細胞內(nèi)抗嗜肺軍團菌藥物有效濃度測定講解

1、細胞內(nèi)抗嗜肺軍團菌藥物有效濃度測定【摘要】目的： 探討紅霉素。環(huán)丙沙星。左氧氟沙星。莫西沙星 4 種抗菌藥 物對細胞內(nèi)嗜肺軍團菌的抗菌活性。方法： 分別采用 E-test 法和有限稀釋法 測定上述 4 種藥物對嗜肺軍團菌 ATCC 33152的細胞外抗菌活性 , 再用噻唑藍比 色法（MTT法）測定上述藥物對嗜肺軍團菌 ATCC 33152的細胞內(nèi)抗菌活性。結(jié)果: 細胞外抗菌活性E-test法：紅霉素0.047卩g/mL。環(huán)丙沙星0.38卩g/mL。左 氧氟沙星0.125卩g/mLo莫西沙星0.125卩g/mL;有限稀釋法：紅霉素0.125 卩g/mLo環(huán)丙沙星0.03卩g/mL。左氧氟沙星0.

2、016卩g/mL。莫西沙星0.016 卩g/mLo 4種藥物的細胞內(nèi)抗菌活性分別為：紅霉素0.25卩g/mL。環(huán)丙沙星 0.016卩g/mLo左氧氟沙星0.016卩g/mL。莫西沙星0.004卩g/mL。結(jié)論： 氟喹諾酮類藥物在U937細胞模型中對嗜肺軍團菌ATCC 33152具有很強的細胞 內(nèi)抗菌活性。其中莫西沙星的細胞內(nèi)抗菌活性最強。MTT法是一種行之有效的用于檢測藥物對細胞內(nèi)嗜肺軍團菌抗菌活性的方法 , 可同時檢測并對比各種藥物 樣本的細胞內(nèi)抗菌活性。【關(guān)鍵詞】 嗜肺軍團菌 ; U937 細胞; 抗菌活性Abstract： Objective ： To explore the intra

3、cellular antimicrobial activities of erythromycin, ciprofloxacin, levofloxacin, moxifloxacin against Legionella pneumophila. Methods ： The minimum inhibition concentration (MIC) of each antibiotic was evaluated by E-test method and microdilution method respectively. The minimal extracellular concent

4、ration inhibiting intracellular multiplication (MIEC) of each antibiotic was evaluated by the MTT colorimetric assay system. Results ： The MIC concentration for each drug by E-test method were： erythromycin, 0.047 卩 g/mL; ciprofloxacin, 0.38 卩 g/mL; levofloxacin,0.125 卩 g/mL; moxifloxacin, 0.125 卩 g

5、/mL, the MIC concentrations for each drug by microdilution method were: erythromycin, 0.125卩 g/mL;ciprofloxacin, 0.03 卩 g/mL; levofloxacin, 0.016 卩 g/mL; moxifloxacin, 0.016 卩 g/mL. The MIEC concentration for each drug were: erythromycin, 0.25 卩 g/mL; ciprofloxacin, 0.016 卩 g/mL; levofloxacin, 0.016

6、 卩 g/mL; moxifloxacin, 0.004 卩 g/mL. Conclusions Fluoroquinolones have superior activity than erythromycin in U937 cells infected with L.pneumophila. Moxifloxacin is the most potent drug among the four tested antimicrobials. Our results indicated that the MTT assay system allows comparative and quan

7、titative evaluations of the intracellular activities of antibiotics against L. pneumophila and efficient processing of a large number of samples.Key words： Legionella pneumophila; U937 cells; antimicrobial activities嗜肺軍團菌 (Legionella pneumophila,Lp) 是一種兼性細胞內(nèi)寄生菌 , 可在 巨噬細胞和肺泡上皮細胞內(nèi)存活并繁殖 , 并能導(dǎo)致具有潛在致死性的社

