常用電泳技術(shù)

1、姓 名： 高源專 業(yè): 生物化工學(xué) 號(hào)： 201420709電泳技術(shù)電泳技術(shù)1Contents 簡介及發(fā)展過程簡介及發(fā)展過程1234電泳的原理電泳的原理影響電泳分離的主要因素影響電泳分離的主要因素常用的電泳介紹常用的電泳介紹21.1.簡介及發(fā)展過程簡介及發(fā)展過程電泳可以定義為帶電的膠體粒子或大分子在外加直流電場中向帶相反電荷的電極做定向移動(dòng)的現(xiàn)象。帶正電荷的粒子向負(fù)極移動(dòng)，帶負(fù)電荷的粒子向正極移動(dòng)。電泳分離則是利用荷電溶質(zhì)在電場中泳動(dòng)速度的差別來進(jìn)行分離的一種方法。 l電泳技術(shù)：電泳技術(shù)： 3l最早發(fā)現(xiàn)于最早發(fā)現(xiàn)于1808年。俄國物理學(xué)家年。俄國物理學(xué)家Pehce于于1809年在濕年在濕黏土中

2、插上帶玻璃管的正負(fù)極兩個(gè)電極，加壓后發(fā)現(xiàn)正極黏土中插上帶玻璃管的正負(fù)極兩個(gè)電極，加壓后發(fā)現(xiàn)正極玻璃管中原有的水層變渾濁，即帶負(fù)電荷的黏土顆粒向正玻璃管中原有的水層變渾濁，即帶負(fù)電荷的黏土顆粒向正極移動(dòng)，這就是電泳現(xiàn)象。極移動(dòng)，這就是電泳現(xiàn)象。l在在1937年由瑞典科學(xué)家年由瑞典科學(xué)家A.tiselius利用利用U形玻管進(jìn)行血清形玻管進(jìn)行血清蛋白電泳，以界面折光率差別分離蛋白。蛋白電泳，以界面折光率差別分離蛋白。l1948年年 Wieland等發(fā)明以濾紙作為支持物，使電泳技術(shù)等發(fā)明以濾紙作為支持物，使電泳技術(shù)大為簡化。大為簡化。l 電泳作為一種生化分離手段已廣泛應(yīng)用于生物大分子的電泳作為一種生化

3、分離手段已廣泛應(yīng)用于生物大分子的分離、純化、分析、制備以及用于測定它們的分子量、等分離、純化、分析、制備以及用于測定它們的分子量、等電點(diǎn)等。已成為生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、制藥學(xué)、食品、生物工電點(diǎn)等。已成為生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)、制藥學(xué)、食品、生物工程、環(huán)境工程等領(lǐng)域常用的實(shí)驗(yàn)手段。程、環(huán)境工程等領(lǐng)域常用的實(shí)驗(yàn)手段。 42.電泳的原理5u帶有電荷生物分子在電場作用下發(fā)生移動(dòng)帶有電荷生物分子在電場作用下發(fā)生移動(dòng);u由于混合物各組分所帶電荷性質(zhì)，數(shù)量以及由于混合物各組分所帶電荷性質(zhì)，數(shù)量以及 分子量各不同，在同一電場作用下，各組分子量各不同，在同一電場作用下，各組 分的泳動(dòng)方向和速度也各有差異分的泳動(dòng)方向和速度也各

4、有差異;u在一定時(shí)間內(nèi)，他們移動(dòng)距離不同，從而可在一定時(shí)間內(nèi)，他們移動(dòng)距離不同，從而可 達(dá)到分離鑒定的目的。達(dá)到分離鑒定的目的。 61.蛋白質(zhì)的電荷來源蛋白質(zhì)的電荷來源從電泳的角度來看，蛋白質(zhì)分子最主要的特性就是它的帶電行為：從電泳的角度來看，蛋白質(zhì)分子最主要的特性就是它的帶電行為：等電點(diǎn)（等電點(diǎn)（pI）：在某一條件的）：在某一條件的PH下，蛋白質(zhì)所帶的正負(fù)電荷數(shù)相等。下，蛋白質(zhì)所帶的正負(fù)電荷數(shù)相等。即凈電荷為零。即凈電荷為零。當(dāng)體系：當(dāng)體系：pHpI，蛋白質(zhì)分子會(huì)解離出，蛋白質(zhì)分子會(huì)解離出 而帶負(fù)電，向陽極移動(dòng)；而帶負(fù)電，向陽極移動(dòng)；當(dāng)體系：當(dāng)體系：pHpI，蛋白質(zhì)分子會(huì)結(jié)合，蛋白質(zhì)分子會(huì)結(jié)

