蛋白質(zhì)聚焦層析

1、L/O/G/O整理ppt1蛋白質(zhì)聚焦層析蛋白質(zhì)聚焦層析馬力馬力任重任重王聰王聰整理ppt2定義定義聚焦層析是一種操作簡單、廉價(jià)的聚焦層析是一種操作簡單、廉價(jià)的柱層析柱層析技技術(shù)術(shù)其流動(dòng)相為其流動(dòng)相為多緩沖多緩沖液液，固定相為，固定相為多緩沖交換多緩沖交換劑劑利用層析過程中固定相偶聯(lián)的利用層析過程中固定相偶聯(lián)的具有兩性解離具有兩性解離功能的有機(jī)分子功能的有機(jī)分子為配基，與流動(dòng)相中某些為配基，與流動(dòng)相中某些兩兩性物質(zhì)性物質(zhì)發(fā)生發(fā)生等等電電聚焦反應(yīng)聚焦反應(yīng)而進(jìn)行的一種分離而進(jìn)行的一種分離方法方法整理ppt3等電聚焦等電聚焦 聚焦層析聚焦層析柱層析柱層析發(fā)展發(fā)展整理ppt4優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)有聚焦作用，蛋白峰尖

2、、帶狹，帶寬度為有聚焦作用，蛋白峰尖、帶狹，帶寬度為0.040.05pH0.040.05pH單位單位在柱內(nèi)自動(dòng)形成在柱內(nèi)自動(dòng)形成pHpH梯度，不需要梯度，不需要pHpH梯度裝置梯度裝置 操作方便操作方便 分辨率高分辨率高4123近年來，由瑞典近年來，由瑞典Pharmacia公司設(shè)計(jì)了公司設(shè)計(jì)了一種新的分離技術(shù)，叫做聚焦層析一種新的分離技術(shù)，叫做聚焦層析(Chromatofocusing) ，其產(chǎn)品已經(jīng)實(shí)現(xiàn)量產(chǎn)以及商業(yè)化其產(chǎn)品已經(jīng)實(shí)現(xiàn)量產(chǎn)以及商業(yè)化其優(yōu)點(diǎn)如下：其優(yōu)點(diǎn)如下：整理ppt5關(guān)鍵技術(shù)關(guān)鍵技術(shù)多緩沖液多緩沖液 多緩沖液離多緩沖液離子交換樹脂子交換樹脂 兩種材料分別作為流動(dòng)相兩種材料分別作為

3、流動(dòng)相以及固定相以及固定相發(fā)展了兩發(fā)展了兩類新材料類新材料整理ppt6多緩沖液多緩沖液(Polybuffer) 屬于屬于兩性電解質(zhì)兩性電解質(zhì)一類的緩沖液一類的緩沖液含有多種緩沖液含有多種緩沖液用用NaOH滴定的滴定曲線近似平滑的直線滴定的滴定曲線近似平滑的直線該公司有該公司有Polyboffer96和和Polybuffer74兩種兩種產(chǎn)品，即分別代表緩沖力范圍為產(chǎn)品，即分別代表緩沖力范圍為pH9-6和和pH7-整理ppt7多緩沖液離子交換樹脂多緩沖液離子交換樹脂(polybufferexehangers) 帶有堿性緩沖基團(tuán)的帶有堿性緩沖基團(tuán)的陰離子交換樹脂陰離子交換樹脂把帶電基團(tuán)通過醚鍵與把帶

4、電基團(tuán)通過醚鍵與Sepharose 6B的單的單糖連接的糖連接的也有兩種產(chǎn)品：也有兩種產(chǎn)品：PBE94、PBE118應(yīng)用范圍應(yīng)用范圍分別是分別是pH9-4和和pH11-8但后者要與兩性電解質(zhì)但后者要與兩性電解質(zhì)Pharmalyte（pH8-10.5）聯(lián)合使用聯(lián)合使用 整理ppt8原理原理PH梯度溶梯度溶液的形成液的形成 蛋白質(zhì)的行蛋白質(zhì)的行為為 聚焦效應(yīng)聚焦效應(yīng) 整理ppt9pH梯度溶液的形成梯度溶液的形成 聚焦層析介質(zhì)上偶聯(lián)的聚焦層析介質(zhì)上偶聯(lián)的多氨基多羧基的有多氨基多羧基的有機(jī)分子機(jī)分子，具有相應(yīng)的酸性和堿性離子交換基，具有相應(yīng)的酸性和堿性離子交換基團(tuán)團(tuán)這些基團(tuán)本身所帶的正負(fù)電荷與這些基團(tuán)

