(分子生物學(xué)本科生課件)分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)-2014本科

1、( (分子生物學(xué)本科分子生物學(xué)本科生課件生課件) )分子生物分子生物學(xué)相關(guān)技術(shù)學(xué)相關(guān)技術(shù)-2014-2014本科本科l原核表達的已知蛋白l細胞裂解液中的未知蛋白質(zhì)l應(yīng)用cDNA文庫，進行體外翻譯的蛋白質(zhì)文庫中的未知蛋白l半定量檢測蛋白與蛋白的親和作用Protein Biochemistry Lab Nankai UniversityGST Protein XGST35S-labled cell lysate(glutathione-sepharose beads) (glutathione-sepharose beads)35S-labled cell lysateGSTProtein XGS

2、TGSTInteract at 40CMicrofuge to collect complexesProtein Biochemistry Lab Nankai University實實驗驗步步驟驟1 2 3autoradiographAnalyze by SDS-PAGELane1. MarkerLane2. GST-proteinXLane3. GSTGSTGSTProtein XProtein Biochemistry Lab Nankai University實實驗驗步步驟驟prepare proteinextract from brainmix and incubateexpress

3、 GST-fusionprotein in E.colipGEXGSTgene XProtein Biochemistry Lab Nankai UniversityProtein Biochemistry Lab Nankai UniversityGST-fusion proteinGST alone舉 例inputGSTY-GFP + + +X-GSTY-GFPX-GFP + + +GSTinput105kDAnti-GFPAnti-GFPY-GSTX-GFPProtein Biochemistry Lab Nankai Universityl染色質(zhì)免疫共沉淀一項研究細胞內(nèi)蛋白質(zhì)與染色質(zhì)免

4、疫共沉淀一項研究細胞內(nèi)蛋白質(zhì)與DNA相互作相互作用的實驗技術(shù)。其目的是確定特定蛋白是否結(jié)合于特定用的實驗技術(shù)。其目的是確定特定蛋白是否結(jié)合于特定的基因組區(qū)域。的基因組區(qū)域。lChIP不僅可以檢測體內(nèi)反式因子與不僅可以檢測體內(nèi)反式因子與DNA的動態(tài)作用，還的動態(tài)作用，還可以用來研究組蛋白的表觀遺傳與基因表達的關(guān)系?？梢杂脕硌芯拷M蛋白的表觀遺傳與基因表達的關(guān)系。lChIP與其他方法的結(jié)合，擴大了其應(yīng)用范圍：與其他方法的結(jié)合，擴大了其應(yīng)用范圍：CHIP與基與基因芯片相結(jié)合建立的因芯片相結(jié)合建立的ChIP-on-chip方法已廣泛用于特定反方法已廣泛用于特定反式因子靶基因的高通量篩選；式因子靶基因的高

5、通量篩選；CHIP與體內(nèi)足跡法相結(jié)合，與體內(nèi)足跡法相結(jié)合，用于尋找反式因子的體內(nèi)結(jié)合位點；用于尋找反式因子的體內(nèi)結(jié)合位點；RNA-CHIP用于研用于研究究RNA在基因表達調(diào)控中的作用。在基因表達調(diào)控中的作用。 ChIP的基本原理是在活細胞狀的基本原理是在活細胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)態(tài)下固定蛋白質(zhì)DNA復(fù)合物，復(fù)合物，并將其隨機切斷為一定長度范并將其隨機切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白或其復(fù)特異性地富集目的蛋白或其復(fù)合物結(jié)合的合物結(jié)合的DNA片段，通過對片段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而目的

6、片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的相互作用的信息。信息。甲醛交聯(lián)體內(nèi)的DNA結(jié)合蛋白與DNA。超聲破碎基因組DNA特異性抗體抗體結(jié)合 洗脫非結(jié)合DNA片段洗脫獲得特異性結(jié)合DNA片段，用于檢測l要研究基因的功能，基因的調(diào)控機制非常重要，基因的要研究基因的功能，基因的調(diào)控機制非常重要，基因的表達產(chǎn)物很復(fù)雜并難以準(zhǔn)確的定量和定性。研究報告基表達產(chǎn)物很復(fù)雜并難以準(zhǔn)確的定量和定性。研究報告基因系統(tǒng)成為一種簡單的研究基因調(diào)控的方法。因系統(tǒng)成為一種簡單的研究基因調(diào)控的方法。l對真核基因調(diào)控的了解，主要來自野生型和突變型的假對真核基因調(diào)控的了解，主要來自野生型和突變型的假定順式作

7、用調(diào)控元件的活性測定實驗，是在轉(zhuǎn)染的真核定順式作用調(diào)控元件的活性測定實驗，是在轉(zhuǎn)染的真核細胞中進行的。在大多數(shù)情況下不直接測定調(diào)控元件的細胞中進行的。在大多數(shù)情況下不直接測定調(diào)控元件的調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄速率的能力調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄速率的能力, ,而是把順式調(diào)控元件與一種編碼新而是把順式調(diào)控元件與一種編碼新的產(chǎn)物的的產(chǎn)物的, ,被稱為報告基因的基因序列連接起來被稱為報告基因的基因序列連接起來, ,在基因在基因的轉(zhuǎn)錄過程中的轉(zhuǎn)錄過程中, ,測定報告基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的量測定報告基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的量, ,來判斷順來判斷順式調(diào)控元件的調(diào)控能力。式調(diào)控元件的調(diào)控能力。 一般的報告基因需要滿足以下幾個條件：一般的報告基因需要滿足以

