余功臣分子克隆

1、分子克隆技術實驗報告應用生物技術08012008304201308余功臣2011年5月22日實驗是由小組成員集體完成，實驗報告以及結果分析由個人完成。小組成員：余功臣、晏星、何一鳴、伍良偉。試驗時間由2011年5月8日至5月14日，共完成分子克隆、分子雜交和基因表達檢測三大部分的實驗。下列實驗報告中的實驗試劑具體成分以及配置方式均未列出，詳見分子克隆技術實驗手冊附錄。一將M812載體上的水稻DNA片段亞克隆于pUC19載體上摘要運用堿裂解法抽提質(zhì)粒載體pUC19和帶有水稻目的DNA片段M812的質(zhì)粒pU1301，用瓊脂糖凝膠電泳檢測所提取的質(zhì)粒DNA的質(zhì)量，用限制性內(nèi)切酶BamI和KpnI處理

2、pU1301和pUC19，將純化的載體pUC19與回收的水稻DNA片段M812連接后，將重組的DNA分子導入感受態(tài)細胞大腸桿菌菌株DH5a并在培養(yǎng)皿上培養(yǎng)。關鍵詞堿裂法 瓊脂糖凝膠電泳檢測 亞克隆 感受態(tài)細胞 重組子的轉化1 前言亞克隆，即是將已經(jīng)獲得的目的片段進行進一步分析，或者進行重組改造等過程。其基本過程包括：（1）目的片段和載體的制備；（2）目的片段和載體的連接；（3）連接產(chǎn)物的轉化；（4）重組子篩選。本實驗中的目的片段和載體均來自細菌質(zhì)粒，因此細菌質(zhì)粒的抽提是目的片段和載體制備的核心步驟。本實驗中以堿裂解法為例，介紹質(zhì)粒的抽提過程。堿裂解法，是1979年由Birnboim和Doly設

3、計并發(fā)表的經(jīng)典質(zhì)粒DNA提取方法。其核心原理是在堿性條件下線狀DNA發(fā)生變性，質(zhì)粒DNA維持環(huán)狀。在高鹽條件下作復性處理，變性的染色體會沉淀，從而將質(zhì)粒DNA與染色體DNA分開。在pH值為時，核酸分子帶負電，在電泳時由負極向正極移動。采用適當濃度的凝膠介質(zhì)作為電泳支持物，在分子篩的作用下，分子大小和構像不同的核酸分子泳動率出現(xiàn)較大的差異。核酸分子中嵌入熒光染料（如EB）后，在紫外燈下可觀察到核酸片段所在的位置。瓊脂糖凝膠電泳由于其操作簡單、快速、靈敏等優(yōu)點，已成為分離和鑒定核酸的常用方法。所抽提的質(zhì)粒即用電瓊脂糖凝膠電泳來檢測。一般所抽提的質(zhì)粒在瓊脂糖膠上能夠呈現(xiàn)三條帶，因為質(zhì)粒有三種構型，即

4、線狀、環(huán)狀、開環(huán)狀。將所獲得的載體質(zhì)粒與帶有目標片段的質(zhì)粒進行重組，其包括載體及外源DNA片段的雙酶切消化、目的片段的回收和載體的純化、目的片段與克隆載體的體外連接、重組子的篩選和鑒定等內(nèi)容。DNA片段的克隆技術是分子操作的核心部分。將重組DNA導入大腸桿菌細胞一般有兩種方法CaCl2法和電轉化法，本實驗中采用CaCl2法。本實驗采用CaCl2法制備感受態(tài)細胞：利用冰冷的CaCl2處理對數(shù)生長期的細胞，可以誘導其產(chǎn)生短暫的“感受態(tài)”，易于攝取外源DNA。轉化效率為106 107轉化子/mg DNA。2 材料和方法攜帶pUC19質(zhì)粒載體的大腸桿菌菌液攜帶含有水稻DNA片段的pU1301載體的大腸