5、合 而帶正電，向陰極移動(dòng)；而帶正電，向陰極移動(dòng)； 特定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)取決于它的氨基酸組成，是一個(gè)物理化學(xué)常特定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)取決于它的氨基酸組成，是一個(gè)物理化學(xué)常數(shù)。對(duì)于不同的蛋白質(zhì)，其等電點(diǎn)范圍很寬，在一定的數(shù)。對(duì)于不同的蛋白質(zhì)，其等電點(diǎn)范圍很寬，在一定的PH下，不同下，不同蛋白質(zhì)分子所帶電荷的電性和電量不同，由此可進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離和蛋白質(zhì)分子所帶電荷的電性和電量不同，由此可進(jìn)行蛋白質(zhì)的分離和分析。分析。HH-2-33COO-CHR-NHCOO-CHR-NHCOOH-CHR-NHpHpI72.遷移率遷移率 在一定的在一定的PH條件下，蛋白質(zhì)分子會(huì)解離而帶電，帶電的性質(zhì)和電荷條件下，蛋白質(zhì)分子

6、會(huì)解離而帶電，帶電的性質(zhì)和電荷密度取決于蛋白質(zhì)分子的性質(zhì)和溶液的密度取決于蛋白質(zhì)分子的性質(zhì)和溶液的PH。不同的帶點(diǎn)顆粒在同一電場。不同的帶點(diǎn)顆粒在同一電場的運(yùn)動(dòng)速度不同，可以用遷移率來表示。的運(yùn)動(dòng)速度不同，可以用遷移率來表示。遷移率（遷移率（m，mobility）即帶電顆粒在單位電場強(qiáng)度下的泳動(dòng)速度：）即帶電顆粒在單位電場強(qiáng)度下的泳動(dòng)速度： m-遷移率，遷移率， ; v-遷移速度，遷移速度，cm/s; E-電場強(qiáng)度電場強(qiáng)度,V/cm; d- 遷移距離遷移距離,cm； t-電泳時(shí)間，電泳時(shí)間，s； U-電壓，電壓，V； l-凝膠長度，凝膠長度，cm。lUtdEvmVscm2?8當(dāng)球形分子在電場中

7、以恒定速率移動(dòng)時(shí)，所受的動(dòng)力和阻力當(dāng)球形分子在電場中以恒定速率移動(dòng)時(shí)，所受的動(dòng)力和阻力平衡，即：平衡，即： （Stoke定律）定律） r6EQ Q-被分離分子所帶凈電荷；被分離分子所帶凈電荷； -介質(zhì)黏度；介質(zhì)黏度；r-分子半徑。分子半徑。于是有：于是有： r6Qm 即：即：蛋白質(zhì)的遷移率與帶電顆粒的分子大小、介質(zhì)的黏度、顆粒蛋白質(zhì)的遷移率與帶電顆粒的分子大小、介質(zhì)的黏度、顆粒所帶的電荷有關(guān)。所帶的電荷有關(guān)。一般來說，所帶凈電荷越多，顆粒越小，越接近球形，則在電場一般來說，所帶凈電荷越多，顆粒越小，越接近球形，則在電場中遷移速率越快，反之越慢。中遷移速率越快，反之越慢。9對(duì)于兩種蛋白質(zhì)來講，物

8、質(zhì)對(duì)于兩種蛋白質(zhì)來講，物質(zhì)A和和B：當(dāng)使用同一介質(zhì)分離兩種物質(zhì)時(shí)：當(dāng)使用同一介質(zhì)分離兩種物質(zhì)時(shí)：物質(zhì)物質(zhì)A在電場中移動(dòng)的距離在電場中移動(dòng)的距離: dA =mA Et 某物質(zhì)某物質(zhì)B在電場中移動(dòng)的距離：在電場中移動(dòng)的距離：dB =mB Et 兩物質(zhì)移動(dòng)距離差為：兩物質(zhì)移動(dòng)距離差為： d=(dA- dB)=(mA-mB) Et 若若mA = mB 則則d=0 兩種物質(zhì)不能分離兩種物質(zhì)不能分離 若若mA mB 則則d0 兩種物質(zhì)能分離兩種物質(zhì)能分離結(jié)論：不同蛋白質(zhì)的結(jié)論：不同蛋白質(zhì)的m不同，蛋白質(zhì)就能夠分離開來，蛋白質(zhì)電不同，蛋白質(zhì)就能夠分離開來，蛋白質(zhì)電泳正是根據(jù)此原理對(duì)不同物質(zhì)進(jìn)行分離的。泳正是

