNA分子。(3)將重組DNA分子引入到受體細胞(亦稱或寄主細胞) 。(4)帶有的細胞擴增，獲得大量的細胞繁殖體。(5)從大量的細胞繁殖群體中，篩選出具有重組DNA分子的。(6)將選出的細胞克隆的目的基因進一步研究分析,并設法使之實現的表達。載體（vector） ，指在基因工程重組DNA技術中將DNA片段（）轉移至受體的一種能的。三種最常用的載體是細菌、和動。必備條件在宿主細胞中能保存下來并能大量復制，且對無害，不影響受體細胞正常的生命活動。有多個切點，而且每種酶的切點最好只有一個，如pBR322就有多種限制酶的單一識別位點，可適于多種限制酶切割的DNA插入。含有復制起始位點，能夠獨立復制；通過進行基因擴增，否則可能會使重組DNA丟失。有一定的，便于進行篩選。如的pBR322質粒攜帶氨芐和四環(huán)素抗性基因，就可以作為篩選的標記基因。一般來說，天然運載體往往不能滿足上述要求，因此需要根據不同的目的和需要，對運載體進行人工改建?，F在所使用的幾乎都是經過改建的。載體分子大小應合適，以便操作?；蚩寺〉妮d體類型：，M