生化實(shí)驗(yàn)報(bào)告離子交換柱層析分離純化蔗糖酶

1、實(shí)驗(yàn)報(bào)告一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵笕?shí)驗(yàn)材料和主要儀器五、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和處理七、實(shí)驗(yàn)討論和心得二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理四、實(shí)驗(yàn)方法和步驟六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵?、學(xué)習(xí)離子交換層析的基本原理 2、學(xué)習(xí)離子交換層析分離蛋白質(zhì)的基本方法和技術(shù)3、學(xué)習(xí)蔗糖酶活性檢測(cè)的基本原理和方法二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和原理1、離子交換層析由于蔗糖酶的pI偏酸性,所以在pH7.3 緩沖液的環(huán)境中，粗分離純化樣品蔗糖酶帶負(fù)電荷，因此我們用陰離子交換劑可以先與蔗糖酶樣品可逆交換吸附，然后通過用鹽離子強(qiáng)度逐漸提高的洗脫液，使蔗糖酶和其他雜蛋白質(zhì)的電荷被中和，與離子交換劑的親和力降低，把不同的蛋白質(zhì)按所帶電荷的強(qiáng)弱逐一被洗脫下來，從

2、而達(dá)到分離蔗糖酶的目的。2、酶活力檢測(cè)蔗糖酶是一種水解酶，它能蔗糖水解為等量的葡萄糖和果糖（還原糖）。（50水解） 3.5二硝基水楊酸與還原糖共熱被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定范圍內(nèi)還原糖的量和反應(yīng)液的顏色深度成正比。（100顯色）三、實(shí)驗(yàn)材料和主要儀器1、實(shí)驗(yàn)材料 蔗糖酶粗分離純化（溶解即為樣品）2、實(shí)驗(yàn)試劑 DEAE-Sepharose Fast Flow 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 緩沖液 20mmol/L Tris-HCl（1mol/L NaCl）pH7.3緩沖液 0.2mol/L乙酸緩沖液，pH4.5 5%蔗糖溶液 3，5-二硝基水楊酸試劑3、實(shí)驗(yàn)儀器（1）高

3、速冷凍離心機(jī)（2）層析柱（1.0×20 ）(1支/組）（3）ÄKTATM start（1套/組）（4）部分收集器及收集試管（4ml/管）（1臺(tái)/組）（5）20冰箱（保存樣品用）（6）微量移液槍 200ul、1000ul（7）1.5ml離心管（留樣品和樣品用）（8）7ml離心管（留樣品用）（9）恒溫水浴（50、100）（10）試管、移液管、試管架等四、實(shí)驗(yàn)方法和步驟1、儀器連接（1）接通各儀器電源，將A,B泵頭分別放置A，B兩個(gè)溶液瓶中。注意B為含NaCl溶液。（2） 點(diǎn)擊電腦桌面上Unicorn軟件圖標(biāo)，打開軟件。選擇System Control ，點(diǎn)擊OK，進(jìn)入操作界面。

4、點(diǎn)擊Connect（3） 在操作界面的工具欄，點(diǎn)擊Mannual Run。出現(xiàn)FlowRate 窗口，調(diào)節(jié)flowrate為 1ml/min，確定。2、裝柱與平衡（1）檢查層析柱的兩端接頭，底端有膜的置于下方。（2）程序暫停。將層析柱放入卡槽，上端接頭與混合器（Mixer)相連，下端接頭與樣品閥（Sample valve)相連。（3）BufferA平衡一個(gè)柱體積（約20ml=20min）3、加樣停止加入20mmol/L Tris-HCl pH7.3 緩沖液。待緩沖液液面與膠體表面相切時(shí)，程序暫停pause。旋開柱上方接頭，用膠頭滴管緩慢將5ml蔗糖酶蛋白樣品溶液（樣品）加入層析柱中，注意順著柱

5、壁滴加，盡可能保持膠面平整。程序繼續(xù)continue，使樣品溶液進(jìn)入膠體，待樣品溶液完全進(jìn)入膠體后，程序暫停pause，用少量洗脫緩沖液將殘余在層析柱壁上端的樣品洗下，并完全進(jìn)入膠體后，再加緩沖液至一定高度。4、洗脫（梯度洗脫法）（1）加樣后，先用BufferA進(jìn)行洗脫，洗去未被凝膠吸附的雜蛋白（20min左右）；（2）待層析柱流出液在儀器上繪出的基線穩(wěn)定，在程序主界面的工具欄 Manual Execute manual instruction pumps Gradient，在兩個(gè)框內(nèi)均填入100，點(diǎn)擊insert，最后點(diǎn)擊一次execute，開始梯度洗脫。每2min接一管，當(dāng)Conducti