9、根據(jù)此原理對(duì)不同物質(zhì)進(jìn)行分離的。 3.影響電泳分離的主要因素10 內(nèi)在因素：內(nèi)在因素：蛋白質(zhì)分子蛋白質(zhì)分子本身的性質(zhì)本身的性質(zhì)12 電場強(qiáng)度電場強(qiáng)度E溶液的性質(zhì)溶液的性質(zhì)3其他其他41.蛋白質(zhì)的性質(zhì)蛋白質(zhì)的性質(zhì) 蛋白質(zhì)分子的氨基酸組成決定其在某個(gè)蛋白質(zhì)分子的氨基酸組成決定其在某個(gè)PH條件下的電性和電條件下的電性和電量，進(jìn)而決定了它的電泳速度；蛋白質(zhì)分子的形狀和大小也影響量，進(jìn)而決定了它的電泳速度；蛋白質(zhì)分子的形狀和大小也影響它的電泳速度。它的電泳速度。2.電場強(qiáng)度電場強(qiáng)度 電場強(qiáng)度電場強(qiáng)度(Electric field intensity)是指每厘米的電位降。是指每厘米的電位降。 電場強(qiáng)度對(duì)電

10、泳速度起著正比作用，越大則帶電顆粒遷移越電場強(qiáng)度對(duì)電泳速度起著正比作用，越大則帶電顆粒遷移越快，電泳時(shí)間越短（高壓電泳）；反之遷移慢，電泳時(shí)間長（?？欤娪緯r(shí)間越短（高壓電泳）；反之遷移慢，電泳時(shí)間長（常壓電泳）。壓電泳）。3.溶液的性質(zhì)溶液的性質(zhì)（1）溶液的）溶液的PH 決定帶點(diǎn)顆粒的電性和電量，對(duì)于氨基酸或蛋白質(zhì)等兩性電解決定帶點(diǎn)顆粒的電性和電量，對(duì)于氨基酸或蛋白質(zhì)等兩性電解質(zhì)來說，質(zhì)來說，溶液的溶液的pH值離其等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，其凈電荷量就越大，遷移值離其等電點(diǎn)越遠(yuǎn)，其凈電荷量就越大，遷移速度加快。速度加快。因此需選擇合適的因此需選擇合適的pH，使欲分離的各種蛋白質(zhì)所帶電，使欲分離的各種蛋白質(zhì)

11、所帶電荷的電性相同但是電量有較大的差異，以利于分離。荷的電性相同但是電量有較大的差異，以利于分離。（2）溶液的離子強(qiáng)度）溶液的離子強(qiáng)度 離子強(qiáng)度越低，欲分離組分的遷移速度越快離子強(qiáng)度越低，欲分離組分的遷移速度越快；但離子強(qiáng)度太低；但離子強(qiáng)度太低則緩沖能力太小。合適的離子強(qiáng)度范圍在則緩沖能力太小。合適的離子強(qiáng)度范圍在0.02-0.2mol/L之間。之間。（3）溶液的黏度）溶液的黏度 電泳遷移率與溶液的黏度成反比，所以黏度不能過大或過小。電泳遷移率與溶液的黏度成反比，所以黏度不能過大或過小。4.其他因素其他因素（1）電滲現(xiàn)象）電滲現(xiàn)象 在電場中液體（通常指水）對(duì)固體支持物的相對(duì)移動(dòng)。在電場中液體（

