基因克隆的載體系統(tǒng)

1、4 基因克隆的載體系統(tǒng)基因克隆的載體系統(tǒng)4.1 質(zhì)粒（質(zhì)粒（plasmid）載體）載體 大腸桿菌主要的天然質(zhì)粒類型：大腸桿菌主要的天然質(zhì)粒類型： F 質(zhì)粒：致育因子或性因子 R 質(zhì)粒：抗藥性因子 Col 質(zhì)粒：產(chǎn)生大腸桿菌素因子 基因工程中使用的質(zhì)粒載體都是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上人工改造而成的。質(zhì)粒載體是重組DNA研究中最常用的也是最重要的基因克隆載體。4.1.1 質(zhì)粒的生物學(xué)特性質(zhì)粒的生物學(xué)特性4.1.1.1 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA及其構(gòu)型及其構(gòu)型 絕大多數(shù)質(zhì)粒都是環(huán)狀雙鏈DNA分子質(zhì)粒DNA的構(gòu)型： SC 構(gòu)型：由cccDNA呈現(xiàn)超螺旋而形成； OC 構(gòu)型：開環(huán)DNA（ocDNA）的構(gòu)型； L 構(gòu)型：

2、雙鏈斷裂而形成的線性質(zhì)粒 DNA分子。（2 2）F F質(zhì)粒及起接合轉(zhuǎn)移：詳見遺傳學(xué)相關(guān)內(nèi)質(zhì)粒及起接合轉(zhuǎn)移：詳見遺傳學(xué)相關(guān)內(nèi)容容4.1.1.2 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移（1）質(zhì)粒的類型）質(zhì)粒的類型 接合型質(zhì)粒：能夠自主轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒。接合型質(zhì)粒：能夠自主轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒。 非接合型質(zhì)粒：不能自主轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒。非接合型質(zhì)粒：不能自主轉(zhuǎn)移的質(zhì)粒。4.1.1.3 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的遷移作用的遷移作用 由共存的接合型質(zhì)粒引發(fā)的非接合型質(zhì)粒的轉(zhuǎn)移過程ColE1質(zhì)粒的遷移質(zhì)粒的遷移：2個相關(guān)基因個相關(guān)基因：bom：ColE1 DNA 上的特異位點(diǎn)，是 Mob基因產(chǎn)物的作 用位點(diǎn)；mob：其產(chǎn)物是 ColE1 質(zhì)粒特有

3、的彌散產(chǎn)物核 酸酶，作用于 bom位點(diǎn)。4.1.1.4 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的復(fù)制類型的復(fù)制類型 質(zhì)?？截悢?shù)質(zhì)?？截悢?shù)：（1）生長在標(biāo)準(zhǔn)的培養(yǎng)基條件下，每個細(xì)菌細(xì)胞中所含的質(zhì)粒DNA分子的數(shù)目；（2）對應(yīng)于每條細(xì)菌染色體平均具有的質(zhì)粒DNA分子數(shù)目。嚴(yán)禁型質(zhì)粒和松弛型質(zhì)粒嚴(yán)禁型質(zhì)粒和松弛型質(zhì)粒 嚴(yán)禁型質(zhì)粒：低拷貝數(shù)的質(zhì)粒，每個寄主細(xì)胞僅含有 13拷貝； 松弛型質(zhì)粒：高拷貝數(shù)的質(zhì)粒：每個寄主細(xì)胞中可高 達(dá)1060份 質(zhì)粒的結(jié)合轉(zhuǎn)移能力，同它們的分子大小及復(fù)制類型之間有一定的相關(guān)性：接合型質(zhì)粒由于具有較高的分子量，一般屬于嚴(yán)禁型的；而非接合型質(zhì)粒往往具有較小的分子量，一般屬于松弛型質(zhì)粒。4.1.1.5

4、質(zhì)粒的不親和性（不相容性）質(zhì)粒的不親和性（不相容性） 在沒有選擇壓力的情況下，兩種親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)粒，不能在同一個寄主細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定地共存的現(xiàn)象。 彼此間不親和的質(zhì)粒屬于同一個不親和群；而彼此間能夠共存的質(zhì)粒屬于不同的不親和群。質(zhì)質(zhì)粒粒不不親親和和現(xiàn)現(xiàn)象象的的圖圖解解4.1.2 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離和純化的分離和純化 為了在基因克隆中用作載體分子，要獲得批量的純化的質(zhì)粒DNA分子。加入溶菌酶或SDS（十二烷基硫酸鈉）來裂解大腸桿菌細(xì)胞，在從細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)分離得到質(zhì)粒DNA，然后在進(jìn)一步純化質(zhì)粒DNA，使其沒有細(xì)菌染色體DNA片段、RNA、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)的污染。4.1.2.1 堿變性法堿變性法 原理：

5、在pH12.012.5范圍內(nèi)，線性DNA分子會被變性，成為線性單鏈分子；而質(zhì)粒cccDNA的互補(bǔ)的兩條鏈仍會緊密地結(jié)合在一起。在酸中和時，質(zhì)粒DNA分子的兩條鏈的復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，而隨機(jī)斷裂的線性DNA分子復(fù)性不會那么快速而準(zhǔn)確，它們聚集成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，在下一步的離心分離時與變性的蛋白質(zhì)與RNA一道沉淀下來，滯留在上清液中的質(zhì)粒cccDNA用酒精或異丙醇等試劑沉淀收集。簡要操作過程（投影）簡要操作過程（投影）4.1.2.2 微量堿變性法微量堿變性法 如果質(zhì)粒DNA需求量不多的情況下（或高拷貝質(zhì)粒）可采用此種方法。此方法具有快速簡便、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠等優(yōu)點(diǎn)，還可以同時抽提幾種質(zhì)粒DNA。方法同大量提取法相近。

6、4.1.2.3 氯化銫（氯化銫（CsCl）密度剃度離心法）密度剃度離心法 如果實(shí)驗(yàn)需要高純度、高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA，可采用這種方法離心純化質(zhì)粒DNA 。由于在離心管中還要加入溴化乙錠溶液，所以也叫氯化銫-溴化乙錠密度剃度離心法。 在超速（或高速）離心狀態(tài)下，氯化銫在離心管中形成密度剃度，而細(xì)菌裂解液或質(zhì)粒溶液中的不同成分按其密度在氯化銫的不同密度層面分離存在，從而達(dá)到分離純化的目的。4.1.2.4 影響質(zhì)粒影響質(zhì)粒DNA產(chǎn)量的因素產(chǎn)量的因素（1）寄主菌株的遺傳背景（2）質(zhì)粒的拷貝數(shù)及分子大?。?）實(shí)驗(yàn)操作誤差4.1.3 質(zhì)粒載體的構(gòu)建及類型質(zhì)粒載體的構(gòu)建及類型4.1.3.1 天然質(zhì)粒的局限性天然