5、本身所帶的正負(fù)電荷與緩沖液中緩沖液中的氫離子和氫氧根離子的氫離子和氫氧根離子作用而形成的作用而形成的pH梯度梯度在層析過程中能與溶液中某些陰離子或陽離在層析過程中能與溶液中某些陰離子或陽離子發(fā)生聚焦反應(yīng)，聚焦在不同區(qū)域，使物質(zhì)子發(fā)生聚焦反應(yīng)，聚焦在不同區(qū)域，使物質(zhì)得到分離。得到分離。 整理ppt10pH梯度溶液的形成梯度溶液的形成 例如，當(dāng)柱中裝陰離子交換劑例如，當(dāng)柱中裝陰離子交換劑PBE94（作固（作固定相）時(shí)，先用定相）時(shí)，先用起始緩沖液起始緩沖液平衡到平衡到pH9，再用含再用含pH6的多緩沖劑物質(zhì)（作流動(dòng)相）的的多緩沖劑物質(zhì)（作流動(dòng)相）的淋洗液通過柱體淋洗液通過柱體這時(shí)多緩沖劑中酸性最強(qiáng)

6、的組分與堿性陰離這時(shí)多緩沖劑中酸性最強(qiáng)的組分與堿性陰離子交換對結(jié)合發(fā)生中和作用子交換對結(jié)合發(fā)生中和作用隨著淋洗液的不斷加人，柱內(nèi)每點(diǎn)的隨著淋洗液的不斷加人，柱內(nèi)每點(diǎn)的pH值從值從高到低逐漸下降高到低逐漸下降照此處理一段時(shí)間，從層析柱頂部到底部就照此處理一段時(shí)間，從層析柱頂部到底部就形成了形成了pH6-9的梯度。的梯度。整理ppt11pH梯度溶液的形成梯度溶液的形成 但是隨著淋洗的進(jìn)行，但是隨著淋洗的進(jìn)行，pH梯度會逐漸梯度會逐漸向下遷移，從向下遷移，從底部流出液底部流出液的的pH卻由卻由9逐逐漸降至漸降至6，并最后恒定于此值，這時(shí)層，并最后恒定于此值，這時(shí)層析柱的析柱的pH梯度也就消失了梯度也

7、就消失了整理ppt12蛋白質(zhì)的行為蛋白質(zhì)的行為蛋白質(zhì)所帶電荷取決于它的等電點(diǎn)（蛋白質(zhì)所帶電荷取決于它的等電點(diǎn)（pI）和）和層析柱中的層析柱中的pH值值當(dāng)柱中的當(dāng)柱中的pH低于蛋白質(zhì)的低于蛋白質(zhì)的pI時(shí)，蛋白質(zhì)帶時(shí)，蛋白質(zhì)帶正正電荷電荷，且不與陰離于交換劑結(jié)合。而隨著洗，且不與陰離于交換劑結(jié)合。而隨著洗脫劑向前移動(dòng)，固定相中的脫劑向前移動(dòng)，固定相中的pH值是隨著淋洗值是隨著淋洗時(shí)間延長而變化的時(shí)間延長而變化的當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)移動(dòng)至環(huán)境當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)移動(dòng)至環(huán)境pH高于其高于其pI時(shí)，蛋白質(zhì)時(shí)，蛋白質(zhì)由帶由帶正電荷變?yōu)閹ж?fù)電荷正電荷變?yōu)閹ж?fù)電荷，并與陰離子交，并與陰離子交換劑結(jié)合換劑結(jié)合 整理ppt13蛋白質(zhì)的行