5、桿菌菌液。攜帶pUC19質(zhì)粒載體的大腸桿菌和攜帶含有水稻DNA片段的pU1301載體的大腸桿菌的培養(yǎng)先采用含相應抗生素的LA培養(yǎng)基，后采用LB培養(yǎng)基。大腸桿菌菌株DH5a采用LB培養(yǎng)基。大腸桿菌在37培養(yǎng)。抗生素的使用濃度：氨芐青霉素，100µg/ml；卡那霉素，50µg/ml。Solution I; SolutionII; SolutionIII;苯酚/氯仿;異丙醇;ddH2O21. 取含有所需載體的大腸桿菌菌液于含有相應抗生素的LA培養(yǎng)基上涂布或劃線分離單菌落，37過夜培養(yǎng)；2. 用無菌牙簽挑取單菌落，接種于含有相應抗生素的LB培養(yǎng)基中，37搖床250 r/min過夜培

6、養(yǎng)；3. 吸取菌液，12000r/min離心1分鐘，倒掉菌液；吸取1.5 ml菌液，再次12000r/min離心1分鐘收集菌體，盡量將菌液倒干凈；4. 加入300ml 溶液 I，振蕩打勻，重新懸浮細胞，震蕩混勻（注意：應徹底打勻沉淀或碎塊）；5. 加入300ml 溶液II，輕柔顛倒混勻，放置至清亮，一般不超過5分鐘（最好不超過2分鐘）；6. 加入300ml 溶液III顛倒混勻，放置于冰上10分鐘，使雜質(zhì)充分沉淀；7. 12000 g離心10分鐘；8. 吸取800ml 上清液（注意：不要吸取到飄浮的雜質(zhì)）至另一Eppendorf管中，加入2/3體積的異丙醇，室溫下放置5分鐘；9. 12000 g

7、 常溫離心15分鐘；10. 倒盡上清，加500 ml 75乙醇浸洗除鹽，（放置片刻后倒去上清；或離心5分鐘）11. 加40ml 滅菌超純水溶解；12. 質(zhì)粒的質(zhì)量檢測，-20保存。2.1.3 DNA的瓊脂糖凝膠電泳步驟 1.將洗凈、干燥的制膠板放入制膠槽中，水平放置在工作臺上，調(diào)整好梳子的高度；0.24 g瓊脂糖于×TBE中，在微波爐中使瓊脂糖顆粒完全溶解，冷卻至溫熱時倒膠；3.凝膠凝固后，小心拔去梳子；DNA樣品與上樣緩沖液混合后將樣品依次加入點樣孔中（上樣緩沖液含甘油或蔗糖，利于DNA樣品沉入點樣孔中；含有電泳指示劑，以指示電泳的進程）；5.將制膠板放入電泳槽中，加入電泳液，打開

8、電泳儀，使核酸樣品向正極泳動（注意點樣孔在電泳槽的負極一端）；6.電泳完成后切斷電源，取出凝膠，放入0.5 µg/ml的溴化乙錠（EB）中浸泡1015 min，在紫外透射儀上觀察電泳結果并照相記錄；（上樣緩沖液含甘油或蔗糖，利于DNA樣品沉入點樣孔中；含有電泳指示劑，以指示電泳的進程。）DNA片段在質(zhì)粒載體中的克隆所抽提的載體質(zhì)粒pUC19和攜帶外源片段M812的載體pU1301；限制性內(nèi)切酶：BamH I和Kpn I;2.2.2 載體pUC19和外源DNA的限制性酶切及酶切效應檢測（50 ml反應體系，用1.5ml tube，冰上操作） DNA 30mlBamH I (10u/&#

9、181;l) 1 mlKpn I (10u/µl) 1 ml 10×buffer5 mlddH2O 13ml分別取5 ml 酶切產(chǎn)物用1.2%凝膠檢測酶切效果;2.2.3 酶切產(chǎn)物pUC19的純化步驟 1. 加入ddH2O 150 ml （擴大體積），加入200µl氯仿/異戊醇（24:1），顛倒混勻后離心10 min；2. 吸出上清，加1/10體積3M NaAc和兩倍體積乙醇，-20放置15分鐘以上；3. 12000 rpm 4冷凍離心15分鐘；4. 倒去上清，用75乙醇浸洗沉淀，風干后BAC DNA溶于10 ml ddH2O，pUC18 DNA溶于20 ml d

