熒光分光光度計(jì)

1、熒光分光光度計(jì)Fluorescence Spectrometer國(guó)別廠家：日本島津公司儀器型號(hào)：RF-5301PC基本原理：主要技術(shù)指標(biāo)：燈 源：150 W Xe燈單色器：閃耀式全息光柵，F(xiàn)2.5刻線1300條/mm波長(zhǎng)范圍：220-900 nm.波長(zhǎng)精度：土 1.5 nm,分辨率：1.0 nm狹縫寬：1.5, 3, 5, 10, 15, 20 nm靈敏度：S/N比150以上（帶寬5 nm、水拉曼峰時(shí)）測(cè)定方式：熒光光譜測(cè)定、定量測(cè)定、時(shí)間過(guò)程測(cè)定軟件功能：10通道顯示，數(shù)據(jù)RSC轉(zhuǎn)換，譜圖自動(dòng)找峰，不同譜圖加減乘除，譜圖倒數(shù)、 導(dǎo)數(shù)、常用對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換等。主要功能：固體和液體的激發(fā)光譜、發(fā)射光譜和

2、同步熒光光譜；熒光物質(zhì)的定量分析。使用方法:1 .將熒光光度計(jì)的右側(cè) Xe燈開關(guān)置于“ ON”的位置，再打開電源開關(guān)和電腦電源。2 .雙擊電腦上的RF-5301PC圖標(biāo)，靜等儀器自檢完成，出現(xiàn)喀嚓聲后,顯示RF-5301P窗 口。3 .預(yù)熱：開機(jī)預(yù)熱20分鐘后才能進(jìn)行測(cè)定工作。4 .新建文件夾：在Data文件夾里新建本次所做實(shí)驗(yàn)的子文件夾5 . 啟動(dòng)RF-5301PC后在Acquire Mode中選擇欲分析的項(xiàng)目。6 .設(shè)定參數(shù)：根據(jù)測(cè)量方式在Configure的Parameter里設(shè)定合適的參數(shù)。7 .置入樣品：將已經(jīng)裝入樣品的四面擦凈后的石英熒光比色皿放入樣品室內(nèi)試樣槽后，將蓋子蓋好。8

3、.掃描：參數(shù)設(shè)定完畢后，點(diǎn)擊窗口右下角的“ Start”圖標(biāo)，開始才3描，掃圖結(jié)束后輸入文 件名將文件儲(chǔ)存。9 . 保存：在“ File”中的“ Save Channel”對(duì)曲線進(jìn)行保存。10 .轉(zhuǎn)換文件：在“ File”的“Data Translation"里單擊要轉(zhuǎn)換的“ ASCH”格式或者“ DIF” 格式。11 .關(guān)機(jī)：測(cè)試完畢后，關(guān)閉電腦。之后要先關(guān)閉氤燈（Xe燈開關(guān)置于“ Off”位置），散熱20分鐘后，再關(guān)閉電源開關(guān)。注意事項(xiàng)：1 .開機(jī)時(shí)，請(qǐng)確保先開氤燈電源，再開主機(jī)電源。每次開機(jī)后請(qǐng)先確認(rèn)一下排熱風(fēng)扇工作 正常，以確保儀器正常工作，發(fā)現(xiàn)風(fēng)扇有故障，應(yīng)停機(jī)檢查。2 .

