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1、 采用RT-PCR技術(shù)，從黑曲霉的菌絲體RNA中擴(kuò)散出葡萄糖淀粉酶GAT的結(jié)構(gòu)基因，將其轉(zhuǎn)接到pPIC9載體中，轉(zhuǎn)入巴斯德畢赤酵母GS115中，獲得重組酵母，使重組酵母中的葡萄糖淀粉酶活增高。操作方法：1.引物設(shè)計(jì)，根據(jù)已知的黑曲霉葡萄糖淀粉酶一基因序列和表達(dá)載體，pPIC9的克隆位點(diǎn)，利用DNAsis設(shè)計(jì)一對(duì)擴(kuò)增葡萄糖淀粉酶一基因的引物，上游引物為5 -TACGTAGCGACCTTGGATTCATGGTT - - 3,帶有SnaB一位點(diǎn)；下游引物為5 -GCGGCCGCACTATAGCGAAATGGATTGAG - 3,帶有Not一位點(diǎn)。 首先，黑曲霉保藏菌種經(jīng)查氏斜面培養(yǎng)基活化后，接種于1

2、00ml滅菌的黑曲霉液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，加少量玻璃珠，200r/min、30，培養(yǎng)6670h,以其為實(shí)驗(yàn)材料,利用總RNA提取試劑合提取黑霉的總RNA。再用RNA為模板，以下游引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA第一條鏈。65熱變性5min，冰浴，然后加入反轉(zhuǎn)錄酶，置于PCR儀中，3010min，421h，942min。 72延伸10min。 反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，用DNA凝膠試劑盒回收大約1.9kb的片段。將回收產(chǎn)物連接到pGEM-T載體上，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)菌，利用互補(bǔ)法進(jìn)行陽性克隆的初步篩選。重組DNAAmprTcs提取DNA 電泳AmprAmprAmprAmprTcrTcrTcAmprTcsTcs轉(zhuǎn)化 無菌落陽性菌落篩選重組子2)DNA重組無DNA插入有DNA插入外源DNA

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