數(shù)字PCR可行性分析

1、數(shù)字PCR可行性分析數(shù)字PCR技術(shù)的原理數(shù)字PCR（Digital PCR-dPCR）技術(shù)是一種新的核酸檢測(cè)和定量方法，與傳統(tǒng)定量PCR（qPCR）技術(shù)不同，數(shù)字PCR采用絕對(duì)定量的方式，不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線和參照樣本，直接檢測(cè)目標(biāo)序列的拷貝數(shù)。由于這種檢測(cè)方式具有比傳統(tǒng)qPCR更加出色的靈敏度和特異性、精確性，dPCR迅速得到廣泛的應(yīng)用，這項(xiàng)技術(shù)在極微量核酸樣本檢測(cè)、復(fù)雜背景下稀有突變檢測(cè)和表達(dá)量微小差異鑒定方面變現(xiàn)出的優(yōu)勢(shì)已被普遍認(rèn)可，而其在基因表達(dá)研究、microRNA研究、基因組拷貝數(shù)鑒定、癌癥標(biāo)志物稀有突變檢測(cè)、致病微生物鑒定、轉(zhuǎn)基因成分鑒定、NGS測(cè)序文庫精確定量和結(jié)果驗(yàn)證等諸多方面具

2、有的廣闊應(yīng)用前景已經(jīng)受到越來越多的關(guān)注。數(shù)字PCR采用的策略概括起來非常簡(jiǎn)單，就是“分而治之”（divide and conquer）1，這種做法非常類似于計(jì)算機(jī)科學(xué)中的“分治算法”，將一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)PCR反應(yīng)分配到大量微小的反應(yīng)器中，在每個(gè)反應(yīng)器中包含或不包含一個(gè)或多個(gè)拷貝的目標(biāo)分子( DNA模板) ，實(shí)現(xiàn)“單分子模板PCR擴(kuò)增”，擴(kuò)增結(jié)束后，通過陽性反應(yīng)器的數(shù)目“數(shù)出”目標(biāo)序列的拷貝數(shù)。在實(shí)際的數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)中，事實(shí)上是通過呈現(xiàn)兩種信號(hào)類型的反應(yīng)器比例和數(shù)目進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)算出原始樣本中的模板拷貝數(shù)。圖1. 數(shù)字PCR的原理數(shù)字PCR可以直接計(jì)算目標(biāo)序列的拷貝數(shù)，因此無需依賴于對(duì)照樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲

3、線就可以進(jìn)行精確的絕對(duì)定量檢測(cè)；此外，由于數(shù)字PCR在進(jìn)行結(jié)果判讀時(shí)僅判斷有/無兩種擴(kuò)增狀態(tài)，因此也不需要檢測(cè)熒光信號(hào)與設(shè)定閾值線的交點(diǎn)，完全不依賴于Ct值的鑒定，因此數(shù)字PCR的反應(yīng)受擴(kuò)增效率的影響大大降低，對(duì)PCR反應(yīng)抑制物的耐受能力大大提高；數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)中標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系分配的過程可以極大程度上降低與目標(biāo)序列有競(jìng)爭(zhēng)性作用的背景序列濃度，因此數(shù)字PCR技術(shù)也特別適合在復(fù)雜背景中檢測(cè)稀有突變。數(shù)字PCR技術(shù)的發(fā)展歷史從原理可以看出，數(shù)字PCR與傳統(tǒng)的定量PCR兩者皆定位于同樣的平臺(tái)基礎(chǔ)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和雙鏈DNA標(biāo)記技術(shù)，但兩者采用的是完全不同的定量策略和思想方法， dPCR和qPCR并沒有實(shí)驗(yàn)