4、使用石英樣品池時(shí)，應(yīng)手持其棱角處，不能接觸光面，用畢后，將其清洗干凈。3 .當(dāng)操作者錯(cuò)誤操作或其它干擾引起微機(jī)錯(cuò)誤時(shí)，可重新啟動(dòng)計(jì)算機(jī)，但無(wú)須關(guān)斷氤燈電源。4 .光學(xué)器件和儀器運(yùn)行環(huán)境需保護(hù)清潔。切勿將比色皿放在儀器上。清潔儀器外表時(shí)，請(qǐng)勿使用乙醇乙醍等有機(jī)溶劑，請(qǐng)勿在工彳中清潔，不使用時(shí)請(qǐng)加防塵罩。5 .為延長(zhǎng)氤燈的使用壽命，實(shí)驗(yàn)完畢后要先關(guān)閉 Xe燈，不關(guān)電源主機(jī)電源（光度計(jì)的右側(cè)），等其散熱完畢后再關(guān)閉電源。工作原理熒光產(chǎn)生的原理熒光的定義：某些物質(zhì)受紫外光或可見光照射激發(fā)后能發(fā)射出比激發(fā)光波長(zhǎng)較長(zhǎng)的光。熒光產(chǎn)生的原理：化學(xué)物質(zhì)能從外界吸收并儲(chǔ)存能量（如光能、化學(xué)能等）而進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)其

5、從激發(fā)態(tài)再回復(fù)到基態(tài)時(shí)，過(guò)剩的能量可以電磁輻射的形式放射（即發(fā)光）。熒光化合物的兩種特征光譜1 .熒光激發(fā)光譜，就是通過(guò)測(cè)量熒光體的發(fā)光通量隨波長(zhǎng)變化而獲得的光譜，它反映 了不同波長(zhǎng)激發(fā)光引起熒光的相對(duì)效率。2 .熒光發(fā)射光譜，如使激發(fā)光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度保持不變，而讓熒光物質(zhì)所產(chǎn)生的熒光通過(guò)發(fā)射單色器后照射于檢測(cè)器上，掃描發(fā)射單色器并檢測(cè)各種波長(zhǎng)下相應(yīng)的熒光強(qiáng)度，然后通過(guò)記錄儀記錄熒光強(qiáng)度對(duì)發(fā)射波長(zhǎng)的關(guān)系曲線，所得到的譜圖稱為熒光光譜。物質(zhì)的激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜，可以用作該物質(zhì)的定性分析。當(dāng)激發(fā)光強(qiáng)度、波長(zhǎng)、所用溶劑及溫度等條件固定時(shí)，物質(zhì)在一定濃度范圍內(nèi)， 其發(fā)射光強(qiáng)度與溶液中該物質(zhì)的濃度成正

6、比關(guān)系，可以用作 定量分析。熒光分析法的靈敏度一般較紫外分光光度法或比色法為高，濃度太大的溶液會(huì)有自熄滅”作用，以及由于在液面附近溶液會(huì)吸收激發(fā)光，使發(fā)射光強(qiáng)度下降，導(dǎo)致發(fā)射光強(qiáng)度與 濃度不成正比，故熒光分析法應(yīng)在低濃度溶液中進(jìn)行。熒光發(fā)射的特點(diǎn)：可產(chǎn)生熒光的 分子或原子在接受能量后即刻引起發(fā)光 ；而一旦停止供 能，發(fā)光（熒光）現(xiàn)象也隨之在瞬間內(nèi)消失。溶液熒光光譜通常具有的特征：（1）斯托克斯位移：在溶液熒光光譜中，所觀察到的熒光的波長(zhǎng)總是大于激發(fā)光的波長(zhǎng)。（2）熒光發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)。（3）熒光發(fā)射光譜的形成與吸收光譜的形狀有鏡像關(guān)系熒光的猝滅：熒光分子的輻射能力在受到激發(fā)光較長(zhǎng)時(shí)

7、間的照射后會(huì)減弱甚至猝滅，這是由于激發(fā)態(tài)分子的電子不能回復(fù)到基態(tài)，所吸收的能量無(wú)法以熒光的形式發(fā)射。一些化合物有天然的熒光猝滅作用而被用作猝滅劑，以消除不需用的熒光。因此熒光物質(zhì)的保存應(yīng)注意避免光（特別是紫外光）的直接照射和與其他化合物的接觸。熒光效率：熒光分子不會(huì)將全部吸收的光能都轉(zhuǎn)變成熒光，總或多或少地以其他形式 釋放。熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率，與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比。熒光效率=發(fā)射熒光的光量分子數(shù)（熒光強(qiáng)度）/吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強(qiáng)度）發(fā)射熒光的光量子數(shù)亦即熒光強(qiáng)度，除受激發(fā)光強(qiáng)度影響外，也與激發(fā)光的波長(zhǎng)有關(guān)。各個(gè)熒光分子有其特定的吸收光譜和發(fā)射光譜（

