-HDN實驗設計實驗報告(新版)

1、臨床輸血與檢驗創(chuàng)新性實驗設計二級學院：檢驗學院 教研室：臨床檢驗學實驗名稱母嬰Rh血型不合的新生兒溶血病檢查的實驗設計專業(yè)：醫(yī)學檢驗層次：本科年級：2009小班：課題組主要成員姓名性別學號備注王千慧女？林日娟女10203070229鐘曉女10203070230陳遠曉女10203070232盧雪如女217盧宇東男10203070？周 杰男10203070？朱虹亮男233周偉澤男10203070？新生兒溶血病是由于母嬰血型不合，胎兒紅細胞進入母體循環(huán)致使母體產生了相應的IgG類抗體。該抗體作用于胎兒紅細胞而引起的同種被動免疫性疾病。HDN可引起嬰兒貧血、黃疸、水腫、肝脾腫大，嚴重者可導致膽紅素腦病

2、，引起新生兒死亡或智力發(fā)育障礙。因此，對HDN進行早期、準確的診斷有重要意義。新生兒溶血病的患兒血清學檢測主要是“三項試驗”，即：直接抗球蛋白試驗(DAT)；血清游離抗體測定試驗；新生兒紅細胞抗體釋放。但由于微柱凝膠技術利用分子篩效應和親和效應，紅細胞抗原與相應的抗體結合，經離心，便可檢測血型、不完全抗體及作交叉配血試驗，具有操作簡單、結果準確、敏感且易于判讀等優(yōu)點，所以本實驗設計主要采用微柱凝膠試驗和直接、間接抗人球蛋白試驗以及相關的輔助檢查來對母嬰Rh血型不合的新生兒溶血病作出診斷。 一、實驗設計（一）標本、試劑及器材標本：靜脈血試劑：微柱凝膠試驗【抗人球蛋白凝膠微柱卡：含有抗人球蛋白（抗

3、IgG+C3），可用于檢測IgG類不完全抗體（間接抗球蛋白試驗），IgG類不完全抗體（或）補體致敏紅細胞（直接抗球蛋白試驗）】抗人球蛋白試驗【5%篩檢紅細胞（試劑紅細胞，用于間接抗人球蛋白試驗）、抗球蛋白試劑盒（商品試劑，用于直接抗人球蛋白試驗）、IgG包被的紅細胞、生理鹽水】器材：微柱凝膠試驗【微量吸樣槍、微柱凝膠檢測卡專用離心機】抗人球蛋白試驗【試管、記號筆、試管架、滴管、乳膠吸頭、吸量管、洗耳球、載玻片、離心機、顯微鏡、濾紙】（二）主要實驗 產前檢查微柱凝膠試驗 （1）檢測血型1.將受檢者紅細胞（不用洗滌）配成1%生理鹽水懸液，向已標記好的特異性凝膠微柱卡的微管反應腔內加50L。2.立即

4、與1000轉每分鐘，離心10分鐘，觀察結果3.觀察及判斷血型結果：陽性：對照管細胞沉淀在管底，檢測管凝集塊在膠上或膠中。陰性：對照管和檢測管的細胞沉淀均在管底。實驗失?。簩φ展芗毎谀z上或膠中，重新試驗。4.報告方式：Rh(D)血型陰性/陽性（2）篩檢和鑒定不完全抗體1.取篩檢紅細胞或譜細胞懸液（1紅細胞生理鹽水懸液）各50L，分別加入標記好的微管反應腔中。2.然后分別立即加入受檢血清25L。3.將已加好反應物的凝膠卡放入37度孵育15min。  4.取出凝膠卡立即以1000r/min水平離心10min，觀察結果。5.觀察及判斷血型結果：同血型檢測。6.報告方式：篩檢試驗