8、區(qū)獲得性 肺炎和醫(yī)院獲得性肺炎。憑借著在巨噬細胞內(nèi)生長的特性 ,Lp 能夠逃逸機體免 疫防御作用。治療 Lp 感染的關(guān)鍵是選用能在吞噬細胞內(nèi)達到有效抑菌濃度的抗 菌藥物。紅霉素曾被推薦用以治療 Lp 感染,但用紅霉素治療往往療程長。副作 用大。近年來 , 有報道稱氟喹諾酮類。新大環(huán)內(nèi)酯類藥物更適合治療 Lp 感染且 副作用更少1-2。我們注意到,必須將藥物的細胞外抗菌活性測定(即MIC測定) 和細胞內(nèi)抗菌活性測定結(jié)合起來才能更準確的評估藥物對Lp的臨床療效3。然而在藥物的細胞內(nèi)抗Lp活性測定方面，現(xiàn)有的試驗方法常需耗費大量的時間 和材料用于裂解細胞并將裂解液進行培養(yǎng)及計算菌落的個數(shù) 4, 若要

9、同時測定 多種藥物的細胞內(nèi)抗Lp活性并對比其療效時，現(xiàn)有方法的缺點就更加明顯。因 此需要一種適于評價多種藥物對細胞內(nèi)Lp抗菌活性的方法。在本研究中，我們提供了一種基于U937細胞模型的測定系統(tǒng)，可以同時對多種藥物的細胞內(nèi)抗 Lp 活性進行快速。定量的分析。1 材料與方法1.1 菌 株Lp 菌株 ATCC 33152(解放軍 301 醫(yī)院臨床藥理研究所 , 王睿教授惠贈 ), 由中 山大學(xué)附屬第三醫(yī)院細菌室保存。將細菌解凍后挑取適當菌液接種于緩沖活性 炭酵母浸液瓊脂 (buffered charcoal yeast extract,BCYE) 平板(廣州迪景公 司),置37 T細菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2

10、 3 d至長出肉眼可見的灰白色菌落,挑取單 個菌落,用緩沖酵母浸液(buffered yeast extract- 。琢,BYE-。琢)培養(yǎng)液將 菌液調(diào)整至0.5號麥氏管濃度標準(1.5 X 108/mL)。置于搖菌儀內(nèi)搖菌過夜 (12 18 h), 再以3 000 r/min(r = 18 cm) 離心20 min 收集細菌,用無菌磷酸 鹽緩沖液(PBS)調(diào)整濃度為1 X 107/mL,備用。1.2 細 胞U937細胞(武漢,中國典型培養(yǎng)物保藏中心),用90%RPMI 164(培養(yǎng)液(添加 1.5 g/L 碳酸氫鈉。 4.5 g/L 葡萄糖。 10 mmol/L HEPES。 1.0 mmo

11、l/L 丙酮酸鈉) 加上 100 mL/L 胎牛血清為培養(yǎng)液 , 置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細胞密度規(guī)律 傳代, 傳代超過 10代之細胞即棄去不再使用。試驗前向細胞培養(yǎng)液中加入終濃 度為20 ng/mL的佛波酯(PMA)對U937細胞進行誘導(dǎo),置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培 養(yǎng)48 h后,用37 C預(yù)熱的RPMI 1640培養(yǎng)液輕輕沖洗培養(yǎng)物3遍以洗去剩余 的PMA和未貼壁的細胞，剩下的貼壁細胞即為不再分化，具有巨噬細胞表型特性 的類巨噬細胞 , 備用。1.3 主要試劑及抗菌藥物環(huán)丙沙星 (ciprofloxacin, CI) 。莫西沙星 (moxifloxacin,MO) 購自北京拜 耳醫(yī)藥保健有限

12、公司 , 左氧氟沙星 (levofloxacin,LE) 購自北京第一制藥有限公 司,紅霉素(erythromicin,EM) 。 MTT購自北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司。1.4 細胞病理效應(yīng)測定通過MTT法測定感染Lp后存活的U937細胞數(shù)來反映細胞病理效應(yīng) (cytopathic effect,CPE) 。首先,為了解吸光值和存活的細胞數(shù)目之間的對應(yīng) 關(guān)系,將誘導(dǎo)后的U937細胞連續(xù)稀釋后鋪入96孔板，加入50。滋L的MTT容 液(5 mg/mL),在37 C下孵育4 h。棄去上清，每孔加入150。滋L的二甲基亞 砜(DMSO后充分振蕩，將培養(yǎng)板置于酶標儀下讀數(shù)(以DMS前對照)。由于活細

