木瓜蛋白酶活力測(cè)定方法

1、木瓜蛋白酶活力測(cè)定方法分別精密量取酪蛋白溶液 5ml，置3支具塞試管中，置40 C水浴中保溫10分鐘，各精密加入 供試品溶液2ml，搖勻，置40 C水浴中，開(kāi)始記時(shí)，準(zhǔn)確反應(yīng)1小時(shí)，立即精密加入三氯醋酸溶液5ml，強(qiáng)力振搖混勻，置40 C水浴中放置3040分鐘，使沉淀的蛋白質(zhì)完全凝固，濾 過(guò)，濾液作為供試品溶液。精密量取酪蛋白溶液5ml置另一具試管，于40 C水浴中保溫1小時(shí)，精密加入三氯醋酸溶液 5ml，強(qiáng)力振搖混勻，精密加入供試品溶液2ml，置40 C水浴中放置3040分鐘，濾過(guò)，濾液作為空白溶液。照分光光度法（中國(guó)藥典2000年版二部附錄IV A ）,以0.1mol/L 鹽酸溶液為空白，

2、在275nm 的波長(zhǎng)處測(cè)定空白溶液、供試品溶液和對(duì) 照品溶液的吸收度，按下式計(jì)算：效價(jià)（單位/mg ） =A/As * Cs * 12/2 *稀釋倍數(shù)/W式中A為供試品溶液的吸收度減去空白溶液的吸收度：As為酪氨酸對(duì)照品溶液的吸收度：Cs為酪氨酸對(duì)照品溶液的濃度，ug/mlW為供試品重量，mg;在上述條件下，釋放1ug的酪氨酸的酶量為一個(gè)活力單位。試劑酪蛋白溶液：取酪蛋白1g，加0.05mol/L磷酸氫二鈉溶液50ml,置沸水浴中煮30分鐘，時(shí)時(shí)攪拌，冷至室溫，加0.05mol/L 枸椽酸溶液調(diào)節(jié) PH至6.0 ±）.1 ,并迅速攪拌，防止酪蛋白沉淀，用水稀釋至 100ml （臨用新

3、配）。酶稀釋液：取無(wú)水磷酸氫二鈉3.55g，加水400ml溶解，加乙二胺四醋酸二鈉1.1g和鹽酸半胱氨酸2.74g ,振搖溶解，用1mol/L 鹽酸 或1mol/L 氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)PH6.5 ±）.1 ,用水稀釋至500ml,混勻（臨用新配）三氯醋酸溶液：取三氯醋酸17.99g ，加醋酸鈉29.94g 和冰醋酸18.9ml ，加適量水溶解后，加水使成 1000ml ，搖勻。酶活力測(cè)定對(duì)照品溶液的制備：精密稱取已105 C干燥至恒重的酪氨酸對(duì)照品適量，用0.1mol/L 鹽酸溶液制成每1ml中約含40ug的溶液。供試品溶液的制備：取本品適量（約相 當(dāng)于木瓜酶活力120萬(wàn)單位），精密稱

4、定，加酶稀釋液振搖，制成每 1ml中含200300 單位 的溶液，搖勻。一、目的淀粉是葡萄糖以 a-1,4糖苷鍵及al , 6糖苷鍵連結(jié)的高分子多糖，是人類(lèi)和動(dòng)物的重要食物，也是食品、發(fā)酵、釀造、醫(yī)藥、 紡織工業(yè)的基本原料。淀粉酶是加水分解淀粉的酶的總稱，淀粉酶對(duì)淀粉的分解作用是工業(yè)上利用淀粉的依 據(jù)，也是生物體利用淀粉進(jìn)行代謝的初級(jí)反應(yīng)。小麥成熟期如遇陰雨天氣，有的品種會(huì)發(fā)生 淀粉酶的活性測(cè) 鞏固并熟練分光嚴(yán)重的穗發(fā)芽，造成巨大損失，這是小麥種子中淀粉酶活動(dòng)的結(jié)果。因此， 定，具有理論和應(yīng)用研究的意義。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)，學(xué)習(xí)酶活測(cè)定的一般方法， 光度計(jì)的使用。二、原理淀粉酶主要包括 a淀粉酶、3淀

5、粉酶、葡萄糖淀粉酶和R-酶，它們廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物界。不同來(lái)源的淀粉酶，性質(zhì)有所不同。植物 中最重要的淀粉酶是a淀粉酶和3-淀粉酶。a淀粉酶隨機(jī)作用于直鏈淀粉和支鏈淀粉的直鏈部分a1,4糖苷鍵，單獨(dú)使用時(shí)最終生成寡聚葡萄糖、 a-極限糊精和少量葡萄糖。Ca2+能使a淀粉酶活化和穩(wěn)定，它比較耐熱但不耐酸，pH3.6 以下可使其鈍化。3淀粉酶從非還原端作用于a-1,4糖苷鍵，遇到支鏈淀粉的a-1,6鍵時(shí)停止。單獨(dú)作用時(shí)產(chǎn)物為麥芽糖和3-極限糊精。 3-淀粉酶是一種巰基酶，不需要Ca2+及 Cl 等輔助因子，最適 pH偏酸，與a淀粉酶相反，它不耐熱但覺(jué)耐酸，70C保溫15min可使其鈍化。

