SDS-PAGE原理及配方

1、SDS-PAGE1）根據(jù)目的蛋白的分子量大小選擇合適的凝膠濃度，再按照下面的表格配制 SDS-PAGE的分離膠（即下層膠）：SDS-PAGE分離膠濃度最佳分離范圍6%膠50-150kD8%膠30-90kD10%膠20-80kD12%膠12-60kD15%膠10-40kD成分配制不冋體積SDS-PAGE分離膠所需各成分的體積（毫升）6%膠51015203050蒸餾水2.04.06.08.012.020.030%Acr-Bis(29:1)1.02.03.04.06.010.01M Tris,pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%

2、過(guò)硫酸銨0.050.10.150.20.30.5TEMED0.0040.0080.0120.0160.0240.04成分配制不冋體積SDS-PAGE分離膠所需各成分的體積（毫升）8%膠51015203050蒸餾水1.73.35.06.710.016.730%Acr-Bis(29:1)1.32.74.05.38.013.31M Tris,pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%過(guò)硫酸銨0.050.10.150.20.30.5TEMED0.0030.0060.0090.0120.0180.03成分配制不冋體積SDS-PAGE分離膠

3、所需各成分的體積（毫升）10%膠51015203050蒸餾水1.32.74.05.38.013.330%Acr-Bis(29:1)1.73.35.06.710.016.71M Tris,pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%過(guò)硫酸銨0.050.10.150.20.30.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.0120.02成分配制不冋體積SDS-PAGE分離膠所需各成分的體積（毫升）12%膠51015203050蒸餾水1.02.03.04.06.010.030%Acr-Bis(29:1)2.04.06.08.

4、012.020.01M Tris,pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%過(guò)硫酸銨0.050.10.150.20.30.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.0120.02成分配制不冋體積SDS-PAGE分離膠所需各成分的體積（毫升）15%膠51015203050蒸餾水0.51.01.52.03.05.030%Acr-Bis(29:1)2.55.07.510.015.025.01M Tris,pH8.81.93.85.77.611.419.010%SDS0.050.10.150.20.30.510%過(guò)硫酸銨0

5、.050.10.150.20.30.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.0120.02注：如果配制非變性膠，參考上述配方，不加10%SDS即可配制成非變性 PAGE膠。1） 按照如下表格配制 SDS-PAGE的濃縮膠（也稱堆積膠、積層膠或上層膠 ）:成分配制不冋體積SDS-PAGE濃縮膠所需各成分的體積（毫升）5%膠2346810蒸餾水1.42.12.74.15.56.830%Acr-Bis(29:1)0.330.50.671.01.31.71M Tris,pH8.80.250.380.50.751.01.2510%SDS0.020.030.040.060.080.110%

6、過(guò)硫酸銨0.020.030.040.060.080.1TEMED0.0020.0030.0040.0060.0080.01TBST緩沖液每2L體積中含:1MTrisHCL(pH7.5)100mLNacl16gKCL0.4g吐溫1ml1）抗體去除液篥料位K每50mL抗體去除液中含:0.5MTrisHCL (pH6.8)6.25mL10%SDS10mLBeta-ME0.175mL水33.75mLSDS-PAG電泳的基本原理:SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn) SDS（十二烷基硫酸鈉），SDS 會(huì)與變性的多肽， 并使蛋白帶負(fù)電荷， 由于多肽結(jié)合 SDS 的量幾乎總是與多肽的分子

7、 量成正比而與其序列無(wú)關(guān)，因此 SDS 多肽復(fù)合物在丙稀酰胺凝膠電泳中的遷移率只與多肽 的大小有關(guān)，在達(dá)到飽和的狀態(tài)下，每克多肽可與 1.4g 去污劑結(jié)合。當(dāng)分子量在 15KD 到 200KD 之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式： logMW=K-bX ， 式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移 率對(duì)分子量對(duì)數(shù)作圖， 可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線， 未知蛋白質(zhì)在相同條件下進(jìn)行電泳， 根據(jù)它的 電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺與為蛋白質(zhì)電泳提供載體，其凝固的好壞直接關(guān)系到電 泳成功與否，與促凝劑及環(huán)境密切相關(guān)；制膠緩沖液：濃縮膠選擇 pH6.7 ，分離膠選擇 pH8.9 ，選擇 tris HCL 系統(tǒng)，具體作用 后面介紹；TEMED與AP :促凝作用，加速聚丙烯酰