7、質(zhì)粒的局限性 天然質(zhì)粒在抗生素標(biāo)記、限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)、分子量、拷貝數(shù)等等很多方面不能滿足基因克隆的要求，所以絕大部分質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上根據(jù)基因工程的需要而改造而來的。4.1.3.2 質(zhì)粒載體必備的條件質(zhì)粒載體必備的條件 1、具有復(fù)制起點(diǎn) 2、具有抗菌素抗性基因（理想情況下2種抗性基因） 3、具有若干個限制酶單一識別位點(diǎn) 4、具有較小的分子量和較高的拷貝數(shù)4.1.3.3 質(zhì)粒載體的選擇性標(biāo)記質(zhì)粒載體的選擇性標(biāo)記（1）負(fù)選擇標(biāo)記）負(fù)選擇標(biāo)記（2）正選擇體系）正選擇體系 喪失四環(huán)素抗性標(biāo)記的正選擇體系喪失四環(huán)素抗性標(biāo)記的正選擇體系 具有四環(huán)素抗性標(biāo)記的細(xì)胞對親脂的螯合劑萎蔫酸極其敏感，

8、因此能夠在含有萎蔫酸的培養(yǎng)基中生長的只能是四環(huán)素敏感的細(xì)胞，而不是四環(huán)素抗性的轉(zhuǎn)化子。 將外源DNA片段克隆到載體的四環(huán)素抗性基因（tetr）內(nèi)某個限制位點(diǎn)上，使后者發(fā)生插入失活，并使用含萎蔫酸的培養(yǎng)基進(jìn)行正選擇。這樣獲得的抗藥性群體全都可能含有插入的外源DNA片段。 環(huán)絲氨酸富集法環(huán)絲氨酸富集法 環(huán)絲氨酸是氨基酸類似物，如果在細(xì)胞生長分裂過程中參入到新合成的蛋白質(zhì)多肽鏈，則會導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。因此，在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基中環(huán)絲氨酸只能殺死生長的Tetr細(xì)胞，而對于停止生長的Tets細(xì)胞則無致死效應(yīng)。環(huán)絲氨酸富集法環(huán)絲氨酸富集法 由tetr基因內(nèi)帶有插入序列的重組質(zhì)粒所轉(zhuǎn)化的大腸桿菌細(xì)胞，在含有氨

9、芐青霉素的培養(yǎng)基初步篩選以后，經(jīng)過一次環(huán)絲氨酸處理，存活的細(xì)胞中Tets細(xì)胞所占比例得到明顯的提高，再經(jīng)若干次重復(fù)處理， Tets細(xì)胞的富集則可上升數(shù)倍。4.1.3.4 質(zhì)粒載體的類型質(zhì)粒載體的類型 高拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體 在沒有蛋白質(zhì)合成的條件下仍能復(fù)制，具有低分子量、高拷貝數(shù)的特點(diǎn)。在基因工程中用于分離大量的高純度的克隆基因DNA片段。通常選用Col1、Pmb1或它們的派生質(zhì)粒。 通常采用的方法是：在處于對數(shù)生長晚期的含有Col1一類質(zhì)粒的大腸桿菌培養(yǎng)物中，加入氯霉素或壯觀霉素等蛋白質(zhì)合成抑制劑，此時細(xì)菌染色體DNA的復(fù)制被阻斷，而質(zhì)粒DNA的復(fù)制不受什么影響，再繼續(xù)培養(yǎng)1012h后，每個細(xì)胞

10、內(nèi)的質(zhì)?？截悢?shù)則可擴(kuò)增到10003000個之多，這樣就可以用較少量的大腸桿菌培養(yǎng)物獲得大量的質(zhì)粒DNA。 低拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體 分子量相對高，拷貝數(shù)低。某些克隆的編碼基因的產(chǎn)物過量而影響寄主細(xì)胞的正常代謝，在克隆這樣的基因時需要用低拷貝數(shù)的質(zhì)粒作為載體，使其表達(dá)水平置于嚴(yán)格控制之下。 有些低拷貝數(shù)質(zhì)?？膳c高拷貝數(shù)質(zhì)粒連接成雙復(fù)制子質(zhì)粒，從而提高其拷貝數(shù)。 失控的質(zhì)粒載體 有些質(zhì)粒載體具有溫度敏感復(fù)制控制特點(diǎn)，在不同的溫度條件下其拷貝數(shù)有顯著的變化。即低拷貝數(shù)的質(zhì)粒在某些溫度下其復(fù)制失去了控制而表現(xiàn)高拷貝數(shù)質(zhì)粒的特點(diǎn)，雖然這會導(dǎo)致細(xì)胞的生長受到抑制，但此時質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量得到明顯的提高。 插入失活

11、的質(zhì)粒載體 大部分情況下要克隆的外源DNA片段都沒有選擇性標(biāo)記，此時用我們以前講過的標(biāo)記基因內(nèi)有限制位點(diǎn)的質(zhì)粒載體來克隆這些外源DNA片段，使質(zhì)粒的某一選擇性標(biāo)記失活而選擇帶有外源DNA片段的轉(zhuǎn)化子。 也可用對載體酶切末端進(jìn)行修飾等方法達(dá)到同樣的目的。 正選擇質(zhì)粒載體 應(yīng)用只有突變體或重組體才能正常生長的培養(yǎng)條件下進(jìn)行選擇，這樣我們在轉(zhuǎn)化之后直接就能選擇出重組質(zhì)粒。舉例：正選擇質(zhì)粒載體pKN80 Pkn80編碼一種對Mu噬菌體非溶源性菌株具有致死效應(yīng)的kil基因，在pKN80質(zhì)粒的HpaI或HindIII位點(diǎn)插入外源DNA，便會使這種致死效 應(yīng)失活，產(chǎn)生出具 有Ampr表型的Mu 噬菌體非溶源