8、下幾個條件：基因被克隆并且已知全序列；基因被克隆并且已知全序列；宿主不存在報告基因產(chǎn)物或者不存在類似的內(nèi)源宿主不存在報告基因產(chǎn)物或者不存在類似的內(nèi)源性物質(zhì)；性物質(zhì)；報告基因編碼的產(chǎn)物的檢測應(yīng)該快速、簡便、靈報告基因編碼的產(chǎn)物的檢測應(yīng)該快速、簡便、靈敏度高而且重現(xiàn)性好；敏度高而且重現(xiàn)性好；細胞內(nèi)其它的基因產(chǎn)物不會干擾報告基因產(chǎn)物的細胞內(nèi)其它的基因產(chǎn)物不會干擾報告基因產(chǎn)物的檢測。報告基因的表達同樣也不能影響或改變細檢測。報告基因的表達同樣也不能影響或改變細胞正常的生理活性。胞正常的生理活性。1.報告基因在細胞或動物內(nèi)表達對其正常的生理作報告基因在細胞或動物內(nèi)表達對其正常的生理作用或活性沒有影響。用

9、或活性沒有影響。 報告基因通常是在報告基因載體質(zhì)粒中與被報告基因通常是在報告基因載體質(zhì)粒中與被檢測基因序列相連檢測基因序列相連, , 提取大腸桿菌中擴增的質(zhì)粒提取大腸桿菌中擴增的質(zhì)粒, ,轉(zhuǎn)染入目的真核細胞中。與此同時還要將一有真轉(zhuǎn)染入目的真核細胞中。與此同時還要將一有真核啟動子和增強子的另一種報告基因質(zhì)粒核啟動子和增強子的另一種報告基因質(zhì)粒, ,共轉(zhuǎn)共轉(zhuǎn)染同一細胞染同一細胞, ,以作為轉(zhuǎn)染率的內(nèi)對照。以作為轉(zhuǎn)染率的內(nèi)對照。 目前已有很多的方法用于報告基因的測定如目前已有很多的方法用于報告基因的測定如: : 比色法、熒光法、生物發(fā)光法、化學(xué)發(fā)光法、比色法、熒光法、生物發(fā)光法、化學(xué)發(fā)光法、酶聯(lián)免

10、疫法及原位染色法及流式細胞儀法。酶聯(lián)免疫法及原位染色法及流式細胞儀法。熒光素酶熒光素酶(luciferase, luc)(luciferase, luc)報告基因報告基因 該酶克隆于北美洲螢火蟲的熒光素酶基因,它能催化甲蟲的熒光素的氧化性羧化作用,發(fā)射出光子,能被光度計或閃爍計數(shù)器捕獲定量。 快速、方便,更具有很好的濃度線性范圍(具有78個數(shù)量級的線性范圍),而被廣泛應(yīng)用。 半乳糖苷酶報告基因半乳糖苷酶報告基因(galatosidase, gal) 大腸桿菌編碼的大腸桿菌編碼的galgal能水解乳糖為半乳糖。雖然能水解乳糖為半乳糖。雖然在很多細菌、植物和動物細胞中存在較高的本底在很多細菌、植物

11、和動物細胞中存在較高的本底, ,而而限制了它的使用限制了它的使用, ,但常用做轉(zhuǎn)染的參照體系。通過使但常用做轉(zhuǎn)染的參照體系。通過使用特定的方法用特定的方法, ,還能夠區(qū)別內(nèi)外源性的還能夠區(qū)別內(nèi)外源性的 gal( gal(改變緩改變緩沖液的等沖液的等) ) 檢測方法檢測方法: :比色法、熒光法、化學(xué)發(fā)光法、比色法、熒光法、化學(xué)發(fā)光法、FACSFACS等。等。 葡萄糖苷酸酶葡萄糖苷酸酶( glucuronidase, GUS)報報告基因告基因 是大腸桿菌的又一水解酶,它能水解葡萄糖苷酸。 主要用于缺乏該酶的病毒性植物病原體、植物、酵母、及真菌等的研究中,在醫(yī)學(xué)研究中相對應(yīng)用較少。 綠色熒光蛋白綠色

12、熒光蛋白(GFP(GFP）報告基因）報告基因 該基因來源于西北太平洋海域的水母。該蛋白在紫外光下發(fā)射熒光,而可以被多種方法檢測。該報告基因檢測不需要底物。 綠熒光蛋白在加熱、變性劑、去垢劑及一般的蛋白酶均不能使它滅活?？捎脽晒怙@微鏡或熒光激活的FACS進行檢測, 能在活細胞條件下觀測,而且能進行細胞內(nèi)的定位分析。能在轉(zhuǎn)基因小鼠中以無害的形式整合于小鼠的DNA中。 分泌型堿性磷酸酶分泌型堿性磷酸酶(Secreted alkaline (Secreted alkaline phosphatase, SEAP)phosphatase, SEAP)報告基因報告基因 該酶為人胎盤堿性磷酸酶(PLAP)的突變體,也有從北大西洋海域中的耐熱細菌中