8、熒光光譜），即在某一特定波長(zhǎng)處有最大吸收峰和最大發(fā)射峰。選擇激發(fā)光波長(zhǎng)量接近于熒光分子的最大吸收峰波長(zhǎng)，且測(cè)定光波量接近于最大發(fā)射光波峰時(shí)，得到的熒光強(qiáng)度也最大。測(cè)量原理稀溶液 IF=2.303（）FI0 e c b,其中，I0為激發(fā)光強(qiáng)度；If為熒光強(qiáng)度；。f為熒光效率；b為液池厚度；e和C分別為發(fā)光物質(zhì)的摩爾吸光系數(shù)和摩爾濃度。技術(shù)指標(biāo)：波長(zhǎng)掃描范圍：220-900nm波長(zhǎng)精度：*5nm;狹縫范圍：0.15-20nm信噪比：S/N比150以上（水拉曼峰測(cè)定，狹縫 5nm）最高掃描速度：5 , 500nm/min操作規(guī)程1 .開機(jī)a.確認(rèn)所測(cè)試樣液體或固體，選擇相應(yīng)的附件。b.先開啟儀器主機(jī)

9、電源，預(yù)熱半小時(shí)后啟動(dòng)電腦程序RF-530XPC ,儀器自檢通過(guò)后,即可正常使用。2 .測(cè)樣（1） spectrum 模式a.在“Acquire Mode 中選擇 "Spectrum模式。對(duì)于做熒光光譜的樣品，"Configure甲“Parameters的參數(shù)設(shè)置如下：“Spectrum Type中選擇Emission;給定EX波長(zhǎng);給定EM的掃描范圍（最大范圍 220nm 900nm）;設(shè)定掃描速度；掃描間隔；狹縫寬度，點(diǎn)擊 “O觥成參數(shù)的設(shè)定。對(duì)于做激發(fā)光譜的樣品，"Configure甲“Parameters的參數(shù)設(shè)置如下:“Spectrum Type中選擇E

10、xcitation;給定EM波長(zhǎng);給定EX的掃描范圍(最大范圍220nm 900nm);設(shè)定掃描速度；掃描間隔；狹縫寬度，點(diǎn)擊 “OK完成參數(shù)的設(shè)定。b.在樣品池中放入待測(cè)的溶液，點(diǎn)擊“Start,'即可開始掃描。c.掃描結(jié)束后，系統(tǒng)提示保存文件?？稍?"Presentation中選擇"Graf""Radar""BothAxes Ctrl+R 來(lái)調(diào)整顯示名果范圍；在"Manipulate中選擇"Peak Pick來(lái)標(biāo)出峰位，最后在"Channel中進(jìn)行通道設(shè)定。d.述操作步驟對(duì)固體樣品同樣適用。(

11、2) Quantitative 模式a.在“Acquire Mode 中選擇 "Quantitative 模式。b. "Configured " Parameters 的參數(shù)設(shè)置如下：Method 選擇 "Multi Point Working Curve " ; "Order of CferVe ” "1s和"No"給定EX、EM波長(zhǎng);設(shè)定狹縫寬度，點(diǎn)擊“OK完成參數(shù)的設(shè)定。c.在樣品池中放入裝有空白溶液的比色皿后執(zhí)行"Auto Zero命令校零點(diǎn)。d.點(diǎn)擊“Standard模式，制作工作曲線

