復(fù)正膠囊對(duì)腦缺血復(fù)灌注致大鼠行為學(xué)障礙及腦內(nèi)自由基水平的影響

1、    復(fù)正膠囊對(duì)腦缺血復(fù)灌注致大鼠 行為學(xué)障礙及腦內(nèi)自由基水平的影響*        關(guān)鍵詞復(fù)正膠囊行為學(xué)障礙氧自由基中分類(lèi)號(hào)R285.5 復(fù)正膠囊是我們依據(jù)多年的臨床實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，針對(duì)腦梗死后并發(fā)癡呆的病機(jī)特點(diǎn)，以益氣活血通絡(luò)為主，兼以補(bǔ)腎化痰之藥物共同組成，臨床觀察表明，該藥對(duì)多發(fā)腦梗死癡呆有較好的療效1。為了進(jìn)一步證實(shí)其治療作用，本文初步觀察其對(duì)腦缺血復(fù)灌注致大鼠行為學(xué)障礙及其腦內(nèi)自由基水平的影響，現(xiàn)報(bào)道如下。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用1214月齡、體重35

2、7±37g雄性Wistar大鼠120只，由湖北醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.2藥物來(lái)源及制備復(fù)正膠囊由補(bǔ)陽(yáng)還五湯化裁組成，廣西中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院制劑室生產(chǎn)(每粒含生藥1.5g)。用時(shí)配成0.3g/ml懸液。西藥喜得鎮(zhèn)(Hydergine)，天津華津制藥廠生產(chǎn)。用時(shí)配成0.3mg/ml懸液。1.3動(dòng)物模型的建立2購(gòu)回大鼠飼養(yǎng)3天后，觀察無(wú)異常即進(jìn)行造模，3%戊巴比妥鈉按1mg/kg體重腹腔注射麻醉，固定于大鼠夾板上，暴露椎動(dòng)脈，結(jié)扎并點(diǎn)灼阻閉，然后暴露雙側(cè)頸動(dòng)脈，用動(dòng)脈夾夾閉5分鐘，開(kāi)放1小時(shí)，反復(fù)3次，術(shù)畢縫合切口，待醒后放回籠中飼養(yǎng)，于第7天進(jìn)行行為學(xué)篩選，共有40只入選。

3、行為學(xué)障礙檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)3：(1)手術(shù)前后達(dá)到暗環(huán)境被動(dòng)順避試驗(yàn)內(nèi)容(即5min內(nèi)仍呆在明室而不進(jìn)入暗室)所需的電擊次數(shù)(P0.05)。(2)手術(shù)前后游迷宮進(jìn)入盲端錯(cuò)誤次數(shù)(P0.05)。1.4動(dòng)物分組及治療方法將入選大鼠隨機(jī)分為4組：模型組、西藥組、復(fù)正膠囊大劑量組、復(fù)正膠囊(以下簡(jiǎn)稱(chēng)為中藥)小劑量組，每組10只，另取同批正常大鼠10只作空白對(duì)照組，10只作假手術(shù)組(即單做頸中線切開(kāi)，不做缺血灌注損傷)，中藥大、小劑量組用復(fù)正膠囊懸液分別按10ml/kg體重和5ml/kg體重量灌胃，每日2次，連續(xù)21天，西藥組用喜得鎮(zhèn)懸液，模型組、空白組、假手術(shù)組均用生理鹽水分別按10ml/kg體重量灌胃，次數(shù)及

4、療程同中藥組。1.5行為學(xué)的檢測(cè)參照文獻(xiàn)4采用避暗法和水迷宮法。各組于用藥后第20天上午開(kāi)始訓(xùn)練，經(jīng)過(guò)學(xué)習(xí)訓(xùn)練已達(dá)到暗環(huán)境被動(dòng)回避試驗(yàn)內(nèi)容的大鼠，于24小時(shí)后再次進(jìn)行避暗試驗(yàn)，測(cè)定是將動(dòng)物放入明箱，記錄大鼠自放入明箱到鉆洞進(jìn)入暗箱的潛伏期，5min內(nèi)進(jìn)入暗箱的錯(cuò)誤次數(shù)。5min內(nèi)未鉆洞者，潛伏期按300s計(jì)算。水迷宮試驗(yàn)分別于用藥后第7天，第14天和第21天進(jìn)行，訓(xùn)練時(shí)將大鼠從長(zhǎng)臂端尾對(duì)叉口輕輕放入水中，以其在15s內(nèi)直接抵達(dá)平臺(tái)為正確反應(yīng)，大鼠抵達(dá)平臺(tái)后休息15s再重復(fù)訓(xùn)練，每天訓(xùn)練10次，記錄其進(jìn)入盲端錯(cuò)誤次數(shù)以及平均游泳時(shí)間。1.6LPO和SOD測(cè)定取上述各組大鼠腦組織，精確稱(chēng)重，以pH