13、菌也被認為可以和 MTT反應(yīng)而呈色 ，既往研究表明細菌濃度至 少需達到108/mL才能影響吸光值，而本研究中所用的細菌濃度不曾達到該濃度， 因此細菌和MTT溶液的反應(yīng)不會影響到實驗數(shù)據(jù)的可靠性。將誘導(dǎo)后的U937細胞鋪入96孔板中并以不同濃度的細菌去感染它，加入含 有50卩g/mL慶大霉素的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2 h,洗滌細胞后加入100。滋L培養(yǎng) 液，之后在各個時間點加入上述 MTT溶液，并用酶標儀在570 nm處讀取各孔的吸 光值D(570 nm)。CPED50S義為導(dǎo)致50%田胞死亡的細菌數(shù)目。為了精確測定 該值,我們將試驗用細胞分為 2組,其中一組為非感染組 (即未加干預(yù)措施的對照 組，視為

14、不產(chǎn)生CPE效應(yīng))，另一組為0.1%皂苷處理組(由于皂苷可導(dǎo)致細胞死亡 該組即為最大CPE對照組),2個對照組在570 nm處吸光值的平均值被定義為 CPED50如此便可推算出導(dǎo)致CPED5C的Lp濃度。1.5細胞外抗菌活性MIC測定分別采用 E-test 法和有限稀釋法測定試驗所用藥物對 Lp ATCC 33152的最 低抑菌濃度(MIC)值。具體如下：E-test法:取培養(yǎng)48 h的菌落數(shù)個，混懸于生理鹽水中，調(diào)整濃度至1.5 X 108/mL。均勻接種于BCYE平板。將E-test試紙條貼于瓊脂表面。置37 C培 養(yǎng)箱 48 h 后觀察結(jié)果 , 抑菌橢圓環(huán)與試條交界處的刻度即為最小抑菌濃

15、度MIC。有限稀釋法：抗菌藥物和BYE-a培養(yǎng)液制備同普通肉湯稀釋法。 MIC板 制備: 將倍比稀釋后不同濃度的抗菌藥物溶液分別加到滅菌的 96孔板中, 第1 至 第11孔加藥液，每孔10卩L,第12孔不加藥作為生長對照，冰凍干燥后密封,- 20 C保存?zhèn)溆?。接種物制備：將細菌懸液濃度調(diào)整至0.5麥氏比濁管標準，經(jīng) BYE-a培養(yǎng)液1 : 1 000稀釋后，向每孔中加100卩L,密封后置37 C培養(yǎng) 箱,48 h 判斷結(jié)果。此時 ,第 1孔至第 11孔藥物濃度分別為 128。64。32。16。 & 4。2。1。0.5。0.25。0.125卩g/mL。結(jié)果判斷：以在小孔內(nèi)完全抑制細 菌生

16、長的最低藥物濃度為 MICo當陽性對照孔(即不含抗生素)內(nèi)細菌明顯生長 試驗才有意義。當出現(xiàn)單一的跳孔時 , 記錄抑制細菌生長的最高藥物濃度。如出 現(xiàn)多處跳孔 , 則不報告結(jié)果 , 重復(fù)試驗。1.6細胞內(nèi)抗菌活性MIEC測定采用MTT法測定各抗菌藥物的細胞內(nèi)抗菌活性，即抑制胞內(nèi)菌生長的最低胞 外抗菌藥物濃度 (minimum extracellular concentration,MIEC), 具體如下 ：用105/孔濃度(20倍CPED5C的Lp ATCC 33152感染誘導(dǎo)后的U937細胞(2 X 105 個/孔)。感染 2 h 后除去胞外未被吞噬的細菌 ,加入含抗菌藥物的培養(yǎng)液 ,繼續(xù)