4、方法和思路上的承繼關(guān)系，從這個(gè)角度來說，目前很多人把數(shù)字PCR稱為第三代PCR技術(shù)并不準(zhǔn)確。在實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)成熟和發(fā)展之前，早在1992年，南澳洲弗林德斯醫(yī)學(xué)中心的科學(xué)家使用有限稀釋、PCR和泊松分布數(shù)據(jù)校正模型的方法（ limiting dilution, PCR and Poisson statistics），檢測(cè)了復(fù)雜背景下低豐度的IgH重鏈突變基因，進(jìn)行了極其精細(xì)的定量研究2，雖然當(dāng)時(shí)這種方法并沒有被冠以“數(shù)字PCR”之名，但已經(jīng)建立了數(shù)字PCR基本的實(shí)驗(yàn)流程，更重要的是了數(shù)字PCR檢測(cè)中一個(gè)極其重要的原則以“終點(diǎn)信號(hào)的有或無”（all-or-none end point

5、 ）作為判斷標(biāo)志，這也是之后1999年Bert Vogelstein 和 Ken Kinzler將之命名為“數(shù)字PCR”(digital PCR)的主要原因3。數(shù)字PCR技術(shù)的原理非常簡(jiǎn)單，然而在樣品分散（divide）的環(huán)節(jié)上卻遇到了無法突破的瓶頸。早期的dPCR嘗試使用96孔板到384孔板甚至1536孔板作為分散反應(yīng)的載體，或者采用類似流式技術(shù)的磁珠乳液擴(kuò)增方法(BEAMing-Beads, Emulsion, Amplification, Magnetics)，2006年 Fluidigm公司推出了第一臺(tái)商品化的基于芯片的商品化數(shù)字PCR系統(tǒng)。2008年德國 Inostics&

6、#160;推出基于磁珠法乳濁液擴(kuò)增和流式檢測(cè)方式的BEAMing dPCR 檢測(cè)服務(wù)，但這些方法無論在分散程度和數(shù)據(jù)群體的體量上都無法達(dá)到更加精細(xì)的要求，時(shí)間和耗材成本嚴(yán)重限制了dPCR技術(shù)的發(fā)展。近幾年來，隨著納米制造技術(shù)和微流體技術(shù)（nanofabrication and microfluidics）的發(fā)展，數(shù)字PCR技術(shù)遇到了突破技術(shù)瓶頸的最佳契機(jī)。1997年Kalinina, 、Brown J, 和Silver J使用納升級(jí)芯片進(jìn)行單克隆模板PCR擴(kuò)增，獲得了美國專利，更重要的是這種采用“電浸潤法”進(jìn)行納升級(jí)芯片制造技術(shù)顯露雛形4。伴隨二代測(cè)序技術(shù)發(fā)展起來的“油包水PCR”技術(shù)，可以一

7、次生成數(shù)萬乃至數(shù)百萬個(gè)納升甚至皮升級(jí)別的單個(gè)油包水微滴，可以作為dPCR的樣品分散載體。QuantaLife 利用油包水微滴生成技術(shù) 開發(fā)了微滴式數(shù)字PCR技術(shù)，這也是最早出現(xiàn)的相對(duì)成熟的數(shù)字PCR平臺(tái)，在運(yùn)行成本和實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定性方面都基本達(dá)到了商品化的標(biāo)準(zhǔn)。2011年，QuantaLife 公司被Bio-Rad公司收購，其微滴式數(shù)字PCR儀產(chǎn)品更名為QX100型號(hào)儀繼續(xù)在市場(chǎng)上銷售，這個(gè)早期型號(hào)為dPCR概念的普及和應(yīng)用領(lǐng)域的拓展發(fā)揮了重要作用。2013年該公司又推出了升級(jí)型號(hào)QX200。2012年，RainDance公司推出Raindrop型號(hào)數(shù)字PCR設(shè)備，這個(gè)設(shè)備將