8、為蛋白質(zhì)的行為由于洗脫劑的通過，蛋白質(zhì)周圍的環(huán)境由于洗脫劑的通過，蛋白質(zhì)周圍的環(huán)境pH 再次低于再次低于pI時(shí)，它又帶正電荷，并從交換劑時(shí)，它又帶正電荷，并從交換劑解吸下來解吸下來隨著洗脫液向柱底的遷移，隨著洗脫液向柱底的遷移，上述過程將反復(fù)上述過程將反復(fù)進(jìn)行進(jìn)行，于是各種蛋白質(zhì)就在各自的等電點(diǎn)被，于是各種蛋白質(zhì)就在各自的等電點(diǎn)被洗下來，從而達(dá)到了分離的目的洗下來，從而達(dá)到了分離的目的不同蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，它們在被離不同蛋白質(zhì)具有不同的等電點(diǎn)，它們在被離子交換劑結(jié)合以前，移動(dòng)之距離是不同的，子交換劑結(jié)合以前，移動(dòng)之距離是不同的，洗脫出來的洗脫出來的先后次序是按等電點(diǎn)排列的先后次序是按等電

9、點(diǎn)排列的整理整理ppt15聚焦效應(yīng)聚焦效應(yīng)蛋白質(zhì)按其等電點(diǎn)在蛋白質(zhì)按其等電點(diǎn)在pH梯度環(huán)境中進(jìn)行排列梯度環(huán)境中進(jìn)行排列的過程叫做的過程叫做聚焦效應(yīng)聚焦效應(yīng)pH梯度的形成是聚焦效應(yīng)的梯度的形成是聚焦效應(yīng)的先決條件先決條件如果一種蛋白質(zhì)是加到已形成如果一種蛋白質(zhì)是加到已形成pH梯度的層析梯度的層析柱上時(shí)，由于洗脫液的連續(xù)流動(dòng)，它將迅速柱上時(shí)，由于洗脫液的連續(xù)流動(dòng)，它將迅速地遷移到與它等電點(diǎn)相同的地遷移到與它等電點(diǎn)相同的pH處處從此位置開始，其蛋白質(zhì)將以緩慢的速度進(jìn)從此位置開始，其蛋白質(zhì)將以緩慢的速度進(jìn)行吸附、解吸附，直到在等電點(diǎn)行吸附、解吸附，直到在等電點(diǎn)pH時(shí)被洗出時(shí)被洗出 整理ppt16聚焦效

10、應(yīng)聚焦效應(yīng)若在此蛋白質(zhì)樣品被洗出前，再加人第二份若在此蛋白質(zhì)樣品被洗出前，再加人第二份同種同種蛋白質(zhì)樣品時(shí)，后者將在洗脫液的作用蛋白質(zhì)樣品時(shí)，后者將在洗脫液的作用下以下以同樣的速度同樣的速度向前移動(dòng)，而向前移動(dòng)，而不被固定相吸不被固定相吸附附，直到其遷移至近似本身等電點(diǎn)的環(huán)境處，直到其遷移至近似本身等電點(diǎn)的環(huán)境處（即第一個(gè)樣品的緩慢遷移處）（即第一個(gè)樣品的緩慢遷移處）然后兩份樣品以同樣的速度遷移，最后然后兩份樣品以同樣的速度遷移，最后同時(shí)同時(shí)從柱底洗出從柱底洗出整理ppt17聚焦層析的介質(zhì)聚焦層析的介質(zhì)大多數(shù)都是以大多數(shù)都是以交聯(lián)的瓊脂糖凝膠交聯(lián)的瓊脂糖凝膠為載體，通為載體，通過過共價(jià)鍵結(jié)合共

