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文檔簡介

1、細胞樣品制備（分步）操作規(guī)程儀器：電子天平、研缽、旋渦混和器、超聲儀、高速離心機、分光光度計、低溫冰箱、 0.5ml 離心管、 1.5ml 離心管試劑：a. 細胞收集液： 10mM Tris 、250mM 山梨醇， pH7.0b. 可溶蛋白提取液： 40mM Tris base(pH8.5)c.微溶蛋白提取液（可根據樣品不同而改變）：8 M 尿素、 4% CHAPS 、40mMTris base(pH8.5)d. 不溶蛋白提取液： 1% SDS、40mMTris base(pH8.5)、20%glycerole. 蛋白定量用液（略）實驗操作程序：1細胞收集：將一定量的細胞用細胞收集液懸浮洗滌3

2、 次， 2000g離心10min，最后將細胞分裝于 1.5ml 離心管中 ,3*10 7/管,液氮冷凍 - 80保存；2第一步 :可溶蛋白提取7a.按 3*10 細胞加 1ml 可溶蛋白提取液，加入終濃度1mMPMSF， 2mM EDTA ，混勻 5min 后，加入終濃度 10mM DTT ，b. 20 ,000g*20 分鐘離心，收集上清，上清為可溶蛋白提取液。沉淀留做下一步提??；c. 將上清加入尿素至終濃度 8 M、 CHAPS 4%3 第二步：微溶蛋白提取a. 取上一步沉淀加 0.2ml 微溶蛋白提取液，加入終濃度 1mM PMSF，2mM EDTA ，混勻 5min 后，加入終濃度 1

3、0mM DTT ，混勻后，冰浴超聲 5min, 2sec/3sec；b. 20 ,000g*20 分鐘離心，收集上清，上清為微溶蛋白提取液，沉淀留做下一步提?。?. 第三步：不溶蛋白提取a.取上一步沉淀加 0.05ml 不溶蛋白提取液，加入終濃度 1mM PMSF， 2mM EDTA ，混勻 5min 后，加入終濃度 10mM DTT ，混勻后 , 95孵育 5min;b.提取液冰浴超聲1min， 2sec/3sec；c. 20 ,000g*20 分鐘離心，收集上清，上清為難溶蛋白提取液；5. 用改良的 Bradford 法測定第一步和第二步提取蛋白樣品的蛋白濃度，用Lowry 法測定第三步提取蛋白樣品的蛋白濃度, 具體操作見操作規(guī)程 改

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