10、dH2O（1.5ml tube中）；2.2.4外源DNA片段M812挖膠回收步驟（上海生工公司生產(chǎn)的柱式DNA膠回收試劑盒） 1. 通過瓊脂糖凝膠將目的DNA 帶與載體帶分開；2. 紫外燈下用干凈的刀片切下含目的DNA 帶的膠塊放入離心管中；（注意：不含DNA 的膠盡可能切除，在長波長的紫外燈下切膠，并盡量縮短DNA 暴露在紫外光下的時間）3. 按400µl/100mg 膠的比例加入Binding Buffer II , 50-60ºC 水浴中10分鐘，使膠融化，每2-3分鐘混勻一次；（注意若膠的濃度較大需增加Binding Buffer II 的比例、增加融膠的時間，若膠

11、塊體積較大也需增加融膠的時間）4. 將融化的膠溶液轉移到套放在2ml收集管內(nèi)的UNIQ-10 柱中，放置2分鐘，8000rpm離心1分鐘；5. 取下UNIQ-10 柱，倒掉收集管內(nèi)的廢液，將UNIQ-10 柱放入同一個收集管內(nèi)，加入500l Wash Solution ,8000rpm 室溫離心1分鐘；6. 重復5步一次；7. 取下UNIQ-10 柱，倒掉收集管內(nèi)的廢液，將UNIQ-10 柱放入同一個收集管內(nèi)，12000rpm 室溫離心15秒；8. 將UNIQ-10 柱放入一個新的1.5ml 離心管內(nèi)，在柱子膜中央加40µl Elution Buffer 或水（），室溫或37

12、6;C 放置2分鐘；（提高洗脫溫度到55ºC-80ºC有利于提高DNA 的洗脫效率）；9. 12000rpm室溫離心1分鐘，離心管中的溶液即為回收的DNA 片段。2.2.5 連接反應（10l體系）：外源DNA 4 ml目的載體DNA 4 ml10 ´ buffer 1 mlT4 ligase (1U/ml) 1 ml 16 ºC 水浴保溫過夜2.2.6.1 CaCl2感受態(tài)細胞的制備步驟1. 前夜接種受體菌（DH5a），挑取單菌落于LB培養(yǎng)基中37搖床培養(yǎng)過夜（約16小時）；2. 取1ml過夜培養(yǎng)物于100ml添加有20mM MgCl2的LB培養(yǎng)基中，在

13、37搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)約小時（300rpm）；3. 將0.1M CaCl2溶液置于冰上預冷；以下步驟需在超凈工作臺和冰上操作4. 吸取培養(yǎng)好的菌液至離心管中，在冰上冷卻10分鐘；5. 4下4000rpm冷凍離心10分鐘；6. 再吸取菌液，重復操作4、5；7. 棄去上清，加入100ml預冷0.1M CaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮，在冰放置20分鐘；8. 4下4000 rpm冷凍離心10分鐘；9. 棄去上清，加入100ml預冷0.1M CaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸?。?0. 細胞懸浮液可立即用于轉化實驗或添加冷凍保護劑（15%20%甘油）后超低溫

14、冷凍貯存?zhèn)溆茫?0）。3結果和討論DNA質(zhì)量檢測圖1.質(zhì)粒DNA質(zhì)量檢測圖圖1是質(zhì)粒DNA提取后的凝膠電泳檢測的圖片，圖中的各條帶均可見表示所需質(zhì)粒抽提成功，質(zhì)粒DNA提取的質(zhì)量一般。圖片中1號為Puc19載體，圖中可看到4條帶，最靠近膠孔的為雜帶，下邊的3條帶由膠孔至膠底依次為開環(huán)狀質(zhì)粒、線狀質(zhì)粒和超螺旋狀質(zhì)粒。圖中2號為攜帶目標片段M812的載體pU1301，靠近膠孔有拖帶現(xiàn)象，出現(xiàn)這種情況可能的原因是部分DNA被降解。抽提質(zhì)粒過程中，吸取上清時可能混入雜質(zhì)，導致了1號泳道的情況，而2號泳道的降解可能是因為溶水后放置了太長時間導致，以后需要注意。1 2 3 4 圖2.質(zhì)粒酶切后凝膠電泳圖（