5、7.0的PBS緩沖液制成10%的勻漿液，以3000r/min離心10min，取上清測(cè)定LPO，然后用乙醇-氯仿提取勻漿液中SOD待測(cè)。LPO采用硫代巴比妥酸(TBA)法5測(cè)定組織中脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的最終產(chǎn)物丙二醛(MDA)含量。SOD采用鄰苯三酚-硝基四氮唑藍(lán)法(即Pyrogallol-NBT法)6測(cè)定。1.7統(tǒng)計(jì)方法所有資料均采用<"T4501 (861 bytes)" src="/med/cano/201003/20100324163118937" 15 12>±s表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。2結(jié)果2.1避暗試驗(yàn)結(jié)果表明用藥各

6、組大鼠在訓(xùn)練階段和復(fù)習(xí)階段進(jìn)入暗箱的潛伏期均長(zhǎng)于模型組(P0.05)，5min內(nèi)進(jìn)入暗箱錯(cuò)誤次數(shù)亦顯著低于模型組(P0.01)，其中中藥大劑量組2個(gè)項(xiàng)目均優(yōu)于中藥小劑量和西藥組(P0.05)，提示中藥復(fù)正膠囊有較好的改善學(xué)習(xí)記憶力的作用。結(jié)果見(jiàn)表1。表1藥物對(duì)擬癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶力的影響(避暗試驗(yàn))<"T4501 (861 bytes)" src="/med/cano/201003/20100324163118937" 15 12>±s組別動(dòng)物數(shù)訓(xùn)練階段復(fù)習(xí)階段潛伏期(s)5min錯(cuò)誤次數(shù)潛伏期(s)5min錯(cuò)誤次數(shù)空白組10178.

7、56±20.502.13±0.64201.30±19.540.90±0.35假手術(shù)組10143.67±18.782.98±0.71197.67±18.301.02±0.64模型組887.56±18.377.89±1.20105.72±15.876.73±0.72西藥組9138.34±20.324.93±1.07152.63±16.204.05±0.34中藥大劑量組9183.54±18.713.15±0.86221.5

8、0±20.702.17±0.20中藥小劑量組8127.98±13.675.27±0.97149.67±18.984.56±0.18     注：治療期間大鼠死亡數(shù)6只。與模型組比較：潛伏期P0.05，5min錯(cuò)誤次數(shù)P0.01，分別與西藥組和中藥小劑量組比 較：P0.05 2.2水迷宮試驗(yàn)結(jié)果表明用藥各組大鼠游迷宮所需時(shí)間及進(jìn)入盲端錯(cuò)誤次數(shù)均低于模型組，于第7天進(jìn)入盲端錯(cuò)誤次數(shù)比較僅中藥大劑量組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)，其余2組則無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；所需時(shí)間3組均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.0

9、5)。于第14天西藥組2項(xiàng)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)，而中藥大、小劑量組則顯著低于模型組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01和P0.05)。于第21天3組2項(xiàng)均顯著低于模型組且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01和P0.05)，其中中藥大劑量組優(yōu)于西藥組和中藥小劑量組(P0.05)。同樣提示復(fù)正膠囊有提高學(xué)習(xí)記憶力的作用。結(jié)果分別見(jiàn)表2和表3。表2藥物對(duì)擬癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶力的影響(游迷宮所需時(shí)間S)<"T4501 (861 bytes)" src="/med/cano/201003/20100324163118937" 15 12>±s組別動(dòng)物數(shù)第7天

10、第14天第21天空白組1020.50±3.2719.87±2.8318.00±2.78假手術(shù)組1023.17±3.1821.56±4.0719.78±2.34模型組867.53±7.8053.64±6.8751.67±3.56西藥組947.64±6.2143.67±5.8035.27±1.86中藥大劑量組945.72±3.2437.80±2.7021.68±3.70中藥小劑量組849.87±3.6740.56±3.9032.1

11、2±2.13     注：與模型組比較：P0.01P0.05；與西藥組和中藥小劑量組比較：P0.05 表3藥物對(duì)擬癡呆大鼠學(xué)習(xí)記憶力影響(游迷宮錯(cuò)誤次數(shù))<"T4501 (861 bytes)" src="/med/cano/201003/20100324163118937" 15 12>±s組別動(dòng)物數(shù)第7天第14天第21天空白組100.98±0.370.87±0.270.70±0.23假手術(shù)組101.27±1.021.15±1.02

12、0.99±0.63模型組86.57±1.286.07±1.205.33±1.07西藥組95.48±1.285.27±0.973.87±1.03中藥大劑量組93.87±0.983.56±1.271.83±0.46中藥小劑量組84.68±1.704.06±0.873.40±0.87     注：與模型組比較：P0.01P0.05；與西藥組及中藥小劑量組比較：P0.052.3LPO和SOD結(jié)果見(jiàn)表4。 表4藥物對(duì)擬癡呆大鼠腦組織LP