12、性的 轉(zhuǎn)化子菌株。這樣， 我們就直接選擇出 在HpaI或HindIII位 點(diǎn)插入外源DNA的 重組體質(zhì)粒之轉(zhuǎn)化 子。典型的大腸桿菌表達(dá)載體 表達(dá)性的 質(zhì)粒載體 將克隆外源真核基因置于大腸桿菌的轉(zhuǎn)錄翻譯信號控制之下，這種特殊設(shè)計構(gòu)建，能使克隆在其特定位點(diǎn)上的外源真核基因的編碼序列在大腸桿菌細(xì)胞中正常轉(zhuǎn)錄并翻譯成相應(yīng)蛋白質(zhì)的克隆載體稱為表達(dá)載體表達(dá)載體。4.1.4 重要的大腸桿菌質(zhì)重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體粒載體4.1.4.1 pSC101 pSC101是一種嚴(yán)緊型復(fù)制控制的低拷貝數(shù)的大腸桿菌質(zhì)粒載體。 平均每個寄主細(xì)胞僅有12份拷貝，分子量為9.09Kb，編碼有一個四環(huán)素抗性基因（tetr）。 該質(zhì)

13、粒具有EcoRI等7中限制性內(nèi)切酶的單一切割位點(diǎn)，其中HindIII、BamHI和SalI等3個位點(diǎn)克隆外源DNA時，都會導(dǎo)致tetr基因的失活。pSC101應(yīng)應(yīng)用實(shí)例用實(shí)例1：金黃色葡金黃色葡萄球菌的萄球菌的Ampr 基基因插入因插入pSC101 質(zhì)粒質(zhì)粒pSC101應(yīng)用實(shí)例應(yīng)用實(shí)例2： 應(yīng)用應(yīng)用pSC101質(zhì)粒作載體在大腸桿菌細(xì)胞中質(zhì)粒作載體在大腸桿菌細(xì)胞中 克隆非洲爪蟾的克隆非洲爪蟾的rDNA基因片段基因片段4.1.4.2 pBR322 pBR322 質(zhì)粒由3個不同來源的部分組成：第一部分來源于pSF2124質(zhì)粒易位與Tn3的氨芐青霉素抗性基因（ampr）；第二部分來源于pSC101質(zhì)粒

14、的四環(huán)素抗性基因（tetr）；第三部分來源于CoLEI的派生質(zhì)粒pMB1的DNA復(fù)制起點(diǎn)。pBR322 質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)：質(zhì)粒的優(yōu)點(diǎn)： 分子量較小：4363bp，易于自身DNA的純化，可克隆達(dá)6kb的外源DNA。 具有兩種抗生素抗性基因（ampr和tetr）可供作轉(zhuǎn)化子的選擇性標(biāo)記， 具有多達(dá)24種限制性內(nèi)切酶的單一切割位點(diǎn)，其中， BamHI等9種限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)在位于tetr基因的內(nèi)部或啟動子區(qū)域，另外在ampr基因內(nèi)部還有PstI等3個限制性內(nèi)切酶的切割位點(diǎn)，這些位點(diǎn)上克隆外源DNA時都會導(dǎo)致抗性基因的插入失活，從而為轉(zhuǎn)化子的選擇提供了很大的方便。 pBR322 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體tetr

15、基因的插入失活基因的插入失活4.1.4.3 pUC 質(zhì)粒載體質(zhì)粒載體 pUC質(zhì)粒載體是在pBR322的基礎(chǔ)上，使用多克隆位點(diǎn)（MCS）技術(shù)，組入了一個在其5-端帶有一段MCS位點(diǎn)的lacZ基因，從而發(fā)展成為具有雙功能檢測特性的新型質(zhì)粒載體系列。 pUC質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)：有以下4個組成部分 來自pBR322的復(fù)制起點(diǎn)； 無限制位點(diǎn)的氨芐青霉素抗性基因（ ampr）； 大腸桿菌-半乳糖苷酶基因（lacZ）的啟動子及其編碼 -肽鏈的DNA序列，此結(jié)構(gòu)特稱為lacZ基因； 位于lacZ基因中的靠近5-端的一段MCS位點(diǎn)（并不 破壞lacZ基因的功能） pUC18 及及 pUC19 質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)（

16、質(zhì)粒載體的多克隆位點(diǎn)（MCS）pUC 質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn)質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn) 分子量小拷貝數(shù)高，分子量只有2.7kb左右，而拷貝數(shù)未經(jīng) 氯霉素擴(kuò)增即可高達(dá)500700個/細(xì)胞； 適用于組織化學(xué)方法檢測重組體。由于有l(wèi)acZ基因，所編碼的-肽鏈可參與互補(bǔ)，因而可用X-gal顯色的組織化學(xué)方法一步實(shí)現(xiàn)對重組體轉(zhuǎn)化子克隆的鑒定。 具有多克隆位點(diǎn)MCS區(qū)段，而且與M13mp8噬菌體的MCS 相同。因此在MCS上克隆的外源DNA片段可以方便地轉(zhuǎn)移 到M13mp8載體上進(jìn)行測序。同時，由于有不同限制位點(diǎn)， 還可以把具有不同粘性末端的外源DNA片段直接克隆到 pUC質(zhì)粒載體上。4.1.4.4 其它重要質(zhì)粒載體其它重要

17、質(zhì)粒載體（1）喪失遷移功能的質(zhì)粒載體）喪失遷移功能的質(zhì)粒載體pBR327 pBR327是從pBR322改建而來，比pBR322缺失了一條1.09kb的DNA片段，導(dǎo)致在復(fù)制和結(jié)合能力方面發(fā)生了改變，但氨芐青霉素抗性和四環(huán)素抗性的基因保持完整。pBR327有如下2個 主要特點(diǎn)： 擁有較高的拷貝數(shù)， 平均每個大腸桿菌 寄主細(xì)胞可達(dá)30 45份； 由于失去了bom位點(diǎn)， 不能提高結(jié)合而轉(zhuǎn)移， 具有更高的安全系數(shù)。（2）能在體外轉(zhuǎn)錄克隆基因的質(zhì)粒載體）能在體外轉(zhuǎn)錄克隆基因的質(zhì)粒載體pGEM-3Z pGEM-3Z由pUC系列質(zhì)粒載體派生而來，是與pUC系列十分類似的小分子質(zhì)粒載體。有一個氨芐青霉素抗性基