8、其原有的二代測(cè)序文庫制備平臺(tái)技術(shù)平移到數(shù)字PCR技術(shù)平臺(tái)，在高壓氣體驅(qū)動(dòng)下，將每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系分割成包含100萬至1000萬個(gè)皮升級(jí)別微滴的反應(yīng)乳液， 該公司的創(chuàng)始人之一Darren Link表示這種超高的微滴數(shù)目可以為用戶“提供更高的檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍，適用于處理更大濃度差異的不同樣品” 1。2013年下半年，Life-technologies推出了QuantStudio 3D數(shù)字PCR系統(tǒng)， 這也是目前數(shù)字PCR市場(chǎng)上最新型號(hào)的產(chǎn)品。采用高密度的納升流控芯片技術(shù)，樣本均勻分配至20,000個(gè)單獨(dú)的反應(yīng)孔中。在整個(gè)工作流程中，樣本之間保持完全隔離 ，可以有效地防止樣品交叉污染，減少移液過程，簡(jiǎn)化操

9、作步驟。同時(shí)芯片式設(shè)計(jì)避免了微滴式系統(tǒng)可能面臨的管路堵塞問題5。數(shù)字PCR技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域從上世紀(jì)90年代以來qPCR技術(shù)的爆發(fā)式發(fā)展使得現(xiàn)代核酸檢測(cè)技術(shù)具有全新的面貌，而進(jìn)入二十一世紀(jì)之后，速度更快、通量更高。成本更低的DNA測(cè)序技術(shù)正在迅速發(fā)展，也是目前競(jìng)爭(zhēng)最為激烈的研究領(lǐng)域之一，即使在這種情況下，dPCR技術(shù)仍然以其高度的靈敏性和特異性在諸多科學(xué)領(lǐng)域爭(zhēng)取到屬于自己的一席之地。1. 癌癥診斷檢測(cè)研究表明，腫瘤可能通過細(xì)胞壞死及凋亡從而釋放大量的基因組DNA進(jìn)入人體系統(tǒng)循環(huán)，因此可以通過這些DNA分子的微衛(wèi)星DNA變化、易位、突變和甲基化等對(duì)癌癥進(jìn)行檢測(cè)。近年來，數(shù)字PCR技術(shù)被廣泛應(yīng)用到血液

10、、糞便等非侵入性樣本分析中，為癌癥的檢測(cè)提供新的途徑。 表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)屬于酪氨酸激酶受體，它介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、增殖和分化，大量研究表明，EGFR基因的突變或過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。Yung等6利用數(shù)字PCR技術(shù)研究非小細(xì)胞性肺癌病人血漿和腫瘤中第19外顯子框內(nèi)缺失和第21外顯子L858R突變兩種ERFR突變體，通過微流體系統(tǒng)對(duì)35份血漿樣本進(jìn)行檢測(cè)，兩種突變類型檢出率分別為17%和26%，該結(jié)果與對(duì)腫瘤樣本的測(cè)序相比，其靈敏度和特異性分別達(dá)到92%

11、與100%。隨后，Wang等7也將數(shù)字PCR檢測(cè)應(yīng)用到肺癌基因組中EGFR異常的檢測(cè)中，得出了相同的結(jié)論，即數(shù)字PCR能夠?qū)GFR突變具有靈敏的檢測(cè)與精確的定量，適用于肺癌的診斷，對(duì)預(yù)測(cè)治療反應(yīng)、監(jiān)測(cè)病情進(jìn)程及早期抗藥性診斷等提供了非常有利的分析手段。     在對(duì)結(jié)腸癌的研究中，Taly等8采集19位病人的血液樣本，通過數(shù)字PCR分析結(jié)果顯示其中14例樣本檢測(cè)到KRAS基因突變，1例檢出與腫瘤樣本不一致的突變，另外5例則檢測(cè)不到，同時(shí)其中5例BRAF V600E突變型全部檢測(cè)出來。Qi等9則利用數(shù)字PCR對(duì)直腸癌病人的糞便樣本進(jìn)行