6、通常提取液中 a淀粉酶和3-淀粉酶同時(shí)存在?？梢韵葴y(cè)定（ a +3淀粉酶總活力，然后 在 70C加熱15min，鈍化3淀粉酶，測(cè)出 a淀粉酶活力，用總活力減去a淀粉酶活力，就可求出3淀粉酶活力。淀粉酶活力大小可用其作用于淀粉生成的還原糖與3,5-二硝基水酸的顯色反應(yīng)來(lái)測(cè)定。還原糖作用于黃色的3,5-二硝基水酸生成棕紅色的3-氨基 -5-硝基水酸， 生成物顏色的深淺與還原糖的量成正比。 以每克樣品在一定時(shí)間生成的還原 糖（麥芽糖）量表示酶活大小。三、儀器、試劑和材料1. 儀器（ 1 ）電子頂載天平（ 2）研缽（ 3）容量瓶 100mL2 個(gè)（ 4 ）具塞刻度試管 25Ml15 支（ 5）試管 8

7、 支（6）吸管 1mL3 支， 2mL12 支， 5mL1 支（ 7）離心機(jī)（ 8）離心管 （ 9）恒溫水浴鍋（ 10 ）分光光度計(jì)2. 試劑（1） 1%淀粉溶液（ 2） 0.4mol/L 氫氧化鈉（3）pH5.6檸檬酸緩沖液稱取檸檬酸 20.01g,溶解后定容至1000mL，為A液。稱取檸檬酸鈉 29.41g,溶解后定容至 1000mL,為B液。取A液13.7mL與B液 26.3mL 混勻，即為 pH5.6 之緩沖液。（4）3,5-二硝基水酸精確稱取 1g3,5-二硝基水酸溶于 20mL1mol/L氫氧化鈉中，加入 50mL 蒸餾水，再加入 30g 酒石酸鉀鈉，待溶解后用蒸餾水稀釋至100M

8、l，蓋緊瓶塞，防止 CO2 進(jìn)入。(5) 麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液(1mg/ml)稱取O.IOOg麥芽糖，溶于少量蒸餾水，定容至 100mL。3. 材料萌發(fā) 3 天的小麥芽。四、操作步驟1. 酶液提取稱取 2g 萌發(fā) 3 天的小麥種子(芽長(zhǎng) 1cm 左右)，置研缽中加少量石英砂和 2m1左右蒸餾水，研成勻漿，無(wú)損地轉(zhuǎn)入100m1容量瓶中，用蒸餾水定容至100m1,每隔數(shù)分鐘振蕩 1次，提取 20min。 3000rmin 離心 l0min ，轉(zhuǎn)出上清液備用。2. a-淀粉酶活力測(cè)定( 1 )取試管 4 支，標(biāo)明 2 支為對(duì)照管， 2 支為測(cè)定管。(2)于每管中各加酶液Iml，在70C士 0.5C恒溫水浴中

9、準(zhǔn)確加熱 15min，鈍化3 -淀粉酶。取出后迅速用流水冷卻。( 3)在對(duì)照管中加入 4m10.4mol/L 氫氧化鈉。(4) 在 4 支試管中各加入 1mlpH5.6 的檸檬酸緩沖液。(5) 將4支試管置另一個(gè)40C士 05C恒溫水浴中保溫 15min，再向各管分別加入 40 C下預(yù)熱的1%淀粉溶液2m1,搖勻，立即放入 40C恒溫水浴準(zhǔn)確計(jì)時(shí)保溫 5min 。取出后向測(cè)定管迅速加入 4ml0.4mol/L 氫氧化鈉，終止酶活動(dòng)，準(zhǔn)備測(cè)糖。3. 淀粉酶總活力測(cè)定取酶液5ml，用蒸餾水稀釋至100m1，為稀釋酶液。另取 4支試管編號(hào)，2支為對(duì)照，2支為測(cè)定管。然后加入稀釋之酶液Iml。在對(duì)照管

10、中加入 4m10.4mol氫氧化鈉。4支試管中各加 1mlpH5.6之檸檬酸緩沖液。以下步驟重復(fù)a淀粉酶測(cè)定第(5)步的操作，同樣準(zhǔn)備測(cè)糖。4. 麥芽糖的測(cè)定( 1 )標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作取 25ml 刻度試管 7 支，編號(hào)。分別加入麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液( lmg/ml ) 0,0.2,0.6,1.0,1.4,1.8,2.0ml，然后用吸管向各管加蒸餾水使溶液達(dá)2.0ml，再各加3, 5 一二硝基水酸試劑 2.0m1，置沸水浴中加熱 5min。取出冷卻，用蒸餾水 稀釋至25m1 ?；靹蚝笥梅止夤舛扔?jì)在 520nm 波長(zhǎng)下進(jìn)行比色，記錄吸光度。以吸光度為縱坐 標(biāo)，以麥芽糖含量(mg)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。(2)樣品的測(cè)定取步驟 2,3中酶作用后的各管溶液 2m1,分別放入相應(yīng)的8支25ml 具塞刻度試管中，各加入 2m13,5-二硝基水酸試劑。 以下操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。 根據(jù)樣品比色吸光度， 從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出麥 芽糖含量，最后進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。( AA0) xVT五、結(jié)果處理式中A為a-淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖(mg);Ao為a-淀粉酶的對(duì)照管中麥芽糖量( mg);B為（a十3）淀粉酶共同水解淀粉生成的麥芽糖（mg）;Bo為（a十3）淀粉酶的對(duì)