18、因和一個 lacZ基因，后面插入了一段含有EcoRI等13個限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的多克隆位點(diǎn)（MCS）。 pGEM-3Z與pUC系列質(zhì)粒載體的主要區(qū)別在于它具有2個來自噬菌體的啟動子T7啟動子和SP6啟動子，分別位于MCS位點(diǎn)兩側(cè)，取向相反。它們?yōu)門7或SP6的RNA聚合酶提供了特意性的識別位點(diǎn)。 pGEM-3Z和 pGEM-3Z的差別在于T7啟動子和SP6啟動子的位置互換，取向相反。 這樣的載體還有pSP64和Psp65質(zhì)粒載體，也是由pUC系列質(zhì)粒載體派生而來。這些載體都可以在體外轉(zhuǎn)錄體系中進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯克隆的外源基因。pGEM-3Z pGEM-3Z 質(zhì)粒載體及質(zhì)粒載體及 其克隆位點(diǎn)其克隆

19、位點(diǎn) 序列圖序列圖pSP64和Psp65質(zhì)粒載體：含有噬菌體SP6的啟動子，兩者之間的差別在于MCS位點(diǎn)取向彼此相反（3）穿梭質(zhì)粒載體）穿梭質(zhì)粒載體 所謂的穿梭質(zhì)粒載體是指一類人工構(gòu)建的，具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記，可在兩種不同的寄主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。 以大腸桿菌細(xì)胞為寄主進(jìn)行基因操作具有技術(shù)成熟、方便實(shí)用等很多優(yōu)點(diǎn)，而在其它的原核生物或真核生物細(xì)胞中進(jìn)行直接的基因操作總是有很多麻煩的問題有待解決。所以，構(gòu)建能夠穿梭于大腸桿菌與其它生物細(xì)胞之間的載體就能解決這些難題了。 常見的穿梭質(zhì)粒載體有大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒載體、大腸桿菌-釀酒酵母穿梭質(zhì)粒載體等，應(yīng)用這樣的載體，可以

20、很方便地在大腸桿菌細(xì)胞中進(jìn)行重組DNA操作和增殖，然后在返回到枯草芽孢桿菌或釀酒酵母中進(jìn)行研究。 現(xiàn)在也有大腸桿菌和動物細(xì)胞之間的穿梭質(zhì)粒載體，如利用大腸桿菌和牛乳頭瘤病毒構(gòu)建的pBPV-BV1。成功克隆到人-干擾素基因，并在多種動物細(xì)胞中得到表達(dá)。舉例說明舉例說明大腸桿菌大腸桿菌-釀酒釀酒 酵母穿梭質(zhì)粒載體酵母穿梭質(zhì)粒載體含有兩種分別來自大腸桿菌 和釀酒酵母的復(fù)制起點(diǎn)和選 擇標(biāo)記，另有一個多克隆位 點(diǎn)。 （a）轉(zhuǎn)化Amps大腸桿菌細(xì)胞； （b）轉(zhuǎn)化LEU釀酒酵母細(xì)胞； （c）質(zhì)粒在兩種細(xì)胞之間穿梭； （d）涂布在含氨芐青霉素的平 板上選擇Ampr大腸桿菌轉(zhuǎn) 化子； （e）涂布在無亮氨酸的平板

21、上 選擇leu釀酒酵母轉(zhuǎn)化子。4.2 噬菌體載體和柯斯載體噬菌體載體和柯斯載體4.2.1 噬菌體載體噬菌體載體 噬菌體是迄今為止研究得最為詳盡的一種大腸桿菌噬菌體，它與大腸桿菌一樣，是同現(xiàn)代分子生物學(xué)及分子遺傳學(xué)的創(chuàng)立和發(fā)展過程密切相關(guān)的。 噬菌體的分子量為31106dal，基因組DNA分子的長度為48.502kb，已經(jīng)定位的 噬菌體的基因至少有61個，其中有一半左右參與噬菌體生命周期的活動稱之為 噬菌體的必要基因；另一部分基因可以被外源基因或DNA取代而并不影響噬菌體的生命功能稱之為非必要基因；在 噬菌體線性雙鏈DNA分子的末端，各有一條由12個核苷酸組成的彼此完全互補(bǔ) 的5單鏈突出序列稱之

22、為粘性末端。感染大腸桿菌后， 噬菌體會迅速以粘性末端之間的互補(bǔ)作用而形成雙鏈環(huán)狀DNA分子，這個由粘性末端結(jié)合形成的雙鏈區(qū)稱為cos位點(diǎn)。4.2.1.1 噬菌體載體的噬菌體載體的 構(gòu)建及其主要類型構(gòu)建及其主要類型（1）構(gòu)建）構(gòu)建 噬菌體載體噬菌體載體 的基本原理的基本原理 由于野生型 噬菌 體DNA序列中常用的限 制性內(nèi)切酶位點(diǎn)過多， 所以，首先消去多余的 限制位點(diǎn)和切除非必要 區(qū)段。 噬菌體噬菌體DNA限限 制位點(diǎn)示意圖制位點(diǎn)示意圖（2） 噬菌體載體的主要類型噬菌體載體的主要類型A 插入型載體插入型載體 具有外源DNA插入克隆位點(diǎn)，并有插入失活效應(yīng)，克隆的DNA片段長度在10kb以內(nèi)，廣泛應(yīng)

23、用與cDNA或小片段DNA的克隆。根據(jù)其插入失活效應(yīng)的特異性，可分為以下兩種亞型：免疫功能失活的插入型載體免疫功能失活的插入型載體：這類載體的免疫區(qū)內(nèi)帶有一兩種限制性內(nèi)切酶單切位點(diǎn)，當(dāng)外源DNA片段插入后其免疫性遭受破壞，不能進(jìn)入溶源周期而形成清晰的噬菌斑；而沒有外源DNA插入的親本噬菌體會形成渾濁的噬菌斑，為分離重組體分子提供了方便。-半乳糖苷酶失活的插入型載體半乳糖苷酶失活的插入型載體：許多 噬菌體載體基因組中含有一段大腸桿菌的lac5區(qū)段，其中有l(wèi)acZ基因，插入位點(diǎn)在lac5區(qū)段內(nèi)，當(dāng)外源DNA片段插入后，其-半乳糖苷酶基因失活。用這種載體感染大腸桿菌lac指示菌，涂布在含有IPTG和

