豬高熱病細(xì)菌性病原的分離鑒定及其生物學(xué)特性研究

1、豬高熱病細(xì)菌性病原的分離鑒定及其生物學(xué)特性研究    英文題名 Isolation, Identification and Biological Characterization of Bacterial Pathogen in Outbreak of Swie High Fever Disease  關(guān)鍵詞 副豬嗜血桿菌; 多殺性巴氏桿菌; 豬胸膜放線桿菌; 豬鏈球菌; 復(fù)合PCR; 英文關(guān)鍵詞 Haemophilus parasuis; Pasteurella multocida; Actinobacillus pleuropneumoni

2、ae; Streptococcus suis; multiplex PCR; 中文摘要 豬“高熱病”是由多種病原混合感染引起的綜合征,針對安徽地區(qū)豬群中廣泛流行的多病因“高熱病”進(jìn)行細(xì)菌性病原的研究對“高熱病”的防治具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。 副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis,HPS)、多殺性巴氏桿菌(Pasteurella multocida,Pm)、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)形態(tài)學(xué)、生長特性相似,臨床感染難以區(qū)分,本研究根據(jù)HPS、Pm、APP的特異性序列,成功建立了復(fù)合PCR方法的快速診斷方法,該方法特異性好

3、,可以檢測出HPS、Pm、APP最低量分別為60pg、120pg和50 pg的DNA,極大的提高了三種細(xì)菌的鑒定速度和效率,同時(shí)將該方法應(yīng)用于病死豬的病料檢測,結(jié)果顯示該方法可用于HPS、Pm、APP的臨床監(jiān)測。 利用常規(guī)細(xì)菌分離鑒定結(jié)合建立的復(fù)合PCR方法,從安徽肥東、肥西、淮北、桐城、阜陽、宿州、六安、廬江、宣城、舒城十個(gè)地區(qū)的具有高熱及呼吸系統(tǒng)癥狀的146頭發(fā)病或死亡豬中分離細(xì)菌67株,分離率為45.89%,其中SS 20株,HPS 12株,Pm 16株,APP 2株,分離率分別為29. 英文摘要 Swine "high fever disease" was caus

4、ed by multiple infection with kinds of pathogens, secondary infection of bacteria usually exacerbates the severity of the disease. So, isolation and identification of bacteria from pigs with“high fever disease”will are favorable for developing effective measure of prevention and control for "hi

5、gh fever disease". A multiplex PCR technology was developed for PCR detection of HPS、Pm、APP with sensitivity of the minimum DNA amount of 60pg、120pg and 50pg. Results demostrated 中文摘要 4-5 Abstract 5 插圖和附表清單 8-10 主要符號(hào)列表 10-11 文獻(xiàn)綜述 11-23 1 引言 23-24 2 材料與方法 24-35     2.1 材料 24-26 &#

6、160;       2.1.1 病料來源 24         2.1.2 參考菌株 24         2.1.3 主要培養(yǎng)基 24         2.1.4 主要試劑與溶液配制 24-25         2.1.5 細(xì)菌微量生化反應(yīng)管 25

7、60;       2.1.6 抗生素藥敏試驗(yàn)紙片 25-26         2.1.7 引物設(shè)計(jì) 26         2.1.8 主要儀器 26     2.2 細(xì)菌的分離培養(yǎng)與生化鑒定 26-27         2.2.1 培養(yǎng)基的制備 26-27    &#

8、160;    2.2.2 細(xì)菌的分離培養(yǎng) 27         2.2.3 生化試驗(yàn)鑒定 27     2.3 HPS、Pm、APP 復(fù)合PCR 方法的建立與應(yīng)用 27-28         2.3.1 細(xì)菌DNA 的提取 27         2.3.2 病料中細(xì)菌DNA 提取 27    &#

9、160;    2.3.3 PCR 擴(kuò)增 27-28         2.3.4 復(fù)合PCR 反應(yīng)條件優(yōu)化方案 28         2.3.5 PCR 產(chǎn)物分析 28         2.3.6 復(fù)合PCR 的特異性測定 28         2.3.7 復(fù)合PCR 的敏感性 28 &#

10、160;       2.3.8 復(fù)合PCR 的臨床應(yīng)用 28     2.4 A 型Pm 的鑒定 28-29         2.4.1 DNA 模板的制備 28-29         2.4.2 A 型Pm 的PCR 鑒定 29     2.5 SS2 的PCR 鑒定 29-30     2.6 分離株H

11、PS 部分生物學(xué)特性研究 30-31         2.6.1 HPS 形態(tài)多樣性 30         2.6.2 HPS 衛(wèi)星現(xiàn)象 30         2.6.3 HPS 生長曲線的測定 30         2.6.4 HPS 16srRNA 序列測定與分析 30-31    &

12、#160;    2.6.5 HPS 動(dòng)物感染試驗(yàn) 31     2.7 副豬嗜血桿菌tbpA RFLP 型與序列分析 31-34         2.7.1 tbpA 的擴(kuò)增 31-32         2.7.2 tbpA-RFLP 型鑒定 32         2.7.3 tbpA 基因的克隆與分析 32-34  