13、O和SOD的影響(<"T4501 (861 bytes)" src="/med/cano/201003/20100324163118937" 15 12>±s)組別動(dòng)物數(shù)LPO(mol/g.wt)SOD(/mg.pr)空白組10256.78±11.877.58±1.04假手術(shù)組10278.63±11.306.98±1.02模型組8397.27±15.604.01±1.11西藥組9368.97±13.475.89±0.98中藥大劑量組9263.56

14、7;11.076.07±1.33中藥小劑量組8345.62±12.384.99±1.04     注：與造模組比較：P0.01，P0.05由表4可知，行為學(xué)障礙大鼠腦內(nèi)LPO水平升高，而SOD含量降低，與空白組比較有非常顯著性差異(P0.01)，表明造模后腦內(nèi)自由基水平升高，經(jīng)用藥后各組均得到不同程度的改善，而中藥大劑量組則較明顯，與模型組比較有非常顯著性差異(P0.01)，中藥小劑量組則稍差，與模型組比較仍有顯著性差異(P0.05)，西藥組LPO雖有一定降低，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)，SOD含量升高與模型組比較有顯著性

15、差異(P0.05)。 3討論腦血管性癡呆是由于腦血管疾病造成腦部缺血導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷、死亡而引起，如果缺血復(fù)灌注后損傷可進(jìn)一步加重其發(fā)生的可能，臨床上主要發(fā)生于多次腦梗死，故又可稱(chēng)為多發(fā)腦梗死性癡呆(multi-infarct dementia MID)。目前尚無(wú)成熟的血管性癡呆動(dòng)物模型，但通過(guò)腦缺血復(fù)灌注致行為學(xué)障礙動(dòng)物，基本符合血管性癡呆發(fā)病過(guò)程，有相似的病理改變，是研究血管性癡呆的必要手段。本文實(shí)驗(yàn)表明，腦缺血復(fù)灌注致行為學(xué)障礙大鼠學(xué)習(xí)記憶力明顯下降，腦內(nèi)LPO升高，SOD下降，與空白組比較均有非常顯著性差異(P0.01)，經(jīng)過(guò)治療后，各項(xiàng)指標(biāo)均得到不同程度的改善，提示復(fù)正膠囊具有顯著地

16、改善學(xué)習(xí)記憶力的作用，同時(shí)有降低自由基損害的作用。對(duì)于腦血管性癡呆的發(fā)病機(jī)理目前尚未徹底闡明，主要認(rèn)為與腦缺血后神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)肽的改變、興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性作用、細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載、自由基損害等有關(guān)7。自由基對(duì)智能的損害主要由于自由基對(duì)細(xì)胞及細(xì)胞膜上不飽和脂肪酸的破壞和過(guò)氧化及MDA產(chǎn)生。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，實(shí)驗(yàn)性腦缺血?jiǎng)游锏膶W(xué)習(xí)記憶下降，腦血流減少，腦內(nèi)葡萄糖利用率下降，ATP生成減少，乳酸含量增加，腦組織中脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物(如MDA)含量增加，MDA是自由基對(duì)生物細(xì)胞膜損傷的主要代謝產(chǎn)物，它能交鏈蛋白質(zhì)、脂類(lèi)、核酸及糖類(lèi)，致使生物膜變性和破壞，由于DNA發(fā)生突變，交鏈等影響了信息傳遞、轉(zhuǎn)錄和復(fù)制

17、，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成能力下降或合成蛋白質(zhì)功能紊亂，從而表現(xiàn)出記憶力和智力下降。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，復(fù)正膠囊有提高SOD活力、降低LPO水平，提示其改善學(xué)習(xí)記憶的治療作用可能是通過(guò)減輕自由基的損害而實(shí)現(xiàn)。作者單位：黃立武藍(lán)青強(qiáng)廣西中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院(南寧市園湖路2號(hào)530023)張茂林湖北中醫(yī)學(xué)院(武漢武昌云架橋110號(hào)430061)參考文獻(xiàn)1 黃立武，藍(lán)青強(qiáng)，董少龍.復(fù)正膠囊治療多發(fā)腦梗死性癡呆的臨床觀察.廣西中醫(yī)藥.1999，22(5)：142 朱愉，多秀瀛.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的疾病模型.天津：天津科技翻譯出版公司，1997.3003 王晉源，陳會(huì)友，鄭清蓮.中藥復(fù)方治療血管性癡呆的實(shí)驗(yàn)研究.現(xiàn)代中藥.1998，(2)：314 陳奇.中藥藥理實(shí)驗(yàn)方法.北京：人民衛(wèi)生出版社出版，1994.1985 Rurgby J. Lipid Peroaidatio