6、vity上升至8 mS/cm 時(shí)，開始測(cè)定各管的蔗糖酶活力；（3）將蔗糖酶活力高的若干管酶液（2-3管）合并，測(cè)量總體積V4（樣品），樣品用7ml離心管20保存。5、蔗糖酶活力檢測(cè)空白對(duì)照（1）樣品管（n）0.2mol/L乙酸緩沖液，pH4.50.5ml0.5ml5%蔗糖溶液0.5ml0.5ml蒸餾水1.0ml0.95ml部分收集的酶液/0.05ml 50水浴5min 3.5二硝基水楊酸試劑(DNS)0.5ml0.5ml 100水浴2min 蒸餾水3.0ml3.0ml觀察顏色五、實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄和處理上次實(shí)驗(yàn)粗提取的蔗糖酶蛋白溶液V3=12.3ml本次實(shí)驗(yàn)加樣的蔗糖酶蛋白溶液V3=5.0ml蔗糖酶

7、活力高的兩管酶液合并后V4=4.0ml六、實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析1、洗脫曲線（1） UV曲線 在55-70min時(shí)，UV曲線有兩個(gè)峰值，這是未被凝膠吸附的雜蛋白的體現(xiàn)。 85-95min的峰值性狀較為“規(guī)準(zhǔn)”，但經(jīng)過活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)為雜蛋白。 105-120min有一個(gè)峰值較小的峰，經(jīng)過活性檢測(cè)其中含有活性較高的蔗糖酶。實(shí)驗(yàn)名稱：_離子交換柱層析分離純化蔗糖酶_姓名： 吳逸璇 學(xué)號(hào)： 3170100207 （2） 在73min左右，BufferValve B的值瞬間上升，這是由于操作失誤導(dǎo)致的。當(dāng)時(shí)直接把Buffer valve的閥門由A轉(zhuǎn)換到B，而沒有一個(gè)梯度的上升。但好在及時(shí)止損，開始了正確的操作。正

8、確操作：“在程序主界面的工具欄 Manual Execute manual instruction pumps Gradient，在兩個(gè)框內(nèi)均填入100，點(diǎn)擊insert，最后點(diǎn)擊一次execute，開始梯度洗脫?！保?）Conductivity的值隨著Buffer B濃度的增長(zhǎng)而增長(zhǎng)（導(dǎo)電性增加）。2、蔗糖酶活力檢測(cè)對(duì)比圖如圖示，從左到右，第3管和第5、6管都分別有較深的顏色（由于手機(jī)、光線等原因，圖示顏色比實(shí)際顏色要淺，實(shí)際顏色更深），說明在對(duì)應(yīng)的兩個(gè)時(shí)間段內(nèi)洗脫出活性較高的蔗糖酶。七、實(shí)驗(yàn)討論和心得1、如上所述，在層析柱流出液在儀器上繪出的基線穩(wěn)定后進(jìn)行Buffer B的梯度洗脫時(shí)，進(jìn)行

9、了錯(cuò)誤的操作（直接將Buffer valve的閥門由A轉(zhuǎn)換到B），這導(dǎo)致了Buffer B濃度的突然上升，在之后一段時(shí)間內(nèi)，較高濃度的Buffer B可能將柱上部分蔗糖酶與雜蛋白一起洗脫下去，導(dǎo)致之后的第一個(gè)峰沒能夠檢測(cè)出目標(biāo)蛋白。2、什么是梯度洗脫？梯度洗脫（gradient elution）又稱為梯度淋洗或程序洗脫。在同一個(gè)分析周期中，按一定程度不斷改變流動(dòng)相的濃度配比，稱為梯度洗脫。在同一個(gè)分析周期中，按一定程度不斷改變流動(dòng)相的濃度配比，稱為梯度洗脫。從而可以使一個(gè)復(fù)雜樣品中的性質(zhì)差異較大的組分能按各自適宜的容量因子k達(dá)到良好的分離目的。梯度洗脫的優(yōu)點(diǎn)：1.縮短分析周期；2.提高分離能力；3.峰型得到改善，很少拖尾；4.增加靈敏度。但有時(shí)引起基線漂移。3、心得這次實(shí)驗(yàn)使用的主體儀器是ÄK