12、mRNA定量分析，在8例病人組織和9例糞便樣本中的檢出率分別達(dá)100%和77%。2. 產(chǎn)前診斷（prenatal diagnosis） 產(chǎn)前診斷又稱宮內(nèi)診斷，是指胎兒出生前采用遺傳學(xué)和影像學(xué)等各種檢測(cè)方法預(yù)測(cè)其是否有先天性疾病，是預(yù)防染色體病患兒出生的主要措施。傳統(tǒng)的產(chǎn)前診斷采用侵入性診斷（invasive prenatal diagnosis）方法，主要包括孕中期的胎兒羊水的產(chǎn)前診斷、臍血的產(chǎn)前診斷，目前常用的取材手術(shù)主要有絨毛膜絨毛取樣，羊膜腔穿刺，臍帶血穿刺等，但這些方法對(duì)母體和胎兒均有一定的創(chuàng)傷并存在胎兒丟失風(fēng)險(xiǎn)。而非侵入性產(chǎn)前診斷(non-in

13、vasive prenatal diagnosis, NIPD)則采用了無創(chuàng)傷的技術(shù)方法避免了以上的安全威脅，成為當(dāng)下引起廣泛關(guān)注的診斷方法。1997年，Lo等采集孕婦血液進(jìn)行研究，利用PCR的方法擴(kuò)增Y染色體特異片段并出現(xiàn)陽性信號(hào)，證明母體血液中存在胎兒的DNA10，自此拉開了NIPD研究的序幕。但是，從大量母體DNA中成功檢測(cè)到胎兒游離DNA的過程中存在相當(dāng)大的難度，需要提高檢測(cè)方法的靈敏度和特異性。2007年，Lo等利用數(shù)字PCR技術(shù)發(fā)展了兩種策略用于產(chǎn)前診斷胎兒21三體綜合癥，其一稱之為digital RNA-SNP，檢測(cè)胎盤細(xì)胞特異表達(dá)即完全來

14、自胎兒的21號(hào)染色體上PLAC4 mRNA的SNP位點(diǎn)的比例；其二為digital RCD法，檢測(cè)孕婦血液中21號(hào)染色體與1號(hào)染色體的相對(duì)含量，可以檢測(cè)到血液中25%的胎兒基因11。Lun等12比較了數(shù)字PCR與實(shí)時(shí)定量PCR、質(zhì)譜檢測(cè)三者的靈敏度，發(fā)現(xiàn)數(shù)字PCR比其他兩種方法更為精確，因此，數(shù)字PCR檢測(cè)到胎兒基因的濃度可能要高于預(yù)期。隨著研究的深入，數(shù)字PCR被證明比傳統(tǒng)技術(shù)方法具有更高的臨床靈敏度和特異性，未來該技術(shù)在產(chǎn)前診斷領(lǐng)域?qū)⒃絹碓奖粡V泛地應(yīng)用。 3. 稀有突變分析在基因組變異研究領(lǐng)域，群體基因組水平上的SNP（Single Nucleotide Po

15、lymorphism，單核苷酸多態(tài)性）檢測(cè)面臨的問題主要是突變序列往往與大量正常序列同時(shí)存在，競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)嚴(yán)重影響突變序列的檢測(cè)精度，數(shù)字PCR技術(shù)帶來的極高的擴(kuò)增特異性在稀有突變檢測(cè)方面具有天然的優(yōu)勢(shì)，在癌癥標(biāo)志物檢測(cè)、無創(chuàng)產(chǎn)前檢查、線粒體突變檢測(cè)等研究方向上，我們已經(jīng)看到dPCR的許多精彩表現(xiàn)。稀有突變檢測(cè)對(duì)癌癥研究具有重大意義。原癌基因或腫瘤抑癌基因的突變累積是促進(jìn)腫瘤發(fā)生的一個(gè)重要因素。極少量體細(xì)胞的上述突變即足以促進(jìn)癌癥發(fā)生或發(fā)展。由于上述突變通常只存在于極少量的細(xì)胞中，因此需要使用具有高信噪比和低假陽性率的Assay。常用的SNP基因分型技術(shù)(如毛細(xì)管電泳或?qū)崟r(shí)熒光定量PCR)是最高