15、1為puc19,3為pu1301）圖2是質(zhì)粒經(jīng)BamH I和Kpn I酶切后凝膠電泳的照片，可以看出質(zhì)粒的酶切都比較理想。本組在雙酶切實驗中質(zhì)粒切割較完全，可能原因是注入酶時較謹慎，未帶入多余的酶，因此酶用量事宜，未引起星星活性。此外，當?shù)孜锖兔傅瘸煞志尤胪耆螅窘M在實驗中將其彈均，并進行短暫離心使其充分混勻，因此酶切結果較為理想。圖3大腸桿菌感受態(tài)細胞轉化結果轉化結果，全被雜菌污染，出現(xiàn)藍色自連菌落，成功轉化菌落無法識別。本此實驗中，培養(yǎng)皿的培養(yǎng)時間接近30小時，導致衛(wèi)星菌落的產(chǎn)生。據(jù)資料顯示，大腸桿菌在氨芐青霉素上的經(jīng)驗培養(yǎng)時間為12-16小時，若到達預期培養(yǎng)時間時依然未形成可見菌落，

16、則可適當延長培養(yǎng)實驗，直至長出飽滿菌落。實驗中，培養(yǎng)時間過長，導致細胞分泌的-內(nèi)酰胺酶破壞了氨芐青霉素的活性，以致長出雜菌。并且由于最后涂皿時，無菌操作出現(xiàn)問題，導致材料污染雜菌。因此，我們在日后實驗中，一定此次分子克隆實驗結果較為理想，主要原因在于實驗操作較為謹慎，各環(huán)節(jié)的實驗均進行得比較仔細。在質(zhì)粒抽提階段，本組特別加入了氯仿異丙醇抽提環(huán)節(jié)，提高了所提取質(zhì)粒的純度；在回收階段，本組將所切的膠帶再度進行切割，使其成為小塊凝膠，便于其溶解，縮短的溶解時間；在感受態(tài)制備階段，本組注重冰上操作和無菌操作，進入超凈工作臺前將手洗凈，并用酒精棉球仔細擦拭，防止污染。因此，在今后進行相關操作時，應更加注

17、重實驗細節(jié)，從而能增加實驗成功率。二，轉基因水稻外源基因拷貝數(shù)檢測摘要通過CTAB法提取水稻總DNA，經(jīng)Hind III酶切處理后進行瓊脂糖凝膠電泳并將其結果轉移至硝酸纖維素尼龍膜上。用已制變性探針在膜上進行雜交后顯色，則根據(jù)顯色后的條帶情況則測定轉基因水稻外源基因拷貝數(shù)。關鍵詞CTAB法，總DNA，Southern印跡，地高辛；1 前言分子雜交技術，可以用于檢測轉基因水稻外源基因拷貝數(shù)。本實驗中主要采用Southern雜交技術進行檢測。Southern雜交是由Southern等人于1977年發(fā)明的一種檢測DNA分子的一種方法，通過Southern印跡轉移將瓊脂糖膠上的DNA分子轉移到硝酸纖維

18、素濾膜上，然后用經(jīng)過地高辛標記的探針進行分子雜交，在濾膜上找到與核酸探針也有同源序列的DNA分子。用于雜交的水稻總DNA由CTAB法抽提而來，CTAB(十六烷基三甲基溴化銨）是一種非離子去污劑，CTAB與核酸形成復合物，此復合物在高鹽（>0.7mM）濃度下可溶，并穩(wěn)定存在，但在低鹽濃度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸復合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白質(zhì)及多糖等仍溶解于溶液中。經(jīng)離心棄上清后，CTAB-核酸復合物再用7075%酒精浸泡可洗脫掉CTAB。由此可以得到純度較高的轉基因水稻總DNA。HindIII的酶切位點是AAGCTT，用HindIII處理后的總DNA在

19、0.8%的瓊脂糖凝膠電泳后呈現(xiàn)連續(xù)的條帶，便于進行雜交。雜交所用探針為地高辛所標記。地高辛（DIG）是靈敏度高、非放射性核酸標記檢測體系。DIG檢測靈敏度接近同位素而無放射性危險、相比熒光則不需要特殊檢測設備，相比生物素則沒有樣本內(nèi)源干擾之苦，很適合用于核酸非放標記檢測。2 材料和方法新鮮幼嫩轉基因水稻葉片；×CTAB，氯仿/異戊醇（24:1），95%乙醇，70%乙醇，3M NaAc，ddH2O;步驟1.采取新鮮幼嫩葉片在研缽中用液態(tài)氮冷凍，研磨成細粉；2.取約左右細粉于離心管，加入1ml預熱至95ºC以上的×CTAB，混勻；3. 65ºC水浴中放置30