24、Xgal的培養(yǎng)基平板上，就會形成只能形成白色菌落。而由未插入外源DNA片段的載體感染大腸桿菌lac指示菌，涂布在含有IPTG和Xgal的培養(yǎng)基平板上，就會形成藍(lán)色菌落。B 替換型載體替換型載體 這種載體的中央部分有一個可以被外源DNA片段所取代的DNA片段，可取代部分兩側(cè)的多克隆位點(diǎn)是反向重復(fù)序列。當(dāng)外源DNA片段插入時，一對克隆位點(diǎn)之間的DNA片段便會被置換掉，從而有效地提高了克隆外源DNA片段的能力。替換型載體可承受15kb外源DNA片段的有效克隆能力。（3）Charen噬菌體載體噬菌體載體 Charen噬菌體（charen bacteriophage）載體是 噬菌體基礎(chǔ)上發(fā)展出來的一種特

25、殊的噬菌體載體。許多Charen噬菌體載體都帶有 -半乳糖苷酶基因以及它的操縱區(qū)和啟動子的lac5取代片段，從而在感染大腸桿菌lac指示菌后產(chǎn)生不同顏色的菌落而識別重組體或非重組體。 Charen噬菌體載體中既有插入型載體，也有替換型載體。 Charen噬菌體載體克隆外源DNA片段的一般程序 首先，分離線性載體DNA，限制酶切消化，分離片段取兩臂；其次，將分離得到的兩條載體臂段與經(jīng)相同限制酶消化的外源DNA片段混合，加入連接酶連接；第三，將連接物與包裝蛋白混合溫育，使之包裝成具有感染能力的噬菌體顆粒；最后把包裝產(chǎn)物涂布在敏感細(xì)菌平面上進(jìn)行組織化學(xué)檢測。4.2.1.2 重組體重組體DNA分子的體

26、外包裝分子的體外包裝（1） 重組體重組體DNA分子的轉(zhuǎn)染作用分子的轉(zhuǎn)染作用 轉(zhuǎn)染（轉(zhuǎn)染（transfection）:由寄主細(xì)胞捕獲裸露的噬菌體DNA的過程。 在用 噬菌體載體進(jìn)行轉(zhuǎn)染時，由于轉(zhuǎn)染效率低下。重組體分子轉(zhuǎn)染效率只要103104（每微克DNA轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的噬菌斑數(shù)目），不能滿足基因轉(zhuǎn)移的要求，所以一般采用體外包裝的方法加以解決。（2） DNA的體外包裝的體外包裝 所謂 DNA的體外包裝，就是指在體外試管中完成發(fā)生與寄主細(xì)胞內(nèi)的包裝過程。（3） 噬菌體噬菌體DNA的包裝限制的包裝限制 噬菌體頭部外殼蛋白容納DNA的能力是有一定限度的：上限不得超過正常野生型 DNA總量的5%；而低限有不得少

27、于野生型 DNA總量的75% 。也就是說， 噬菌體頭部外殼蛋白的包裝范圍控制在野生型 DNA長度的75%105%之間。 噬菌體DNA長度為48.502kb，其中，編碼必要基因的區(qū)段占28kb，如果說包裝上限為51kb， 那么， 噬菌體載體克隆外源DNA片段的理論極限值是23kb 。而在實(shí)際應(yīng)用中，克隆的有效長度只有15kb 。4.2.1.3 重組體的選擇方法重組體的選擇方法（1） cI 基因功能選擇法基因功能選擇法 cI 基因失活會寄主細(xì)胞無法溶源化，形成清亮型噬菌斑。而非重組體分子具有溶源化效應(yīng)，形成渾濁的菌落。（2）lacZ基因功能選擇法基因功能選擇法 以前講過的組織化學(xué)檢測法。（3）sP

28、i選擇法選擇法 噬菌體的red和gam基因的編碼產(chǎn)物抑制噬菌體在P2噬菌體溶源性的大腸桿菌細(xì)胞中正常生長，而這2個基因的突變型或缺失體噬菌體可在P2噬菌體溶源性的大腸桿菌細(xì)胞中正常生長4.2.2 柯斯質(zhì)粒載體柯斯質(zhì)粒載體4.2.2.1 柯斯質(zhì)粒載體的構(gòu)建柯斯質(zhì)粒載體的構(gòu)建 柯斯質(zhì)粒載體，cosmid（cos site-carrying plasmid）的原意是帶有粘性末端（cos）的質(zhì)粒，是人工構(gòu)建的含有 噬菌體的cos序列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊質(zhì)粒載體。 構(gòu)建這種載體的主要目的是提高質(zhì)粒載體的克隆大片段外源DNA的容量，使其更適合應(yīng)用于真核基因的克隆?？滤官|(zhì)粒載體的構(gòu)建以柯斯質(zhì)粒載體的構(gòu)建以pH

29、C79為例為例： 用 噬菌體基因組的cro-rII的Bgl II限制片段取代pBR322質(zhì)粒DNA的位于14591666bp之間的Sau3A片斷，產(chǎn)生出具有Bgl II單切位點(diǎn)的重組體分子。 通過產(chǎn)生的Bgl II單切位點(diǎn)將帶有cos序列，長度為1.78kb的 DNA之Bgl II片段插入進(jìn)去，得到了柯斯質(zhì)粒pHC79。 pHC79的cos位點(diǎn)兩側(cè)還具有與 噬菌體包裝有關(guān)的DNA短序列，而質(zhì)粒DNA部分則是一個完整的復(fù)制子，編碼著一個復(fù)制起點(diǎn)和兩個抗菌素抗性基因ampr和tetr。 pHC79兼?zhèn)淞耸删w載體和pBR322質(zhì)粒載體兩方面的優(yōu)點(diǎn)，其克隆能力為3145kb。4.2.2.2 柯斯質(zhì)粒

30、載體的特點(diǎn)柯斯質(zhì)粒載體的特點(diǎn)（1）具有）具有 噬菌體的特性噬菌體的特性：柯斯質(zhì)粒載體克隆了合適長度的外源DNA片段，并在體外包裝成噬菌體顆粒之后，可以高效率地轉(zhuǎn)導(dǎo)對 噬菌體敏感的大腸桿菌細(xì)胞。進(jìn)入寄主細(xì)胞后便通過cos序列環(huán)化起來。但由于缺失了 噬菌體部分必要基因，因此并不能通過溶菌周期形成子代噬菌體顆粒。（2）具有質(zhì)粒載體的特性）具有質(zhì)粒載體的特性：由于有了質(zhì)粒復(fù)制子，柯斯質(zhì)粒載體能夠在寄主細(xì)胞內(nèi)像質(zhì)粒一樣進(jìn)行復(fù)制，而且還可以通過氯霉素來擴(kuò)增?？滤官|(zhì)粒載體還可以通過抗菌素抗性及其插入失活特點(diǎn)來進(jìn)行重組體的選擇。（3）具有高容量的克隆能力）具有高容量的克隆能力：柯斯質(zhì)粒載體只有復(fù)制子、選擇標(biāo)記