5、陽/陰性。間接抗人球蛋試驗1.加血請：分離父親或母親（胎兒則取羊水血型物質），取兩滴置于標記好的小試管中。2.滴加5%篩檢紅細胞1滴于小試管中，混勻。3.溫育：37度溫育30-60min。4.離心：1000r/min離心1min。 產后檢查 微柱凝膠試驗 （1）檢測血型1.將受檢者紅細胞（不用洗滌）配成1%生理鹽水懸液，向已標記好的特異性凝膠微柱卡的微管反應腔內加50L。2.立即與1000轉每分鐘，離心10分鐘，觀察結果3.觀察及判斷血型結果：陽性：對照管細胞沉淀在管底，檢測管凝集塊在膠上或膠中。陰性：對照管和檢測管的細胞沉淀均在管底。實驗失敗：對照管細胞在膠上或膠中，重新試驗。4.報告方式：

6、Rh(D)血型：（2）篩檢和鑒定不完全抗體1.取篩檢紅細胞或譜細胞懸液（1紅細胞生理鹽水懸液）各50L，分別加入標記好的微管反應腔中。2.然后分別立即加入受檢血清25L。3.將已加好反應物的凝膠卡放入37度孵育15min。  4.取出凝膠卡立即以1000r/min水平離心10min，觀察結果。5.觀察及判斷血型結果：同血型檢測。6.報告方式：篩檢試驗 陽/陰性。間接抗人球蛋試驗1.加血請：分離父親或母親血清（胎兒的則取羊水血型物質），取兩滴置于標記好的小試管中2.滴加5%篩檢紅細胞1滴于小試管中，混勻。3.溫育：37度溫育30-60min。4.離心：以1000r/min離心

7、1min5.觀察：觀察是否有溶血和凝集，并記錄結果產前檢查微柱凝膠試驗直接抗人球蛋試驗1.洗滌紅細胞：徹底懸浮細胞，用鹽水洗滌5次。最后一次洗滌后，棄掉全部鹽水，將試管邊緣鹽水用濾紙吸干。2.加抗球蛋白：按試劑說明加最適稀釋度抗人球蛋白血清1滴，充分混合。3.離心：以1000r/min離心1min4.觀察：輕輕懸浮細胞，觀察是否有溶血或凝集，有溶血或凝集為陽性，否則為陰性。5.復核：陰性者應加IgG包被的紅細胞1滴，離心并觀察結果：凝集，表示陰性結果可靠。不凝集，表示試驗無效，必須重做。（三）輔助實驗 5.觀察：是否有凝塊和溶血，并記錄結果。 產后檢測可疑Rh 等其他血型系統(tǒng)血型不合應在出生后

8、盡早為好。微柱凝膠試驗 （1）檢測血型1.將父親或母親或嬰兒紅細胞（不用洗滌）配成1%生理鹽水懸液，向已標記好的特異性凝膠微柱卡的微管反應腔內加50L。2.立即與1000轉每分鐘，離心10分鐘，觀察結果。3.觀察及判斷血型結果：陽性：對照管細胞沉淀在管底，檢測管凝集塊在膠上或膠中。陰性：對照管和檢測管的細胞沉淀均在管底。實驗失敗：對照管細胞在膠上或膠中，重新試驗。4.報告方式：Rh(D)血型陰性/陽性（2）篩檢和鑒定不完全抗體1.取篩檢紅細胞或譜細胞懸液（1紅細胞生理鹽水懸液）各50L，分別加入標記好的微管反應腔中。2.然后分別立即加入受檢血清25L。3.將已加好反應物的凝膠卡放入37度孵育1

9、5min。  4.取出凝膠卡立即以1000r/min水平離心10min，觀察結果。5.觀察及判斷血型結果：同血型檢測。6.報告方式：篩檢試驗 陽/陰性。直接抗人球蛋試驗1.洗滌紅細胞：徹底懸浮細胞，用鹽水洗滌5次。最后一次洗滌后，棄掉全部鹽水，將試管邊緣鹽水用濾紙吸干。2.加抗球蛋白：按試劑說明加最適稀釋度抗人球蛋白血清1滴，充分混勻。3.離心：1000r/min離心1min。4.觀察：輕輕懸浮細胞，觀察是否有溶血或凝集，有溶血為陽性，否則為陰性。5.復核：陰性者應加IgG包被的紅細胞1滴，離心并觀察結果：凝集：表示陰性結果可靠。不凝集：表示試驗無效，必須重做。（三）輔助實