16、效的突變檢測(cè)方法，可以檢測(cè)突變率不低于20% (約五分之一細(xì)胞)的突變細(xì)胞。但是，數(shù)字PCR能夠從野生型背景中鑒別出突變基因，具有更高的靈敏度和精度。數(shù)字PCR通過將樣本分到芯片的數(shù)千個(gè)單獨(dú)的PCR反應(yīng)中，大大降低了某個(gè)反應(yīng)中的總分子數(shù)，從而有效地富集目標(biāo)序列，并稀釋了野生型背景。4. 拷貝數(shù)變異（CNV）鑒定拷貝數(shù)變異 (CNV) 是基因座的野生型拷貝數(shù)相比參考基因組增加或減少造成的基因組失衡。這些基因組改變從小的 (小于 10 kb) 插入或缺失到大的(超過1 Mb)、復(fù)雜的多等位基因復(fù)制均有。CNV 是人類基因組中最常見的遺傳變異，與多種疾病有關(guān)，包括癌癥或遺傳性疾病易感性 13, 14

17、。因此，我們需要簡(jiǎn)單可靠的方法定量CNV，用作潛在的生物標(biāo)記物，并用于了解腫瘤形成的分子機(jī)制。目前的 CNV 評(píng)估方法如表1所示。這些方法包括原位雜交，但該方法耗時(shí)、費(fèi)力且結(jié)果分析具有主觀性15。陣列比較基因組雜交 (aCGH) 可以提供更高的精度，但該方法需要大量的操作時(shí)間且分辨率取決于所需的陣列類型 16。最近，下一代測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步使得通過單次運(yùn)行即可經(jīng)濟(jì)高效地檢測(cè)多種類型的遺傳變異成為可能17。最后，在目前所有方法中，實(shí)時(shí)熒光定量和數(shù)字 PCR 技術(shù)提供了最簡(jiǎn)單的工作流程，可以獲得準(zhǔn)確的拷貝數(shù)結(jié)果，且操作時(shí)間極短，周轉(zhuǎn)時(shí)間較快。 HER2 (人表皮生長因子2，又稱為ERBB2) 是一種原

18、癌基因，在特定的情況下會(huì)促進(jìn)癌癥細(xì)胞的增殖。原癌基因促進(jìn)腫瘤發(fā)生的機(jī)制有三種：(1) 染色體重排導(dǎo)致超活性基因融合，(2) 編碼序列上的點(diǎn)突變或缺失導(dǎo)致超活性蛋白生成，(3) 基因擴(kuò)增導(dǎo)致蛋白質(zhì)過表達(dá)。HER2基因擴(kuò)增多年來一直被視作早期乳腺癌預(yù)后不佳的指標(biāo)之一，亦是選擇早期和晚期癌癥最佳治療方案的關(guān)鍵因素 (例如，使用赫賽汀Herceptin® 進(jìn)行HER2蛋白靶向治療) 目前，原位熒光雜交 (FISH) 和銀染原位雜交(SISH) 是用于預(yù)后情況和藥物有效性評(píng)估的常規(guī)方法。但是上述方法存在諸多缺點(diǎn)，包括冗長繁瑣的染色和切片制備過程、需要專業(yè)的技術(shù)培訓(xùn)、檢測(cè)成本較高。同時(shí)傳統(tǒng)方法在