31、和cos序列等必要序列，其本身的分子量較小，長度一般只有57kb，克隆容量可達(dá)45kb左右。由于存在包裝限制，柯斯質(zhì)粒載體適合克隆大片段DNA的克隆。（4）具有與同源序列的質(zhì)粒進(jìn)行重組整合的能力）具有與同源序列的質(zhì)粒進(jìn)行重組整合的能力：在與具有同源序列的質(zhì)粒載體共存與同一個寄主細(xì)胞時，可通過同源部分形成共和體分子。4.2.2.3 柯斯克隆柯斯克隆 柯斯克隆（柯斯克?。╟osmid cosmid cloningcloning）: :應(yīng)用柯斯質(zhì)粒載體，在大腸桿應(yīng)用柯斯質(zhì)粒載體，在大腸桿菌細(xì)胞中克隆大片段的真核基因組菌細(xì)胞中克隆大片段的真核基因組DNADNA技術(shù)。技術(shù)。 先用限制性內(nèi)切酶局部消化真核

32、生物的先用限制性內(nèi)切酶局部消化真核生物的DNADNA，產(chǎn)生出來大，產(chǎn)生出來大分子量外源分子量外源DNADNA片段，與經(jīng)同樣的限制酶酶切的柯斯質(zhì)粒線性片段，與經(jīng)同樣的限制酶酶切的柯斯質(zhì)粒線性DNADNA分分子進(jìn)行體外連接反應(yīng)。這樣產(chǎn)生的連接物群體中，有一定比例的分子進(jìn)行體外連接反應(yīng)。這樣產(chǎn)生的連接物群體中，有一定比例的分子是兩端各有一個取向一樣的子是兩端各有一個取向一樣的coscos位點(diǎn)的長度約為位點(diǎn)的長度約為40kb40kb的外源的外源DNADNA片片段段。 然后加入然后加入 噬菌體包裝連接物，其中的一種噬菌體包裝連接物，其中的一種coscos位點(diǎn)特位點(diǎn)特異的切割體系異的切割體系末端酶（末端酶

33、（terminaseterminase，TerTer），識別兩個相距適宜），識別兩個相距適宜的的coscos位點(diǎn)，將多連體分子切割成位點(diǎn)，將多連體分子切割成 單位長度的片段，將其包裝到單位長度的片段，將其包裝到 噬菌體頭部。噬菌體頭部。 這樣產(chǎn)生的這樣產(chǎn)生的“ 噬菌體噬菌體”可以感染大腸桿菌，包裝在可以感染大腸桿菌，包裝在頭部內(nèi)的真核頭部內(nèi)的真核DNA-cosDNA-cos雜種分子便通過雜種分子便通過coscos位點(diǎn)環(huán)化起來。并按著質(zhì)位點(diǎn)環(huán)化起來。并按著質(zhì)粒分子的方式在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)其抗藥性標(biāo)記。粒分子的方式在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)其抗藥性標(biāo)記。柯斯克隆示意圖4.2.3 單

34、鏈?zhǔn)删w載體單鏈?zhǔn)删w載體 M13、f1 和 fd 等是一類親緣關(guān)系密切的絲狀大腸桿菌噬菌體，都含有長度為6.4kb、彼此具有高度同源性的單鏈環(huán)狀DNA分子。 單鏈單鏈DNA噬菌體載體有別于其它載體的的優(yōu)越性是：噬菌體載體有別于其它載體的的優(yōu)越性是： 復(fù)制以雙鏈環(huán)狀復(fù)制以雙鏈環(huán)狀DNA（replication form DNA，RF DNA， 復(fù)制性復(fù)制性DNA）為中間媒介，可以象質(zhì)粒）為中間媒介，可以象質(zhì)粒DNA一樣在體外進(jìn)一樣在體外進(jìn) 行純化和操作。行純化和操作。 無論是無論是RF DNA還是還是ssDNA，都能感染感受態(tài)的大腸桿菌寄，都能感染感受態(tài)的大腸桿菌寄 主，而且根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法的不同

35、，可形成噬菌斑或菌落。主，而且根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法的不同，可形成噬菌斑或菌落。 單鏈單鏈DNA噬菌體顆粒的大小取決于噬菌體顆粒的大小取決于DNA的多寡，并不存在包裝的多寡，并不存在包裝 限制。有成功包裝總長度為限制。有成功包裝總長度為M13 6倍的倍的DNA分子的報道。分子的報道。 應(yīng)用單鏈應(yīng)用單鏈DNA噬菌體，很容易地測定出外源噬菌體，很容易地測定出外源DNA片段的插入向。片段的插入向。 可產(chǎn)生大量純化的含外源可產(chǎn)生大量純化的含外源DNA片段插入的單鏈片段插入的單鏈DNA分子。可進(jìn)分子?？蛇M(jìn) 行雙脫氧測序，也可用于標(biāo)記探針，還可用于寡核苷酸定點(diǎn)突變。行雙脫氧測序，也可用于標(biāo)記探針，還可用于寡核苷酸定

36、點(diǎn)突變。4.2.3.1 M13 噬菌體及噬菌體及M13克隆體系克隆體系（1）M13 噬菌體概述噬菌體概述 M13 噬菌體顆粒的噬菌體顆粒的 外形呈絲狀外形呈絲狀,大小范圍為大小范圍為 900nm9nm，顆粒中，顆粒中 包裝的只是（包裝的只是（+）鏈的）鏈的 DNA，也稱為感染性的，也稱為感染性的 單鏈。單鏈。 M13 是雄性大腸桿菌特有的噬菌體，只能感染帶有F性須的大腸桿菌菌株。不過M13 噬菌體DNA亦可以通過轉(zhuǎn)染作用導(dǎo)入雌性大腸桿菌細(xì)胞。M13 噬菌體首先吸附在F性須的末端；在基因III編碼的向?qū)У鞍鬃饔孟?，其ssDNA基因組通過F性須進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)；M13的ssDNA便在基因II編碼