17、培養(yǎng)至第72 h,加入20。滋L的MTT溶液,37 C孵育4 h。棄上清,每孔中加 入150。滋L DMSO后充分振蕩，將96孔培養(yǎng)板置于酶標儀下讀數(shù)，在570 nm 處測得各孔的吸光值 D(570 nm)。1.7 數(shù)據(jù)處理用SPSS 11.5軟件進行統(tǒng)計描述和分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)標準差來表示，實 驗組之間的差異用 analysis of variance,ANOVA 進行分析,多組方差齊性檢驗 用Levene法，多個樣本均數(shù)的兩兩比較用 SNK法,P < 0.05視為差異有統(tǒng)計學(xué) 意義。2 結(jié)果2.1 Lp對U937細胞產(chǎn)生的細胞病理效應(yīng)將誘導(dǎo)后的U937細胞濃度調(diào)整至106個/mL(

18、2 X 105個/孔),每孔200。 滋L接種96孔板，以不同濃度的Lp ATCC 33152(1 107/孔)去感染細胞。置 細胞培養(yǎng)箱中 2 h 使細菌被吞噬 , 洗去胞外未被吞噬的細菌。加入不含抗菌藥物 的培養(yǎng)液(200。滋L)繼續(xù)培養(yǎng)至72 h,用MTT法檢測存活下來的U937細胞，并 以D(570 nm)來表示。結(jié)果(圖1)顯示：隨著感染復(fù)數(shù)(MOI)的增大,被破壞的 U937細胞逐漸增多,U937細胞的破壞程度和感染的劑量呈一定的比例關(guān)系，在以 107感染時，被破壞的細胞最多。CPED5值為5 X 103/孑L。2.2細胞外抗菌活性MIC測定分別采用E-test法和有限稀釋法測定抗

19、菌藥物對 Lp ATCC 33152的MIC值 結(jié)果示：兩種測定法結(jié)果差異較大(P < 0.05) 。E-test法:EM 0.047卩g/mL。 CI 0.38卩 g/mLoLE 0.125 卩 g/mL。MO 0.125 卩 g/mL;稀釋法:EM0.125卩 g/mLoCI 0.03卩 g/mL。LE 0.016卩 g/mL。MO 0.016 卩 g/mL。2.3 細胞內(nèi)抗菌活性測定Lp ATCC 33152 的 CPED50勺為 5 X 103/ 孔，以 1 X 105/ 孔(20 倍 CPED50) 感染上述誘導(dǎo)成熟后的U937細胞(2 X 105個/孔)。加入經(jīng)連續(xù)稀釋的6種

20、濃 度的抗菌藥物，繼續(xù)培養(yǎng)至第72 h,檢測其吸光值D(570 nm),為排除藥物對細胞 產(chǎn)生的毒性作用 ,設(shè)置僅加入藥物而未用細菌感染的對照組。結(jié)果提示 :實驗所 用4種抗菌藥物沒有明顯的細胞毒性作用(圖2),D(570 nm)與陰性對照組相比 沒有顯著性差異(P > 0.05)。實驗組的結(jié)果示：當濃度> 0.015 6 卩g/mL,MO LEo CI能夠很好的抑制CPE,EM寸U937細胞的保護作用呈劑量依賴性(圖3)。 D(570 nm)值和胞內(nèi)菌的數(shù)目呈相反的關(guān)系，提示這些藥物能夠有效的抑制胞內(nèi) 菌的生長并抑制其造成的 CPE。用藥物抑制細菌造成的CPE來評估其細胞內(nèi)抗菌活