19、某些具有挑戰(zhàn)性的情況下進(jìn)行結(jié)果判斷時(shí)會(huì)引入一定程度的主觀因素。皇家薩里郡醫(yī)院致力于探索采用數(shù)字 PCR (dPCR) 作為SISH的替代方法用于HER2拷貝數(shù)檢測(cè)，以改善技術(shù)和成本。數(shù)字 PCR 將樣本模板分散到眾多單獨(dú)的 PCR 反應(yīng)器中，其中一部分反應(yīng)器含有目標(biāo)分子 (已擴(kuò)增)，另一部分則不含有目標(biāo)分子 (未擴(kuò)增，稱為陰性)。PCR 擴(kuò)增后，利用陰性反應(yīng)部分計(jì)算樣本中目標(biāo)分子的絕對(duì)數(shù)量，無需參照標(biāo)準(zhǔn)品，可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo) DNA 分子的絕對(duì)定量。因此，相比目前用于評(píng)估 HER2 基因擴(kuò)增的SISH 方法，該技術(shù)能夠降低主觀性，提升標(biāo)準(zhǔn)化水平，而且可節(jié)省超過75%的成本。5. MicroRNA前體

20、定量越來越多的證據(jù)表明，microRNA是參與幾乎所有生物學(xué)過程的基本元件。成熟microRNA可介導(dǎo)microRNA依賴性的基因沉默。盡管microRNA前體是microRNA生物發(fā)生和加工的基礎(chǔ)，但現(xiàn)有的大多數(shù)檢測(cè)方法仍致力于成熟microRNA的檢測(cè)，針對(duì)microRNA前體的檢測(cè)卻很少。microRNA前體檢測(cè)面臨的挑戰(zhàn)主要?dú)w因于其較低的豐度、必須使用參照轉(zhuǎn)錄本，以及序列相似性造成的干擾。Life Technologies開發(fā)的基于硅芯片的QuantStudio 3D數(shù)字PCR系統(tǒng)可以大大提升mir-9初級(jí)前體轉(zhuǎn)錄本檢測(cè)的精確度。檢測(cè)原代神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)物中同一microRNA的3個(gè)不同的

21、前體-miR-9 (pri-miR-9-1、-2和-3)，結(jié)果顯示，采用QuantStudio 3D數(shù)字PCR系統(tǒng)可以輕松克服傳統(tǒng)microRNA前體檢測(cè)方法面臨的挑戰(zhàn)。研究證明短期和長期酒精暴露，可以觸發(fā)培養(yǎng)細(xì)胞中miR-9前體的變化。檢測(cè)可重復(fù)性極高，精度范圍為1.26-2.33%。其中一種miR-9前體嵌于蛋白質(zhì)編碼的mRNA轉(zhuǎn)錄本內(nèi)，而其他兩種前體則是長的非編碼轉(zhuǎn)錄本，這些結(jié)果說明了數(shù)字PCR (dPCR)方法的通用性。數(shù)字PCR的市場(chǎng)前景數(shù)字PCR是近年來迅速發(fā)展起來的一種定量分析技術(shù)。迄今為止,已有Fluidigm、Bio-Rad等幾家公司相繼推出了數(shù)字PCR產(chǎn)品,這些產(chǎn)品已經(jīng)在單

22、細(xì)胞分析、癌癥早期診斷和產(chǎn)前診斷等研究領(lǐng)域顯示出巨大的技術(shù)優(yōu)勢(shì)和應(yīng)用前景。根據(jù)全球知名咨詢公司Frost & Sullivan的研究分析師Karolina Olszewska表示：“dPCR的高靈敏度讓它成為多個(gè)應(yīng)用的理想選擇，包括拷貝數(shù)變異、稀有突變檢測(cè)以及核酸序列的絕對(duì)定量。數(shù)字PCR因其精確性、重復(fù)性以及在診斷和制藥應(yīng)用上的潛力而引起了行業(yè)的極大關(guān)注。在這一高速增長、前景廣闊的市場(chǎng)，Bio-Rad在數(shù)字PCR上的投資是富有成效的?！睋?jù)Frost &Sullivan預(yù)計(jì)，2011-2016年間數(shù)字PCR儀器市場(chǎng)將以52%的年均復(fù)合增長率增長。Frost & Sull