20、分鐘，每隔5分鐘上下顛倒混合數(shù)次 (DNase變性，促進內(nèi)溶物釋放)；4.12000rpm離心2分鐘； 600ml上清于新的離心管，加入等體積氯仿/異戊醇（24:1），上下顛倒混勻至下層有機相呈深綠色（約15-20分鐘）；6.12000rpm離心5分鐘；450ml上清于新的離心管，加入兩倍體積95乙醇和1/10體積3M NaAc，輕輕的顛倒混勻至絮狀沉淀形成；8.12000rpm離心10分鐘；9.棄去上清。用500ml 70乙醇浸洗沉淀5分鐘，除去離子及CTAB殘余，棄上清,自然干燥；2O溶解。11.待總DNA充分溶解后取5ul,并加入2ul 6×Loading Buffe

21、r在0.8%的瓊脂糖凝膠上進行電泳。根據(jù)染色后的條帶檢測總DNA抽提效果。2.1.4植物總DNA的酶切檢測（20ml體系）DNA10 ml Hind3(10U/µl)1 ml 10×buffer2 ml ddH2O 7 ml 37°C 酶切過夜;電泳檢測酶切效率：每樣品1/10量上樣，電泳檢測(2ml 總DNA 酶切產(chǎn)物+1ml 10×loading buffer+7 ml H2O)。加入終濃度為12.5m mol/L的EDTA以鰲合鎂離子而終止酶的反應(加上樣緩沖液終止酶切)22探針的地高辛標記模板DNA，去離子水，DiG-high Primer ；2

22、.1.2地高辛標記步驟（10µl）1將300ng 模板DNA用無菌去離子水補足至8 µ l。2沸水浴或干浴98 ºC 10分鐘，使DNA變性成單鏈并迅速冰浴冷卻。3充分混勻DiG-high Primer （1#管），并取2 µ l至變性DNA管，混勻并離心。437 ºC溫育1小時或過夜（最大到不超過20小時）。5停止反應，65 ºC加熱10分鐘。l; 2.將試劑盒提供的control DNA稀釋到1ng/l (原始濃度是5ng /l);3.將上述稀釋的2-9 號管的control DNA 及探針DNA各取1l點膜;ºC固定3

23、0分鐘或紫外交鏈3-5分鐘;5.將膜放入裝有20ml Maleic acid buffer 的塑料器皿中，室溫2分鐘;6.將膜放入10ml Blocking solution中室溫溫育30分鐘;7.將膜放入10ml Antibody solution 中室溫溫育30分鐘;8.用10ml Washing buffer 洗2次，每次15分鐘;9.在10ml Detection buffer 平衡2-5分鐘;10.將膜放入2ml 新配制的Color substrate solution 中暗室條件下顯色。顯色過程中不要搖動。;11.當斑點或帶顯示出來后，用50ml滅菌的雙蒸水洗膜5分鐘，照相;2.3

24、 Southern 印跡2.3.11材料以及用具固相支持物:硝酸纖維素膜；脫嘌呤試劑（0.125M HCl）;試劑：變性緩沖液 (1.5M NaCl, 0.5M NaOH);中和緩沖液（1.5M NaCl, 0.5M Tris）;轉膜緩沖液：20×SSC;用具：2個合適大小的水盤；1根玻璃棒，1塊鏟膠板，1個切膠刀；2張搭鹽橋的濾紙；1張合適大小的尼龍膜；2張比尼龍膜稍大的濾紙；一疊5cm左右厚的吸水紙；1大1小2塊玻璃板；（1）電泳槽中移出凝膠置于塑料板上，用切膠板把膠切成適當大小，切去右上角（最后一個樣品的最前端）作為電泳方向記號；（2）把凝膠翻面，放入加有足量的0.125M的