37、的蛋白質(zhì)的作用下，形成RF DNA；此種DNA指導(dǎo)合成子代M13 單鏈基因組；這些單鏈的M13 DNA隨之被包裝成噬菌體顆粒，并擠壓出寄主細(xì)胞。M13 單鏈單鏈DNA噬菌體的生命周期噬菌體的生命周期 M13 噬菌體在感染的大腸桿菌噬菌體在感染的大腸桿菌 細(xì)胞中的復(fù)制細(xì)胞中的復(fù)制（a）感染性的單鏈環(huán)狀（+）DNA在寄主 酶的作用下轉(zhuǎn)變成雙鏈的RF DNA；（b）RF DNA按 形式進(jìn)行若干復(fù)制循環(huán)；（c）RF DNA的負(fù)鏈轉(zhuǎn)錄成M13的mRNA；（d）M13基因II編碼的蛋白質(zhì)在RF DNA 正鏈的特定位點(diǎn)切割形成切口； M13基因組的擴(kuò)增正式開始（e）利用大腸桿菌DNA聚合酶I，復(fù)制叉 沿負(fù)鏈

38、移動，不斷合成正鏈；（f）M13基因II編碼的蛋白質(zhì)切下完整的 子代正鏈，并進(jìn)行環(huán)化；（g）繼續(xù)合成子代正鏈。M13噬噬菌菌體體顆顆粒粒在在感感染染的的大大腸腸桿桿菌菌細(xì)細(xì)胞胞中中的的復(fù)復(fù)制制過過程程 M13 噬菌體的復(fù)制過程中，RF DNA快速增殖到每個細(xì)胞含量達(dá)200個拷貝時，由于細(xì)胞內(nèi)累計了足夠數(shù)量的由噬菌體基因V編碼的單鏈特異的DNA結(jié)合蛋白質(zhì)，RF DNA的復(fù)制就變成了不對稱的形式。這是因?yàn)檫@種蛋白質(zhì)與正鏈DNA結(jié)合，阻斷了其互補(bǔ)鏈負(fù)鏈的合成，繼續(xù)進(jìn)行的只是正鏈的不斷合成。 合成出來的正鏈與基因V的編碼產(chǎn)物形成特異的DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物，然后轉(zhuǎn)移到寄主的細(xì)胞膜，同時基因V蛋白質(zhì)脫落，

39、正鏈DNA從寄主細(xì)胞膜溢出的過程中，被外殼蛋白質(zhì)包裹成噬菌體顆粒的。正因?yàn)檫@樣，M13 噬菌體不存在嚴(yán)格的包裝限制問題，M13 噬菌體載體也就有了較大的克隆能力。 M13 噬菌體雖然不會導(dǎo)致寄主細(xì)胞發(fā)生溶菌效應(yīng)，但被感染的寄主細(xì)胞的生長和分裂會受到影響，其速度僅為正常細(xì)胞的1/23/4。每個寄主細(xì)胞每個時代可釋放出1000個左右的子代噬菌體顆粒。 由于RF DNA在寄主細(xì)胞中以高拷貝數(shù)的形式存在，所以很容易純化出來供作基因克隆載體使用。同時，由于培養(yǎng)物中存在大量的噬菌體，也很容易分離到M13 噬菌體顆粒，有利于制備大量的單鏈模板DNA。（2）M13克隆體系克隆體系 -半乳糖苷酶顯色反應(yīng)原理半乳

40、糖苷酶顯色反應(yīng)原理 用于基因克隆的M13載體或大腸桿菌寄主，都不能單獨(dú)產(chǎn)生-半乳糖苷酶，只有將兩者結(jié)合在一起時才能形成有功能的-半乳糖苷酶。而且這種酶的活性還可以用Xgel（X-gel）顯色反應(yīng)測定出來，是一種組織化學(xué)測試技術(shù)： - -半乳糖苷酶可以將無色的化合物半乳糖苷酶可以將無色的化合物XgelXgel（5-5-溴溴-4-4-氯氯-3-3-吲哚吲哚- -D-D-半乳糖苷）切割成半乳糖和蘭色的底物半乳糖苷）切割成半乳糖和蘭色的底物5-5-溴溴-4-4-氯氯- -靛靛藍(lán)。藍(lán)。 順反子內(nèi)互補(bǔ)作用順反子內(nèi)互補(bǔ)作用：編碼同樣的多肽鏈序列但又各具有一個突變的兩個基因，聯(lián)合產(chǎn)生一種有功能的蛋白質(zhì)多肽的生

41、化過程。需要說明的是，這種互補(bǔ)作用并不是普遍存在的。 通過DNA重組技術(shù)，構(gòu)建了只含有-半乳糖苷酶基因一小部分序列的M13派生載體。這段序列只編碼-半乳糖苷酶的氨基末端，即-肽鏈，可通過順反子內(nèi)互補(bǔ)作用檢測其活性。舉例：舉例： lac缺失突變lacZ（M15），簡稱M15基因，合成的是一種缺失了1141氨基酸的缺陷性-半乳糖苷酶，失去了四聚化作用的功能，又稱M15多肽。它的功能可以由體外加入的-半乳糖苷酶的溴化氰片段（292氨基酸）來恢復(fù)。這里，溴化氰片段是-給體，M15多肽是-受體，這種功能補(bǔ)償現(xiàn)象叫做-互補(bǔ)作用互補(bǔ)作用。 用一種特定的-半乳糖苷酶基因的HindII片段編碼的多肽替代溴化氰片

42、段同樣能發(fā)生-互補(bǔ)作用。在M13克隆體系中，lacHindII片段位于M13 噬菌體載體分子上，而大腸桿菌寄主細(xì)胞的F質(zhì)粒則帶有M15突變。 M13 載體所攜帶的lacHindII片段上具有l(wèi)ac操縱子的操縱區(qū)和啟動子，所以被感染的細(xì)胞中， -半乳糖苷酶的合成將是組成型的。因?yàn)?00個左右的RF DNA的存在使普通lac+的阻遏狀態(tài)（每個細(xì)胞只要10個左右的阻遏物分子）被消除。 為了克服這種組成性，可以將lac阻遏基因的Iq突變引入寄主細(xì)胞，產(chǎn)生出十余倍超量的阻遏物分子，去補(bǔ)償大量的M13 RF DNA分子。在lac Iq 突變基因的寄主細(xì)胞中，給lac操縱子加入誘導(dǎo)物IPTG（異丙基硫代-D