23、ivan發(fā)布的美國qPCR和dPCR儀器市場(chǎng)的分析報(bào)告指出，美國的實(shí)時(shí)定量PCR和數(shù)字PCR儀器市場(chǎng)正處在不同的增長階段，但兩者都保持競(jìng)爭(zhēng)活力。盡管qPCR市場(chǎng)很成熟，但其競(jìng)爭(zhēng)力正在擴(kuò)張，因?yàn)閹讉€(gè)大牌的生命科學(xué)公司進(jìn)入此市場(chǎng)，希望擴(kuò)展它們的基因組學(xué)流程方案。同時(shí)，新興的dPCR市場(chǎng)也在快速增長，早期采用者增加，而供應(yīng)商也在擴(kuò)展技術(shù)應(yīng)用，以拓寬應(yīng)用范圍。dPCR作為一項(xiàng)新技術(shù)，儀器定價(jià)仍然較高，讓很多實(shí)驗(yàn)室望而卻步。dPCR目前的客戶僅限于制藥和生物技術(shù)公司，以及一些資金充裕的大型科研實(shí)驗(yàn)室。據(jù)DeciBio預(yù)計(jì), 2016年生命科學(xué)儀器市場(chǎng)預(yù)計(jì)$458億,中國是最強(qiáng)驅(qū)動(dòng)力。一個(gè)高增長的技術(shù)領(lǐng)域

24、是數(shù)字PCR，該技術(shù)的復(fù)合增長率將飆升至90%，從2011年1000萬美元升至2016年2.5億美元。數(shù)字PCR的操作步驟2013年下半年，Life-technologies推出的QuantStudio 3D數(shù)字PCR系統(tǒng)采用最簡(jiǎn)單的工作流程，只需極少的手工操作步驟和極短的操作時(shí)間。該系統(tǒng)的核心是一塊包括20000個(gè)反應(yīng)孔的硅芯片，每塊芯片運(yùn)行一個(gè)樣本，在一次實(shí)驗(yàn)中可同時(shí)分析兩個(gè)靶點(diǎn)。每個(gè)QuantStudio 3D芯片試劑盒包括12塊芯片及蓋子、12個(gè)上樣刮板和3個(gè)浸液注射器及針頭。PCR預(yù)混液的制備與實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)相同，將TaqMan Assay、DNA或cDNA樣本以及預(yù)混液加入

25、一支試管內(nèi)混勻（步驟1）。此外，QuantStudio 3D芯片是獨(dú)立包裝的一次性耗材，可最大程度降低樣本受到污染的危險(xiǎn)。上樣刮片也是一次性使用，簡(jiǎn)化了芯片上樣過程。制備好反應(yīng)混合物后，使用自動(dòng)芯片加載系統(tǒng)上樣，打開加載系統(tǒng)，將打開的芯片放置于上樣底座上（步驟2）；將上樣刮片置于加載系統(tǒng)臂的固定裝置上（步驟3）；將芯片蓋子放置于儀器轉(zhuǎn)臂的固定裝置上（步驟4）；將反應(yīng)混合物加至上樣刮片（步驟5）；按下按鈕，分配器自動(dòng)將反應(yīng)混合物分配至芯片的20000個(gè)反應(yīng)孔內(nèi)（步驟6），然后密封芯片（步驟7）（芯片密封劑可以在紫外光下發(fā)生固化，密封劑經(jīng)自動(dòng)上樣設(shè)備上的紫外裝置激活，對(duì)芯片進(jìn)行密封）；密封后可以在