25、HCl玻璃盤中，輕輕搖動約10min，使電泳指示劑溴酚藍變?yōu)辄S色為止（脫嘌呤）。倒去HCl溶液，加蒸餾水漂洗凝膠；（3）倒去蒸餾水，加入足量變性緩沖液（NaOH/NaCl）淹沒凝膠，輕輕搖動變性30min。倒去變性緩沖液，加蒸餾水漂洗；（4）倒去蒸餾水，加入足量的中和緩沖液（Tris/NaCl）淹沒凝膠，輕輕搖動30min中和。倒去中和液，蒸餾水漂洗；（5）20×SSC 中平衡10 min以上；(20×SSC)，放上洗凈的玻璃板，用2-3張濾紙放在玻璃板上，兩端浸入轉膜液中搭制鹽橋（注意濾紙之間不能有氣泡）3在鹽橋濾紙上灑些轉膜液，立即將膠放在鹽橋上（注意凝膠與鹽橋之間不要

26、有氣泡），膠的四周用塑料片與膠緊緊相連，防止短路（即放置吸水紙與鹽橋相接）4.小心將膜覆蓋在凝膠上（膜可以先用H2O浸濕，再放到20×SSC中平衡，膜與凝膠之間不要有氣泡，要求一次成功，膜一旦貼到凝膠不能移動）5.膜上放2張濾紙，濾紙上放不少于5cm厚的吸水紙，放上玻板，其上壓約350g的重物，轉膜過夜；1.轉膜完畢，將膜小心取下，2×SSC 短暫漂洗，用兩張濾紙包住膜，置于真空干燥箱中， 80固定2 h或120 30min；2.用EB染膠以檢測轉移效果；雜交液：5×SSC (NaCl，檸檬酸鈉)；50mM PB (NaH2PO4，Na2HPO4)；5×

27、Denhardt (多聚蔗糖，聚乙烯比咯烷酮，BSA)；2.5mmEDTA （有/無）；100ug/ml SS DNA (鮭精DNA)；0.1%SDS；10%硫酸葡聚糖（dextran sulfate）；將尼龍膜在2×SSC中浸濕，放入雜交管中，加入適量雜交液（雜交液浸沒膜），趕氣泡，封口，放入65°C的雜交箱中，預雜交過夜。DiG Easy Hyb（將64ml 無菌去離子水分兩部分倒入試劑7#瓶（DiG Easy Hyb Granules)，37 ºC搖動溶解5分鐘）1.預熱一定體積的DiG Easy Hyb（10ml/100cm2膜）至雜交溫度37-42 &#

28、186;C 。2.預雜交30分鐘。在不加探針的情況下，僅將膜放在雜交液中42 ºC下充分潤濕。（此過程可以延長至數(shù)小時）3.變性：Dig標記的探針（約25ng/ml）加50µl H2O置沸水浴或98 ºC干浴鍋中5分鐘后迅速放在冰上冷卻。（不能用堿變性?。?.將變性的探針加入預熱的DIG Easy Hyb（3.5ml/100cm2）中，混勻，避免泡沫。5.倒出預雜交液，加入探針和DIG Easy Hyb混合液。繼續(xù)在42 ºC下雜交6h 至過夜（單拷貝探針）。2××SSC；×SSC，0.1%SDS室溫下洗滌5分鐘，洗2次。&

29、#215;SSC，0.1%SDS 65-68溫和振蕩15分鐘，洗2次。Washing buffer；Maleic acid buffer；Detection buffer；Detection buffer；TE buffer；Blocking solution；Antibody solution(Ab) solution；Color-substrate solution；2.3.6.2操作步驟（室溫下進行）1雜交和洗膜后，用馬來酸緩沖液（Washing Buffer， Buffer1）浸泡1-5分鐘2在100ml 1×Block solution（Buffer2）中溫育30分鐘3用1

30、×Block solution（Buffer2）稀釋抗體DIG-抗原偶聯(lián)物至150mU/ml（1:5000）4用20ml antibody solution處理膜30分鐘5用100ml Washing Buffer( Buffer1)洗膜15分鐘，洗2次6在20ml detection buffer（Buffer3）中平衡2-5分鐘7在10ml 新鮮配制的color substrate solution中處理膜5分鐘，放在塑料袋或盒中，保持黑暗中。注意不要在顯色過程中搖動(顏色沉淀在幾分鐘內(nèi)開始出現(xiàn)，在16小時內(nèi)完成顯色反應，在顯色過程中膜可在光亮處短暫暴露幾次)9當預期的斑點出現(xiàn)時