43、-半乳糖苷）就可以激活lacHindII片段的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。 IPTG是一種乳糖類似物，在不存在底物乳糖的條件下，它可以誘導(dǎo)細(xì)胞合成-半乳糖苷酶。所以我們稱其為-半乳糖苷酶的安慰誘導(dǎo)物。在細(xì)菌固體培養(yǎng)基平板上加入IPTG即可起到誘導(dǎo)作用。 通常在M13克隆體系中使用的大腸桿菌菌株是JM101，其lacZ基因被缺失掉了，但在其F質(zhì)粒上有一個M15基因和lac Iq 突變基因，可以產(chǎn)生超量的lac阻遏物，這就使lac操縱子的表達(dá)置于從培養(yǎng)基中滲入的IPTG的調(diào)節(jié)控制之下。IPTG分子結(jié)構(gòu)式 M13 載體系列的發(fā)展載體系列的發(fā)展 與噬菌體不同的是，M13 噬菌體并不存在明顯的非必要區(qū)段，但在其基因II和

44、IV之間有一個長度為507個核苷酸的唯一基因間區(qū)段（第5498至6005核苷酸），該序列上存在著M13 DNA的復(fù)制起點(diǎn)，就噬菌體的發(fā)育功能而言，并不需要該區(qū)段的完整性，可以在此插入外源DNA。由此發(fā)展出了M13克隆載體系列。 M13 載體系列命名為mpn， 其中n代表整數(shù)，如M13mp8、 M13mp9等。M13 載體系列載體系列的系譜圖的系譜圖NMU：亞硝基-N-甲基尿烷lacHindII片段片段=lacZOPI：包括：包括lacI、lac啟動子（啟動子（P）和）和lac操縱子（操縱子（O）以及）以及l(fā)acZ.lacZ :頭145個氨基酸密碼子lac HindII片段的克隆步驟：片段的克隆

45、步驟： 首先用限制酶BsuI局部消化M13 RF DNA（共有10個識別位點(diǎn)），并通過凝膠電泳分離出全長的單體分子，然后再同大腸桿菌的lac HindII片段作平末端連接。由此產(chǎn)生的重組DNA分子中， 只有l(wèi)ac HindII片段插入到基因間非必要區(qū)段（此區(qū)段有一個BsuI識別位點(diǎn)）內(nèi)的才有存活的能力。同時，也可以通過插入失活lac HindII片段等方法對外源DNA片段的克隆進(jìn)行選擇。 在lac HindII片段上，只有AvaII、Bgl II、PvuI三種限制酶單一識別位點(diǎn)，還有PvuII限制酶三個識別位點(diǎn)，而基因克隆中常用EcoRI、HindIII等一些酶都不存在相應(yīng)的識別位點(diǎn)。為了彌補(bǔ)

46、這個不足，1978年，B.Gronenborn和J.Messing將一個EcoRI限制位點(diǎn)導(dǎo)入M13mp1載體的lac HindII片段上，得到了M13mp2載體通過對通過對M13mp1載載體的甲基化而獲得體的甲基化而獲得M13mp2載體過程：載體過程：M13mp1載體的第5個氨基酸密碼子附近的序列為GGATTC，對其第2個核苷酸G進(jìn)行甲基化就成為限制酶EcoRI的限制位點(diǎn)。 從從M13mp2載體到載體到M13mp7載體的過程載體的過程 原則：將必要區(qū)段內(nèi)相應(yīng)的限制酶識別位點(diǎn)消除，在非必要原則：將必要區(qū)段內(nèi)相應(yīng)的限制酶識別位點(diǎn)消除，在非必要 區(qū)段內(nèi)增加常用限制酶識別位點(diǎn)。區(qū)段內(nèi)增加常用限制酶識

47、別位點(diǎn)。 若干種若干種M13 噬菌體載體的多克隆位點(diǎn)噬菌體載體的多克隆位點(diǎn) M13 載體系列的優(yōu)點(diǎn)載體系列的優(yōu)點(diǎn) 第一、這類載體的基因組中有l(wèi)ac操縱子的-半乳糖苷酶基因片段（HindII片段）其中插入了一段密集的多克隆位點(diǎn)的序列。 第二、由于M13載體是應(yīng)用基因工程技術(shù)成對構(gòu)建的，可以有效地克隆外源雙鏈DNA分子中的每一條鏈。其中，可根據(jù)外源DNA的插入取向或雙酶切定向插入的方法克隆并分析每一條DNA鏈。 外源外源DNADNA片段在片段在 M13M13噬菌體載體噬菌體載體 上的定向克隆上的定向克隆 一對一對M13 噬菌體載體噬菌體載體（M13mp10/M13mp11） 分子結(jié)構(gòu)圖分子結(jié)構(gòu)圖

48、都帶有一段限制位點(diǎn)都帶有一段限制位點(diǎn) 相同而取向相反的多相同而取向相反的多 克隆位點(diǎn)序列克隆位點(diǎn)序列（3）噬菌體展示載體（）噬菌體展示載體（phage display vectors） 象M13這樣的單鏈DNA噬菌體顆粒的表面存在著35個拷貝的基因III編碼的蛋白質(zhì)。這類蛋白質(zhì)對于噬菌體顆粒的正確組裝以及對大腸桿菌性須的吸附過程起到重要的作用。 基于這種事實(shí)，G.P.Smith于1985年建立了一種專門在絲狀噬菌體表面表達(dá)蛋白質(zhì)或多肽的所謂噬菌體展示技術(shù)噬菌體展示技術(shù)（phage display）。后又構(gòu)建了一類特殊用途的噬菌體展示載體。 當(dāng)外源DNA片段被插入在噬菌體展示載體的基因III編碼序列中，在兩者讀碼結(jié)構(gòu)保持一致的情況下，就會產(chǎn)生出由克隆基因與基因III聯(lián)合編碼的融合蛋白質(zhì)。應(yīng)應(yīng)用用噬噬菌菌體體展展示示隨隨機(jī)機(jī)多多肽肽基基本本原原理理 應(yīng)用噬菌體展示載體應(yīng)用噬菌體展示載體 分離分離hGH變體的示意圖變體的示意圖（a a）隨機(jī)突變的）隨機(jī)突變的hGH cDNAhGH cDNA文庫與噬文庫與噬 菌體展示載體作體外連接；菌體展示載體作體外連接；（b b）轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞；）轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞；（c c）制備的噬菌體過）制備的噬菌體過hGHhGH受體層析柱；受體層析柱；（d d）洗脫結(jié)合的）洗脫結(jié)合的