21、性。MIEC定義為能抑制 大于50%田胞病理效應(yīng)（CPE）產(chǎn)生的胞外藥物濃度。結(jié)果（圖4）顯示:MO（4 卩g/mL）產(chǎn)生最大的CPE抑制,視為100%CP抑制；未加入任何抗菌藥物的陰性對 照組即為最小CPE抑制,視為0%CP抑制；大于50%CP抑制的即為各藥物之 MIEC值。實驗所用 4 種藥物的 MIEC:EM 0.25 卩 g/mL。CI 0.016 卩 g/mL。LE 0.016卩g/mL。MO 0.004卩g/mL。EM的MIEC明顯高于其 MIC值,其它3種氟 喹諾酮藥物的MIEC比各自的MIC低，提示上述四種藥物都能夠抑制 Lp在細胞內(nèi) 增殖,MO的抑制作用最強（0.004卩g/

22、mL）。3 討論MIEC的概念最早由Vilde等4于1986年提出,定義為能在第24 h將Lp 總數(shù)目（胞內(nèi)加胞外）降至對照組（不含抗菌藥物）的10%以下的最低胞外藥物濃 度,以此作為評價藥物細胞內(nèi)抗菌活性的指標之一；后來,Higa等 報道了基于 鼠類巨噬細胞J774.1細胞系）的對細胞內(nèi)Lp抗菌活性的簡化定量分析法并將 MIEC定義為能抑制大于50%田胞病理效應(yīng)（CPE）產(chǎn)生的胞外藥物濃度。盡管上述 兩種MIEC的定義不同，但已有研究表明這兩種方法所得出的 MIEC值相近，由于 Vilde 等用于測定胞內(nèi)菌生長的技術(shù)需耗費大量時間和材料去裂解細胞并將裂 解液進行培養(yǎng)及計算菌落的個數(shù) , 不便

23、于對多種抗菌藥物的抗菌活性進行比較。 而Higa等采用的比色分析法就簡單易行，加之細菌對宿主細胞產(chǎn)生的 CPE和機 體受到感染的嚴重程度是息息相關(guān)的,對細菌導(dǎo)致的CPE以及抗菌藥物對CPE的 抑制情況直接進行測定將比對細胞內(nèi)的細菌數(shù)目本身的測定更有價值 ,也更能反 映臨床上藥物在體內(nèi)的對Lp感染真實效果。因而本文沿用其 MIEC定義方法。雖然MIC及MBC可作為衡量抗菌藥物活性的指標，但臨床上常遇到一些感染 性疾病,藥敏試驗顯示某種藥物對致病菌高度敏感 ,但該藥物治療效果不好 ,如 Lp感染1。我們的結(jié)果提示4種抗菌藥物對Lp感染都有效，但MIC和MIEC存 在差異（表2）:EM的MIEC為M

24、IC的2倍，然而氟喹諾酮類抗菌藥物如 CI的MIEC 僅為MIC值的0.53倍。MOK MIEC僅為MIC值的0.25倍，雖然MIEC值大小受 諸如藥物對細胞吞噬體的滲透性。吞噬體的外周環(huán)境和藥物本身在細胞內(nèi)的存 在方式等因素影響2-3,這些都會造成MIC和MIEC之間的不同。然而在同一批 次試驗中,MIC和MIEC的差異主要由藥物對細胞膜的滲透性決定。MIEC值越小，反映出藥物對細胞膜的滲透性越好。一些在體外擁有足夠抗菌效價的抗菌藥物 若不能滲透入細胞內(nèi)將導(dǎo)致治療失敗。對于一些可在細胞內(nèi)增殖的病原菌如 Lp。 結(jié)核桿菌來說尤其如此。因此 ,在評估一種藥物對細菌是否有效時 ,必須同時評 估其細

25、胞內(nèi)抗菌效價。通過試驗結(jié)果我們發(fā)現(xiàn) E-test 和有限稀釋法兩種測定法得出的 Lp ATCC 33152的MIC值差異較大：通過E-test法測定的CI的MIC是有限稀釋法的 12.67倍,而通過E-test法測定的EM的 MIC僅為有限稀釋法的0.376倍。造成 這種差異的原因主要是由于現(xiàn)階段對于Lp的藥敏試驗檢測方案依然沒有一個通用的標準7。由于Lp在BCYE培養(yǎng)板上生長狀況極好,分離Lp屬首選BCYE平 板8,早期的藥敏試驗也采用該平板進行測定9。但后來的研究認為BCYE平 板中的活性炭成分會抑制部分抗菌藥物 （如氟喹諾酮類藥物 ）的活性10-12, 而 提倡采用一些不含活性炭的培養(yǎng)介