31、，可在50ml水中洗膜5分鐘中止反應。10結果照像。3 實驗結果和討論 1 2 3 4圖4.總DNA抽提凝膠電泳結果圖4是本組所抽提的總DNA電泳檢測結果。圖中最左邊為DNA Marker，1-4為抽提總DNA的條帶。2號總DNA為本人抽提。可以看出，總DNA抽提過程中出現(xiàn)重大失誤，總DNA條帶并沒有顯現(xiàn)出來。并且由膠孔端有一團較亮的團帶，可能是樣品中的RNA未完全去除導致。2號總DNA在提取過程中受到了劇烈搖動，更可能是抽提過程中萃取后洗取上清時出現(xiàn)了問題，導致總DNA條帶缺失。另外實驗環(huán)境是一個開放環(huán)境，若實驗操作不謹慎可能導致外源或內(nèi)源DNA酶將所提取的DNA降解 ，若不慎引入雜菌或內(nèi)源

32、RNA未完全去除，則易在所提取的總DNA中混入RNA。 1 2 3 4總DNA經(jīng)HindIII酶切檢測結果如圖5所示，其中2號為本人酶切，條帶呈現(xiàn)均勻連續(xù)分布的一片，因此本組總DNA的酶切比較完全。本次酶切時間約為17個小時，本組1至4中條帶都很均勻連續(xù)，酶切較完全，為之后的實驗奠定了良好的基礎。如圖所示，轉膜后的瓊脂糖凝膠表面無條帶顯示，說明原本呈現(xiàn)其上的電泳帶已完全轉入硝酸纖維素膜上，圖中所示膠塊形狀不規(guī)則是由于進行處理時膠塊邊緣部分與膠盤邊緣碰撞所致。本組在進行凝膠處理時與上一組一起進行相關操作，導致兩塊膠之間碰撞頻繁，而使邊緣呈現(xiàn)較多缺口。因此在進行凝膠處理時最好單獨操作，以減少不必要

33、的損失。此外，鹽橋搭建完畢后，將凝膠和膜依次放置其上時，應盡量減少其中的氣泡，減小轉膜時的阻礙。同時，塑料隔離板應適當插入膠底，并且塑料隔離板原理膠邊緣段應防止吸水紙與下端濾紙接觸，以防短路。圖7所示為所制地高辛標記的DNA探針檢測圖，左端（近紙邊緣端）為Control DNA,右端（遠離紙邊緣端）為所制的DNS探針。由左右對比可知，所致探針與Control DNA濃度接近，探針標記理想，可近似為200ng/ul。3.5 Southern印跡結果1 2 3 4 marker ern印跡結果圖圖8.所示即顯色后的硝酸纖維素膜，其中1-4為總DNA與探針雜交后的結果，與4右端的DNA Marker

34、相比，其上條帶并不明顯。而膜背景較“干凈”說明用Washing Solution清晰較為透徹，但在取膜時玻璃棒損傷膜表面造成背景有深色劃痕，影響觀測結果。而條帶不明顯可能原因在于對硝酸纖維素膜進行相關操作時不夠仔細，而其原始DNA濃度較低，從而導致條帶不明顯，只有隱約的兩條。本次Southern雜交實驗結果不理想，總結原因所列如下，在進行凝膠的預處理時，進行變性或復性等處理時，操作過于隨意，導致凝膠形狀不規(guī)則，背景雜亂，不利于后期轉膜以及觀察，因此，在今后進行相關操作時應注意保持凝膠的完整性。此外，雖然探針檢測時近似標準濃度，但是由結果推測，雜交時探針可能也出現(xiàn)了問題，諸多問題，在以后的Sou

35、thern雜交實驗中需要注意與解決。 三、基因表達檢測摘要本實驗中選擇在轉錄水平上對基因表達量進行檢測，采用RT-PCR的常見方法；即將用Trizol 試劑抽提出的轉基因水稻幼嫩葉片的RNA進行反轉錄，然后將得到的cDNA進行PCR擴增，通過檢測擴增后的DNA的濃度差異來對RNA的量進行估計。關鍵詞Trizol 試劑；反轉錄；RT-PCR;表達量檢測；1 前言基因表達分析的轉錄水平常用方法有Realtime PCR、Northern Blotting和RT-PCR等。RNA 反轉錄生成的cDNA可作為PCR的模板進行擴增，稱為RT-PCR，RT-PCR比Northern雜交更靈敏，對RNA的質(zhì)