26、帶有雙平板模塊的熱循環(huán)儀上對(duì)芯片進(jìn)行擴(kuò)增，在熱循環(huán)儀上進(jìn)行擴(kuò)增需要約2個(gè)半小時(shí)（步驟8）；QuantStudio3D 數(shù)字PCR系統(tǒng)一次讀取一塊芯片（步驟9），需要30秒完成讀數(shù)（在芯片讀取過程中，儀器讀取芯片唯一的標(biāo)識(shí)符，捕獲擴(kuò)增樣本的熒光信號(hào)，芯片讀數(shù)中會(huì)捕獲所有反應(yīng)孔的ROX、FAM和VIC通道熒光圖像，數(shù)據(jù)輸出為FAM和VIC通道的計(jì)數(shù)（拷貝數(shù)/微升）；通過ROX信號(hào)確認(rèn)反應(yīng)孔中是否存在樣本）；最后，將數(shù)據(jù)寫至用戶定義的目標(biāo)位置儀器、USB驅(qū)動(dòng)器、聯(lián)網(wǎng)服務(wù)器等，使用QuantStudio3D AnalysisSuiteTM現(xiàn)有的軟件模塊，可以對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的數(shù)據(jù)和圖像分析。步驟1

27、步驟2步驟3步驟4步驟5步驟6步驟7-1 步驟7-2步驟8-1步驟8-2步驟8-3步驟9Fluidigm公司2006年底推出的Bio-Mark基因分析系統(tǒng)由Bio-Mark實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)（整合了高性能計(jì)算機(jī)）、IFC微液流芯片（耗材）、IFC Controller（將生物樣品、反應(yīng)試劑導(dǎo)入到IFC微液流芯片中）和數(shù)據(jù)分析軟件四部分構(gòu)成。IFC微液流芯片有2種：Dynamic Array（48.48動(dòng)態(tài)芯片和96.96動(dòng)態(tài)芯片）和Digital Array（12.765數(shù)字芯片和48.770數(shù)字芯片）。數(shù)字芯片將預(yù)混液（樣品與PCR試劑）分成數(shù)百個(gè)單獨(dú)的PCR反應(yīng)，開展數(shù)字PCR分析。整個(gè)過程分

28、為五步：準(zhǔn)備芯片；將每個(gè)樣品預(yù)混液移液至芯片的獨(dú)立入口；將芯片放入IFC Controller，利用軟件界面迫使分析組分進(jìn)入單獨(dú)的反應(yīng)板；將芯片放入BioMark系統(tǒng)，開展熱循環(huán)和熒光檢測(cè)；利用分析軟件來查看和分析擴(kuò)增曲線。與上面兩者相比，浙大的SPC芯片系統(tǒng)（圖2）采用自吸式分液進(jìn)樣芯片，進(jìn)樣方法簡(jiǎn)便，無需外源動(dòng)力。ZJU 自吸式分液進(jìn)樣芯片既是耗材又有自動(dòng)分配反應(yīng)液的功能。相當(dāng)于簡(jiǎn)化了QuantStudio 3D數(shù)字PCR系統(tǒng)的步驟2-步驟7，也無需像Fluidigm公司一樣利用IFC Controller儀器進(jìn)樣。圖2 ZJU 自吸式分液進(jìn)樣芯片成本分析數(shù)字PCR的流程比傳統(tǒng)的qPCR更

29、簡(jiǎn)單，但通量較低，基本每塊芯片上千個(gè)反應(yīng)單元都是針對(duì)單一樣本的分析，而熒光檢測(cè)技術(shù)的局限性限制了多個(gè)芯片的同時(shí)檢測(cè)。結(jié)論生物學(xué)的基礎(chǔ)研究和分子技術(shù)的前進(jìn)伴隨著更精確和更靈敏的測(cè)量技術(shù)發(fā)展。dPCR具有測(cè)量獨(dú)立性與無需任何校準(zhǔn)物的特點(diǎn)。因此，該技術(shù)是潛在的核酸測(cè)量基準(zhǔn)方法，并從原理上為核酸計(jì)量提供了保證19。相比其他方法，dPCR作為絕對(duì)定量方法能準(zhǔn)確定量目標(biāo)DNA和提供可靠的定量數(shù)據(jù)4。商業(yè)化dPCR儀器(如Fluidigm公司的BioMarkSystem)的大量出現(xiàn)進(jìn)一步推動(dòng)和擴(kuò)大了該技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用范圍。參考文獻(xiàn)：1. M Baker.(2012). Digital PCR hits it

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