12、通常指水）對(duì)固體支持物的相對(duì)移動(dòng)。 電滲是由于電泳支持介質(zhì)上含有帶電基團(tuán)，從而吸附流動(dòng)相向電滲是由于電泳支持介質(zhì)上含有帶電基團(tuán)，從而吸附流動(dòng)相向正極或負(fù)極移動(dòng)。電泳時(shí)，帶電顆粒的遷移速度是顆粒本身的遷移正極或負(fù)極移動(dòng)。電泳時(shí)，帶電顆粒的遷移速度是顆粒本身的遷移速度與由于電滲攜帶顆粒的移動(dòng)速度之矢量和。為消除電滲現(xiàn)象，速度與由于電滲攜帶顆粒的移動(dòng)速度之矢量和。為消除電滲現(xiàn)象，可選擇無電滲的電泳介質(zhì)?？蛇x擇無電滲的電泳介質(zhì)。（2）電泳的支持介質(zhì)）電泳的支持介質(zhì) 要求介質(zhì)均勻，對(duì)樣品吸附力小。吸附會(huì)延緩電泳分離。要求介質(zhì)均勻，對(duì)樣品吸附力小。吸附會(huì)延緩電泳分離。（3）溫度）溫度 電泳過程中會(huì)產(chǎn)熱，造

13、成樣品的擴(kuò)散及燒膠。因此需控制電壓電泳過程中會(huì)產(chǎn)熱，造成樣品的擴(kuò)散及燒膠。因此需控制電壓或電流，或安裝冷卻系統(tǒng)?；螂娏?，或安裝冷卻系統(tǒng)。按分離原理 移界電泳 區(qū)帶電泳 穩(wěn)態(tài)電泳有無固體支持物 自由電泳 支持物電泳電泳 電泳分類電泳分類010203聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）等電聚焦（IEF）常用的幾種電泳介紹04雙向電泳（2D）1.聚丙烯酰胺凝膠電泳l聚丙烯酰胺凝膠電泳是蛋白質(zhì)分離與分析中最聚丙烯酰胺凝膠電泳是蛋白質(zhì)分離與分析中最常用的電泳方法，包括常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳常用的電泳方法，包括常規(guī)聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）和）和SDS-聚丙烯酰

14、胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。）。l聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳 是是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。方法。l聚丙烯酰胺凝膠是聚丙烯酰胺凝膠是由由丙烯酰胺丙烯酰胺單體單體和和交聯(lián)劑交聯(lián)劑N,N-甲叉雙丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺在在催化催化劑作用下合成的。劑作用下合成的。PAGEl電泳原理電泳原理 在凝膠中存在凝膠層、緩沖液、在凝膠中存在凝膠層、緩沖液、pH值及電場強(qiáng)度的值及電場強(qiáng)度的不連續(xù)性不連續(xù)性。大孔徑，樣品在其中濃縮，在與分離膠的界面上形成薄層，大孔徑，樣品在其中濃縮，在與分離膠的界面上形成薄層，只具有電荷效應(yīng)。

15、只具有電荷效應(yīng)。小孔徑，具有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達(dá)到分離的目的。小孔徑，具有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)，達(dá)到分離的目的。1.電荷效應(yīng)電荷效應(yīng) pI不同，在恒定緩沖系統(tǒng)中不同蛋白質(zhì)間同性凈不同，在恒定緩沖系統(tǒng)中不同蛋白質(zhì)間同性凈電荷的差異。電荷的差異。2.分子篩效應(yīng)分子篩效應(yīng) 蛋白質(zhì)分子的大小和形狀的差異；蛋白質(zhì)通過一蛋白質(zhì)分子的大小和形狀的差異；蛋白質(zhì)通過一定的分離膠時(shí)，受阻滯程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移定的分離膠時(shí)，受阻滯程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率。率。3.樣品的濃縮效應(yīng)樣品的濃縮效應(yīng) 在不連續(xù)的凝膠電泳中，樣品首先經(jīng)過大孔徑的在不連續(xù)的凝膠電泳中，樣品首先經(jīng)過大孔徑的濃縮膠被濃縮，再經(jīng)過小孔徑

16、的分離膠進(jìn)行分離。濃縮膠被濃縮，再經(jīng)過小孔徑的分離膠進(jìn)行分離。濃縮膠與分離膠之間不僅存在凝膠孔徑的不連續(xù)性，濃縮膠與分離膠之間不僅存在凝膠孔徑的不連續(xù)性，還存在緩沖液系統(tǒng)的不連續(xù)性。還存在緩沖液系統(tǒng)的不連續(xù)性。凝膠電泳的分類l按被分離的蛋白質(zhì)電性按被分離的蛋白質(zhì)電性陽極電泳：陽極電泳：為通常使用的電泳方式，為通常使用的電泳方式，pH8.0-9.0，多數(shù)，多數(shù)蛋白質(zhì)帶負(fù)電，向正極遷移。蛋白質(zhì)帶負(fù)電，向正極遷移。陰極電泳：陰極電泳：僅用于分離堿性蛋白質(zhì)，僅用于分離堿性蛋白質(zhì)，pH4.0左右，蛋左右，蛋白質(zhì)帶正電，向陰極遷移白質(zhì)帶正電，向陰極遷移l按電泳系統(tǒng)的連續(xù)性按電泳系統(tǒng)的連續(xù)性連續(xù)電泳：連續(xù)電