13、;           2.7.3.1 PCR 產(chǎn)物的連接 32-33             2.7.3.2 E.coli DH5感受態(tài)細(xì)胞的制備 33             2.7.3.3 轉(zhuǎn)化E.coli DH5感受態(tài)細(xì)胞 33    

14、60;        2.7.3.4 重組質(zhì)粒的提取及鑒定 33-34             2.7.3.5 重組質(zhì)粒的PCR 鑒定 34             2.7.3.6 基因序列測定與分析 34     2.8 HPS、Pm、APP、SS 藥物敏感試驗(yàn) 34-35 3

15、 結(jié)果 35-53     3.1 HPS、Pm、APP、SS 的分離培養(yǎng)與生化鑒定 35-39         3.1.1 HPS 的分離培養(yǎng)與生化鑒定 35-36         3.1.2 Pm 的分離培養(yǎng)與生化鑒定 36-37         3.1.3 APP 的分離培養(yǎng)與生化鑒定 37-38     

16、60;   3.1.4 鏈球菌的分離培養(yǎng)與生化鑒定 38-39     3.2 HPS、Pm、APP 復(fù)合PCR 方法的建立與應(yīng)用 39-42         3.2.1 HPS、Pm、APP 復(fù)合PCR 體系的優(yōu)化 39-40         3.2.2 復(fù)合PCR 方法的特異性 40-41         3.2.3 復(fù)合PCR 的敏

17、感性 41         3.2.4 復(fù)合PCR 的臨床應(yīng)用 41-42     3.3 A 型Pm 的PCR 鑒定結(jié)果 42     3.4 SS2 的PCR 鑒定結(jié)果 42     3.5 分離株HPS 部分生物學(xué)特性研究 42-47         3.5.1 HPS 多形態(tài)性觀察 42-43      

18、60;  3.5.2 HPS 衛(wèi)星現(xiàn)象 43         3.5.3 HPS 生長曲線 43-44         3.5.4 HPS 分離株16srRNA 序列擴(kuò)增與測定 44-45         3.5.5 HPS 動(dòng)物感染試驗(yàn) 45-47     3.6 HPS tbpA PCR-RFLP 分型與tbpA 序列分析 47-50 

19、0;       3.6.1 分離菌tbpA 的擴(kuò)增 47         3.6.2 tbp A 的RFLP 分型 47-49         3.6.3 HPS tbpA 基因序列分析 49-50     3.7 HPS、Pm、APP、SS 的藥物敏感試驗(yàn) 50-53 4 討論與分析 53-58     4.1 復(fù)合PCR 快速檢測H

20、PS、Pm、APP 感染的臨床意義 53     4.2 安徽省部分地區(qū)豬“高熱病”中細(xì)菌感染情況及其優(yōu)勢血清型/基因型 53-54     4.3 HPS 致病力的影響因素 54-56     4.4 HPS、Pm、APP、SS 分離株藥物感受性 56-58 結(jié)論 58-59 參考文獻(xiàn) 59-66 致謝 66-67 附錄 67-73         3.6.1 分離菌tbpA 的擴(kuò)增 47    

21、0;    3.6.2 tbp A 的RFLP 分型 47-49         3.6.3 HPS tbpA 基因序列分析 49-50     3.7 HPS、Pm、APP、SS 的藥物敏感試驗(yàn) 50-53 4 討論與分析 53-58     4.1 復(fù)合PCR 快速檢測HPS、Pm、APP 感染的臨床意義 53     4.2 安徽省部分地區(qū)豬“高熱病”中細(xì)菌感染情況及其優(yōu)勢血清型/基因型 53-54

22、    4.3 HPS 致病力的影響因素 54-56     4.4 HPS、Pm、APP、SS 分離株藥物感受性 56-58 結(jié)論 58-59 參考文獻(xiàn) 59-66 致謝 66-67 附錄 67-73         3.6.1 分離菌tbpA 的擴(kuò)增 47         3.6.2 tbp A 的RFLP 分型 47-49      

23、0;  3.6.3 HPS tbpA 基因序列分析 49-50     3.7 HPS、Pm、APP、SS 的藥物敏感試驗(yàn) 50-53 4 討論與分析 53-58     4.1 復(fù)合PCR 快速檢測HPS、Pm、APP 感染的臨床意義 53     4.2 安徽省部分地區(qū)豬“高熱病”中細(xì)菌感染情況及其優(yōu)勢血清型/基因型 53-54     4.3 HPS 致病力的影響因素 54-56     4.4 HPS、Pm、APP、SS 分離株藥物感受性 56-58 結(jié)論 58-59 參考文獻(xiàn) 59-66 致謝 66-67 附錄 67-73         3.6.1 分離菌tbpA 的擴(kuò)增 47         3.6.2 tbp A 的RFLP 分型 47-49         3.6.3 HPS tbpA 基因序列分析 49-50     3.7 HPS、Pm、APP