12、。e.將樣品池中的空白溶液換成一系列的已知濃度的樣品標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)量，執(zhí)行“Rea晞令，得到相應(yīng)的熒光強(qiáng)度，系統(tǒng)根據(jù)測(cè)量值自動(dòng)生成一條熒光強(qiáng)度-濃度”曲線。f.在“Presentation中選擇"Display Equation ,得到標(biāo)準(zhǔn)方程。將此工作曲線"Save"為擴(kuò)展名為“.std的文件。g.工作曲線制備完畢，即可進(jìn)入未知樣的測(cè)量，選擇進(jìn)入“Unknown”模式，將樣品池中的已知濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液換成待測(cè)樣品溶液，執(zhí)行"Read命令，即可得到相應(yīng)的熒光強(qiáng)度和相應(yīng)的濃度。將此"Save'為擴(kuò)展名為“.qnim文件。(3) Time Co

13、urse 模式a.在“Acquire Mode 中選擇 "Time Course 模式。b. "Configured " Parameters 的參數(shù)設(shè)置如下：給定EX、EM波長(zhǎng);設(shè)定狹縫寬度；設(shè)定反應(yīng)時(shí)間；讀取速度；讀取點(diǎn)數(shù)；點(diǎn)擊“OK,完成參數(shù)的設(shè)定。c.在樣品池中放入裝有空白溶液的比色皿后執(zhí)行"Auto Zero命令校零點(diǎn)。d.將樣品池中的空白溶液換成待測(cè)溶液，點(diǎn)擊“Start,'即可開始掃描。掃描結(jié)束后，即可得到熒光強(qiáng)度對(duì)時(shí)間的工作曲線。e.將此工作曲線 “Save為擴(kuò)展名為“.TMC的文件。3.關(guān)機(jī)退出軟件后關(guān)畢主機(jī)。注意事項(xiàng)a.請(qǐng)注意

14、愛護(hù)液體比色皿，特別是測(cè)試有機(jī)樣品的同學(xué)請(qǐng)?jiān)跍y(cè)量完畢后用有機(jī)溶劑清 洗，干燥后再放入盒子中，否則會(huì)造成比色皿表面嚴(yán)重污染，影響透光度。b.固體樣品池僅剩一個(gè)，測(cè)試完畢請(qǐng)物歸原處。測(cè)試完畢請(qǐng)注意登記，關(guān)閉儀器。分子吸收、熒光、磷光輻射躍遷無(wú)輻射躍遷一一去活化過(guò)程處于激發(fā)態(tài)分子不穩(wěn)定， 通過(guò)輻射或非輻射躍遷等去活化過(guò)程返回至基態(tài)。這些過(guò)程包括：1）振動(dòng)弛豫在液相或壓力足夠高的氣相中，處于激發(fā)態(tài)的分子因碰撞將能量以熱的形式傳遞給周 圍的分子，從而從高振動(dòng)能層失活至低振動(dòng)能層的過(guò)程，稱為振動(dòng)弛豫。2）內(nèi)轉(zhuǎn)換對(duì)于具有相同多重度的分子，若較高電子能級(jí)的低振動(dòng)能層與較低電子能級(jí)的高振動(dòng)能層相重疊時(shí)，則電子可在重疊的能層之間通過(guò)振動(dòng)耦合產(chǎn)生無(wú)輻射躍遷，如S2-S1;T2-T1定性分析任何熒光都具有兩種特征光譜：激發(fā)光譜與發(fā)射光譜。它們是熒光定性分析的基礎(chǔ)。1）激發(fā)光譜改變激發(fā)波長(zhǎng)，測(cè)量在最強(qiáng)熒光發(fā)射波長(zhǎng)處的強(qiáng)度變化，以激發(fā)波長(zhǎng)對(duì)熒光強(qiáng)度作圖 可得到激發(fā)光譜。激發(fā)光譜形狀與吸收光譜形狀完全相似，經(jīng)校正后二者完全相同！這是因?yàn)榉肿游展?/p>