17、泳：系統(tǒng)中緩沖液系統(tǒng)中緩沖液pH和凝膠濃度保持不變。無和凝膠濃度保持不變。無濃縮效應(yīng)。濃縮效應(yīng)。不連續(xù)電泳：不連續(xù)電泳：體系中緩沖液離子組成、體系中緩沖液離子組成、pH以及凝膠濃以及凝膠濃度的不連續(xù)性，有濃縮效應(yīng)，分辨率高。度的不連續(xù)性，有濃縮效應(yīng)，分辨率高。影響分離結(jié)果的因素1.緩沖系統(tǒng)的選擇緩沖系統(tǒng)的選擇u緩沖系統(tǒng)中緩沖系統(tǒng)中pH的選擇的選擇 由于蛋白質(zhì)分離時(shí)需保持溶解狀態(tài)，且蛋白質(zhì)的分離要依據(jù)其由于蛋白質(zhì)分離時(shí)需保持溶解狀態(tài)，且蛋白質(zhì)的分離要依據(jù)其電荷密度，因此電荷密度，因此pH的選擇很重要，一方面要使蛋白質(zhì)的電荷密度差的選擇很重要，一方面要使蛋白質(zhì)的電荷密度差別大有利于分離，另一方面要

18、使蛋白質(zhì)荷電多且?guī)噪姾梢约铀賱e大有利于分離，另一方面要使蛋白質(zhì)荷電多且?guī)噪姾梢约铀俜蛛x。近半數(shù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在分離。近半數(shù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)在pH=4.0-6.5，因此常使用，因此常使用pH=8.0-9.5緩沖體系的陽極電泳。對(duì)于堿性蛋白質(zhì)可采用緩沖體系的陽極電泳。對(duì)于堿性蛋白質(zhì)可采用pH=3.0的的KOH-醋醋酸緩沖系統(tǒng)。酸緩沖系統(tǒng)。u緩沖系統(tǒng)中離子強(qiáng)度的選擇緩沖系統(tǒng)中離子強(qiáng)度的選擇 離子強(qiáng)度低，蛋白質(zhì)遷移速度快，但電泳帶較寬；離子強(qiáng)度高，離子強(qiáng)度低，蛋白質(zhì)遷移速度快，但電泳帶較寬；離子強(qiáng)度高，蛋白質(zhì)遷移速度慢，電泳帶窄細(xì)，但由于高導(dǎo)電性而產(chǎn)生大量熱，蛋白質(zhì)遷移速度慢，電泳帶窄細(xì)，但由于

19、高導(dǎo)電性而產(chǎn)生大量熱，易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性及燒膠。另外，還要使緩沖系統(tǒng)有一定的易導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性及燒膠。另外，還要使緩沖系統(tǒng)有一定的pH緩沖緩沖能力。一般離子強(qiáng)度應(yīng)為能力。一般離子強(qiáng)度應(yīng)為0.01-0.1mol/L,常用的是常用的是0.05mol/L2.凝膠濃度凝膠濃度 凝膠的分子篩效應(yīng)與電泳分辨率、電泳速度凝膠的分子篩效應(yīng)與電泳分辨率、電泳速度密切相關(guān)，而凝膠的孔徑大小決定于凝膠濃度，因密切相關(guān)，而凝膠的孔徑大小決定于凝膠濃度，因此凝膠濃度的選擇很重要。此凝膠濃度的選擇很重要。 一般可根據(jù)樣品中蛋白質(zhì)的分子量范圍選擇一般可根據(jù)樣品中蛋白質(zhì)的分子量范圍選擇合適的凝膠濃度。合適的凝膠濃度。C=2.6%