10、驗（母親及剛出生疑有溶血胎兒或嬰兒）1.流式細胞儀檢查血常規(guī)，包括血紅蛋白、紅細胞計數、網織紅細胞計數、白細胞計數、血小板計數2.血涂片檢查細胞形態(tài)：尤其要觀察紅細胞是否有溶血及凝塊形成。3. 膽紅素測定、羊水膽紅素含量測定：膽紅素氧化酶法測定總膽紅素和結合膽紅素，特異性高，手工操作簡便快捷，也適合自動化生化分析儀操作。（四）研究內容與方法的技術路線 （以線路圖的形式簡要展示）產前檢查血型血清學檢查常規(guī)檢查產婦及其丈夫R h 血型D抗原鑒定產婦血清的不規(guī)則抗體篩選及篩選陽性者效價檢測胎兒的血型物質，確定胎兒血型（微柱凝膠試驗、間接抗人球蛋試驗）外周血常規(guī)檢查血紅蛋白、血涂片檢查、紅細胞計數、網

11、織紅細胞計數、白細胞計數、血小板計數膽紅素測定、羊水膽紅素含量測定判斷：Rh血型陽性或陰性產后檢查血型血清學檢查常規(guī)檢查產婦及其丈夫R h 血型D抗原鑒定產婦血清的不規(guī)則抗體篩選及篩選陽性者效價檢測嬰兒的血清，確定胎兒血型（微柱凝膠試驗、直接抗人球蛋試驗）外周血常規(guī)檢查血紅蛋白、血涂片檢查、紅細胞計數、網織紅細胞計數、白細胞計數、血小板計數膽紅素測定、羊水膽紅素含量測定判斷：Rh血型陽性或陰性二、 近五年參考文獻（參照檢驗醫(yī)學與臨床雜志的投稿要求）1 蘭炯采,劉景漢,馬紅麗,等.新生兒溶血病( HDN) 免疫血液學試驗推薦方案J.中國輸血雜志,2012,2(25):95-100.2 宋寧,陳靜

12、嫻,李宏.新生兒溶血病檢測/蘭炯采,贠中橋,陳靜嫻輸血免疫血液學實驗技術,北京:人民衛(wèi)生出版社,2011:45-573 潘紀春.莊遠.PAN Ji-chun.ZHUANG Yuan .新生兒溶血病血清學檢查分析J.科學技術與工程2010,10(5)4 楊珊.新生兒溶血病血清學檢測結果分析J.海南醫(yī)學.2009.20(l)139-1415 盧磊,劉燕.微柱凝膠技術在新生兒溶血病檢測中的應用J .中國現代醫(yī)生.2010.48(13)6楊秀麗.紅細胞直接抗球蛋白試驗陽性Rh血型鑒定方法J.國際檢驗醫(yī)學雜志. 2011,32(14):1609-1610.7 徐 瑋. 新生兒溶血病免疫血液學檢測進展J. 吉林醫(yī)學.2013, 34(12): 2339-2340. 三、 設計創(chuàng)新及存在問題傳統(tǒng)的試管法抗球蛋白檢查方法在手工操作中受到血清與紅細胞比例、離心速度和時間等因素的干擾，操作過程中需反復洗滌紅細胞。結果判斷人為影響因素較多，重復性較差；而且在洗滌過程中由于抗原和抗體之間的親和力較弱，抗體易被洗脫掉，易出現假陰性。微柱凝膠技術是建立在傳統(tǒng)血型血清學基礎上的一項免疫學檢測技術，是通過調節(jié)凝膠的濃度來控制凝膠間隙的大小，利