26、質(zhì)如 :BSYE（buffered starch yeastextract）13 。BYE14液體培養(yǎng)基或瓊脂培養(yǎng)基以期望獲得更為精確的藥敏試 驗結(jié)果。另一些學(xué)者則認為：盡管BCYE中的活性炭成分對藥物的活性有抑制作 用,但Lp在各種介質(zhì)中的生長狀況差異很大,部分菌株在BSYE中甚至不能生長, 因此活性炭所引起的MIC值的誤差相比起由于細菌生長狀況差而帶來的潛在誤 差來說是可以接受的，而且使用BCYE平板進行藥敏試驗可重復(fù)性好，因此在藥敏 試驗中用BCYE平板代替BSYE平板是可行的7。本研究中采用的E-test法中 使用的平板即為BCYE平板,而有限稀釋法采用為不含炭成分的 BYE-a培養(yǎng)液

27、, 這兩種方法所得結(jié)果的差異性也印證了前人的研究結(jié)果 ,當然, 如何選擇一個最 適當?shù)乃幟粼囼灆z測方案依然需要我們進行更深入的研究。到目前為止，臨床上對Lp感染的治療方案仍然以紅霉素為主。Segreti等 15于1996年研究了 Lp對3種大環(huán)內(nèi)酯類藥物（紅霉素。甲基紅霉素和阿齊霉 素）的敏感性,他們試驗了 5種Lp菌株,發(fā)現(xiàn)3種受試藥物都能有效抑制這幾種 Lp菌株在細胞內(nèi)的生長。1999年Edelstein 等16報告了 Sch27899。紅霉素 和氧氟沙星對細胞內(nèi)受試 Lp菌株的MICs分別是0.25。0.5。0.06。滋g/mL。 2001年Rhomberg17利用體外試驗研究了 Lp對

28、BMS-284756（T-3811ME敏感性, 試驗對象以Lp血清型1為主,還有其他Lp種和Lp的其他血清型，發(fā)現(xiàn)BMS- 284756比其它氟喹諾酮類和大環(huán)內(nèi)脂類更有效,其MIC90值在0.008 0.03 mg/L之間,在所有受試藥物中最低，而且所有的受試菌都對其敏感。其它的受試 藥物主要有氟喹諾酮類 （如左氧氟沙星。莫西沙星和環(huán)丙沙星 ）和大環(huán)內(nèi)酯類 （如 紅霉素,甲基紅霉素和阿奇霉素）等。這與1997年Marc的結(jié)果相一致,而且所有 受試喹諾酮類藥物的效果要比大環(huán)內(nèi)酯類受試藥物好 18 。 Edelstein 的研究 提示對病情嚴重。院內(nèi)感染及免疫功能缺陷的患者應(yīng)首選喹諾酮類藥物治療。

29、 新開發(fā)的氟喹諾酮類藥物 （加替沙星。莫西沙星。司帕沙星?？肆稚承堑?）, 其共 同特點是保持了早期開發(fā)的氟喹諾酮類藥物 （氧氟沙星。環(huán)丙沙星 ）對革蘭氏陰 性菌的優(yōu)秀活性 ,且對革蘭氏陽性菌。厭氧菌也具有優(yōu)秀的活性 ,同時對非典型 微生物如 ：衣原體。支原體和 Lp 也具有較好的活性。我們的研究結(jié)果也證實了 氟喹諾酮類藥物在治療Lp感染方面確實要比紅霉素更勝一籌，莫西沙星具有很 強的細胞內(nèi)抗菌活性，這與以往的報道是基本一致的。對比鼠源性的 J774細胞 系6,人源性的U937細胞系更能真實的反映人體受Lp感染后的狀況，實驗結(jié)果 也能更好的為臨床用藥提供依據(jù)。參考文獻】1. Edelstein

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