20、C=5%凝膠濃度T/%分子量范圍/kD凝膠濃度T/%分子量范圍/kD530-200560-7001015-1001022-2801510-501510-200202-15205-150蛋白質(zhì)分子量范圍與聚丙烯酰胺凝膠濃度的關(guān)系蛋白質(zhì)分子量范圍與聚丙烯酰胺凝膠濃度的關(guān)系檢測及處理4電泳3加樣制膠12具體操作步驟具體操作步驟任何一種凝膠電泳都要經(jīng)歷四個(gè)過程。任何一種凝膠電泳都要經(jīng)歷四個(gè)過程?？捡R斯亮藍(lán)染色考馬斯亮藍(lán)染色銀染色銀染色熒光染料熒光染料掃描、記錄結(jié)果掃描、記錄結(jié)果凝膠貯液凝膠貯液分離膠分離膠濃縮膠濃縮膠制備樣品制備樣品蛋白質(zhì)標(biāo)樣蛋白質(zhì)標(biāo)樣加樣加樣應(yīng)用應(yīng)用 可測定蛋白質(zhì)的分子量，對(duì)蛋白質(zhì)組

21、分進(jìn)行可測定蛋白質(zhì)的分子量，對(duì)蛋白質(zhì)組分進(jìn)行分離、分析、純化、定性、定量以及少量的制備。分離、分析、純化、定性、定量以及少量的制備。對(duì)于常規(guī)對(duì)于常規(guī)PAGE，由于電泳后蛋白質(zhì)還保持其生物，由于電泳后蛋白質(zhì)還保持其生物活性，因此尤其適用于分離各種欲保持天然活性活性，因此尤其適用于分離各種欲保持天然活性的蛋白質(zhì)，如酶、抗原、抗體、激素等。的蛋白質(zhì)，如酶、抗原、抗體、激素等。2.SDS-PAGEl在電泳體系中加入了十二烷基硫酸鈉（在電泳體系中加入了十二烷基硫酸鈉（SDS）和）和強(qiáng)還原劑。其中強(qiáng)還原劑。其中SDS作為陰離子去垢劑會(huì)破壞蛋白作為陰離子去垢劑會(huì)破壞蛋白質(zhì)的氫鍵和疏水相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象

22、改變，質(zhì)的氫鍵和疏水相互作用，導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象改變，而巰基乙醇等可以打開蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵，使而巰基乙醇等可以打開蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵，使其分解為亞基，因此電泳過程中蛋白質(zhì)的生物活性其分解為亞基，因此電泳過程中蛋白質(zhì)的生物活性喪失或減弱，但電泳后可恢復(fù)或部分恢復(fù)活性。喪失或減弱，但電泳后可恢復(fù)或部分恢復(fù)活性。l它可用于多肽相對(duì)分子質(zhì)量的分析，其特點(diǎn)是它可用于多肽相對(duì)分子質(zhì)量的分析，其特點(diǎn)是SDS會(huì)使蛋白質(zhì)分離并與之結(jié)合形成會(huì)使蛋白質(zhì)分離并與之結(jié)合形成蛋白蛋白-SDS膠束膠束，所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白質(zhì)原有的電荷，因此所帶的負(fù)電荷大大超過了蛋白質(zhì)原有的電荷，因此消除了電荷差異對(duì)結(jié)果的影響。消除

23、了電荷差異對(duì)結(jié)果的影響。原理原理l蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物在溶液中的形狀像一個(gè)長橢圓棒，復(fù)合物在溶液中的形狀像一個(gè)長橢圓棒，無形狀差別，棒的長度與蛋白質(zhì)亞基分子量有關(guān)，所以無形狀差別，棒的長度與蛋白質(zhì)亞基分子量有關(guān)，所以在在SDS-PAGE中蛋白質(zhì)分子僅存在分子大小的差異，于中蛋白質(zhì)分子僅存在分子大小的差異，于是可利用分子量差異將各種蛋白質(zhì)分開，因此是可利用分子量差異將各種蛋白質(zhì)分開，因此SDS-PAGE常用于測定蛋白質(zhì)亞基的分子量和純度鑒定。常用于測定蛋白質(zhì)亞基的分子量和純度鑒定。影響分離結(jié)果的因素1.緩沖系統(tǒng)的選擇緩沖系統(tǒng)的選擇 對(duì)于對(duì)于SDSPAGE，由于，由于SDS對(duì)蛋白質(zhì)的助溶作用