36、量要求較低，操作簡便，它是在轉錄水平上檢測基因時空表達的常用方法。本實驗中采用Trizol 試劑進行轉基因水稻mRNA的抽提，Trizol 試劑是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的單相的快速抽提總RNA的試劑，在勻漿和裂解過程中，能在破碎細胞、降解細胞其它成分的同時保持RNA的完整性。在氯仿抽提、離心分離后，RNA處于水相中，將水相轉管后用異丙醇沉淀RNA。用這種方法得到的總RNA中蛋白質(zhì)和DNA污染很少，可以用來做Northern,RT-PCR,分離RNA，體外翻譯和分子克隆等。由于所提取的mRNA不能直接進行PCR，所以其必須反轉錄為cDNA才能進行下一步的PCR操作。反轉錄是指進行基因工程過程中

37、，人為地提取出所需要的目的基因的信使RNA，并以之為模板人工合成DNA的過程。莫洛尼氏鼠白血病毒逆轉錄酶（M-MLV RT）能以單鏈RNA或DNA為模板，在引物的引發(fā)下合成與模板互補的DNA鏈。本實驗中使用invitrogen公司提供的MMLV反轉錄酶，將所抽提的RNA反轉錄為cDNA，以便進行PCR擴增。本實驗以水稻葉片RNA為材料，檢測轉基因水稻gus基因的表達。實驗中設置一個看家基因作為陽性對照，判斷RNA 的定量及反轉錄、PCR等過程是否有問題；設置一個不加模板RNA的陰性對照，主要是消除DNA及PCR試劑方面引起的假陽性；同時設置一個以葉片DNA為陽性對照，檢驗擴增帶型是否來源于反轉

38、錄的cDNA,2 材料和方法2.1植物總RNA的抽提（Trizol試劑法）和電泳檢測轉gus基因水稻的幼嫩葉片；Trizol試劑；氯仿；異丙醇；75%乙醇；DEPC水；RNA的抽提及檢測步驟1.液氮研磨植物葉片，每1.5ml tube分裝克樣品；1毫升Trizol 試劑（樣品體積不超過Trizol 試劑體積的10），迅速混勻（若樣品較多可先將混好的樣品置于冰上）；室溫下凈置510分鐘以利于核酸蛋白質(zhì)復合體的解離；200 µl的氯仿，用手劇烈搖蕩15秒，室溫下靜置5分鐘左右；，12000rpm冷凍離心10-15分鐘；5.將水相（上清）轉入一新離心管，加0.5ml 異丙醇室溫下沉淀10分

39、鐘；，12000rpm離心15分鐘；7.棄上清，加1ml 75乙醇清洗RNA，振蕩片刻后（務必使沉淀懸浮起來，以確保洗滌干凈），7500rpm離心5分鐘，小心棄上清；515分，使RNA沉淀恰好干燥，加入20 µl DEPC水溶解保存于-70 。2 µl進行瓊脂糖電泳檢測RNA質(zhì)量。RT-PCR(反轉錄PCR) 用Trizol試劑抽提的植物總RNA；反轉錄試劑：RNase-free DNase I;10×DNase I buffer;DEPC-treated ddH2O;PCR試劑：TaKaRa Ex Taq(5u/ml)；dNTP mixture(2mM);10&

40、#215;Ex Taq buffer;mg/ml;2.用處理過的RNA專用0.5ml管按下列反應體系配置反應（冰上操作）； Total RNA 3ml(2-5mg) RNase-free DNase I ml (u / ml) 10× DNase I buffer1 ml DEPC-treated ddH2O 5 ml3.37保溫15 min,然后放于70水浴鍋中10 min進行失活. 4.反轉錄反應（冰上操作）（1）加入1 ml oligo (dT)（500 mg / ml）15 primer, 輕柔攪拌并短暫離心以混勻。（2）在70下將混合物干浴10min，然后立刻在冰上放置5min;（3）配置下列反應5 × first strand buffer4 ml0.1 M DTT2 ml10 mM dNTP 1 mlM-MLV (200 U / ml) 1 mlml在37水浴保溫1小時；處理15min終止反應，然后加入20mlddH2O稀釋；3.2.4 PCR反應以及檢測步驟體系