24、以及負(fù)電荷的對(duì)蛋白質(zhì)的助溶作用以及負(fù)電荷的包裹作用，蛋白質(zhì)的分離僅依據(jù)于亞基的分子大小，因此緩沖液的選包裹作用，蛋白質(zhì)的分離僅依據(jù)于亞基的分子大小，因此緩沖液的選擇極為簡單。擇極為簡單。只要有利于分離并保持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定以及不與只要有利于分離并保持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定以及不與SDS發(fā)生發(fā)生相互作用即可。相互作用即可。2.凝膠濃度凝膠濃度 凝膠濃度決定孔徑大小，而凝膠孔徑影響電泳效果。特別是對(duì)于凝膠濃度決定孔徑大小，而凝膠孔徑影響電泳效果。特別是對(duì)于SDSPAGE，由于電泳分離只取決于，由于電泳分離只取決于SDS蛋白質(zhì)亞基膠束的大小，蛋白質(zhì)亞基膠束的大小，因此凝膠濃度的選擇尤為重要。應(yīng)根據(jù)樣品中蛋白質(zhì)的分

25、子量范圍選因此凝膠濃度的選擇尤為重要。應(yīng)根據(jù)樣品中蛋白質(zhì)的分子量范圍選擇合適的凝膠濃度。擇合適的凝膠濃度。C=2.6%C=5%凝膠濃度T/%分子量范圍/kD凝膠濃度T/%分子量范圍/kD525-200560-1701010-701020-10015501510-502040205-40蛋白質(zhì)分子量范圍與蛋白質(zhì)分子量范圍與SDS-聚丙烯酰胺凝膠濃度的關(guān)系聚丙烯酰胺凝膠濃度的關(guān)系蛋白質(zhì)分子量的測定蛋白質(zhì)分子量的測定電泳遷移率與相對(duì)分子質(zhì)量電泳遷移率與相對(duì)分子質(zhì)量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系：的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系： lgMr = -bmR + K應(yīng)用應(yīng)用 可測定蛋白質(zhì)的分子量，對(duì)蛋白質(zhì)組分進(jìn)行可測定蛋白質(zhì)的分子量，

26、對(duì)蛋白質(zhì)組分進(jìn)行分離、分析、純化、定性、定量以及少量的制備。分離、分析、純化、定性、定量以及少量的制備。相對(duì)于光散射、色譜、超離心、滲透法等。相對(duì)于光散射、色譜、超離心、滲透法等。SDS-PAGE是測定蛋白質(zhì)亞基分子量的一種簡單、經(jīng)濟(jì)、是測定蛋白質(zhì)亞基分子量的一種簡單、經(jīng)濟(jì)、快捷、高分辨的好方法?？旖?、高分辨的好方法。3.等電聚焦 等電聚焦（等電聚焦（IEF）是根據(jù)蛋白質(zhì)分子等電點(diǎn)的不）是根據(jù)蛋白質(zhì)分子等電點(diǎn)的不同，在一個(gè)連續(xù)的、穩(wěn)定的線性同，在一個(gè)連續(xù)的、穩(wěn)定的線性pH梯度中電泳，從梯度中電泳，從而對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離和分析的技術(shù)。由于它具有聚而對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行分離和分析的技術(shù)。由于它具有聚焦效應(yīng)（濃縮效應(yīng)），是目前分辨率最高的技術(shù)。焦效應(yīng)（濃縮效應(yīng)），是目前分辨率最高的技術(shù)。根據(jù)建立根據(jù)建立pH梯度不同：梯度不同：l載體兩性電解質(zhì)：載體兩性電解質(zhì)：將載體兩性電解質(zhì)溶解在電泳介質(zhì)溶液將載體兩性電解質(zhì)溶解在電泳介質(zhì)溶液中制膠，形成聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳，然后將凝膠引中制膠，形成聚丙烯酰胺或瓊脂糖凝膠電泳，然后將凝膠引入電場中等電聚焦。載體兩性電解質(zhì)在凝膠中遷移形成入電場中等電聚焦。載體兩性電解質(zhì)在凝膠中遷移形成pH梯梯度，而樣品則聚焦在其等電點(diǎn)處。分辨率為度，而樣品則聚焦在其等電點(diǎn)處。分辨率為0.01pH單位，上單位，上樣量不可過高。樣量不可過高。l固相固相pH電解