11、價(jià)鍵結(jié)合將將多氨基多羧基化合物多氨基多羧基化合物偶聯(lián)到偶聯(lián)到瓊脂糖凝膠載體上瓊脂糖凝膠載體上目前用的較多的層析介質(zhì)是多聚緩沖液交換目前用的較多的層析介質(zhì)是多聚緩沖液交換劑（固定相）劑（固定相）PBE118， PBE94，前者屬于，前者屬于偏堿性層析介質(zhì)（偏堿性層析介質(zhì)（ pH 8-11），后者屬于中），后者屬于中性層析介質(zhì)（性層析介質(zhì)（ pH4-9）常用多緩沖劑（流動(dòng)相）有常用多緩沖劑（流動(dòng)相）有Polybuffer96和和Polybuffer74（分別在分別在pH6-9和和pH7-4范圍范圍內(nèi)有較強(qiáng)緩沖能力內(nèi)有較強(qiáng)緩沖能力如將他們混合在一起，則較強(qiáng)緩沖能力的如將他們混合在一起，則較強(qiáng)緩沖能力

12、的pH范圍為范圍為4-整理ppt18緩沖液和交換樹脂的選擇緩沖液和交換樹脂的選擇 緩沖液和多緩沖液交換樹脂每次最大操作范緩沖液和多緩沖液交換樹脂每次最大操作范圍是圍是3pH單位單位 若是樣品的若是樣品的pl是已知的，只要選擇對應(yīng)的是已知的，只要選擇對應(yīng)的pH緩沖液和樹脂即可，最好洗脫位置在緩沖液和樹脂即可，最好洗脫位置在pH梯度梯度的的1/3-1/2以后以后 若是未知樣品，應(yīng)先定出若是未知樣品，應(yīng)先定出pl值。也可用公司值。也可用公司配套提供的聚焦層析試劑箱測定配套提供的聚焦層析試劑箱測定pI 一旦決定了一旦決定了pl，就可選擇了，就可選擇了整理ppt19緩沖液和交換樹脂的選擇緩沖液和交換樹脂

13、的選擇 交換樹脂量的選擇是取決于樣品數(shù)量，樣品交換樹脂量的選擇是取決于樣品數(shù)量，樣品性質(zhì)和雜質(zhì)多少等，一般性質(zhì)和雜質(zhì)多少等，一般2030毫升床體積毫升床體積可分離可分離1-200毫克蛋白毫克蛋白/pH單位單位整理ppt20操作操作 先將懸浮的多緩沖液交換樹脂裝柱。要求無先將懸浮的多緩沖液交換樹脂裝柱。要求無氣泡氣泡(可先脫氣可先脫氣) 用一個(gè)用一個(gè)高于多緩沖液高于多緩沖液pH的起始緩沖液平衡柱的起始緩沖液平衡柱子。當(dāng)流出液子。當(dāng)流出液pH與起始緩沖液與起始緩沖液pH相同即可相同即可上樣上樣 樣品溶在所選擇的多緩沖液中，再用同樣的樣品溶在所選擇的多緩沖液中，再用同樣的多緩沖液洗脫。這祥各種蛋白多

14、緩沖液洗脫。這祥各種蛋白在自己的在自己的pl處處聚焦聚焦，并依次洗脫下來，分部收集，并依次洗脫下來，分部收集整理ppt21操作操作 操作流程：操作流程： 聚焦層析柱聚焦層析柱 起始緩沖液平衡起始緩沖液平衡 樣液樣液上樣上樣 多緩沖液淋洗多緩沖液淋洗 洗脫液解吸附洗脫液解吸附整理ppt22注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 樣品的基本性質(zhì)樣品的基本性質(zhì) 在聚焦層析前，樣品最好能提供一些必要在聚焦層析前，樣品最好能提供一些必要的參數(shù)，如：的參數(shù)，如：等電點(diǎn)、溶解度、穩(wěn)定性等電點(diǎn)、溶解度、穩(wěn)定性等等 樣品制備要求樣品制備要求 樣品中不能含有樣品中不能含有鹽或強(qiáng)離子型鹽或強(qiáng)離子型有機(jī)化合物，有機(jī)化合物，鹽類等強(qiáng)電解質(zhì)物

15、質(zhì)會鹽類等強(qiáng)電解質(zhì)物質(zhì)會影響聚焦效應(yīng)影響聚焦效應(yīng)整理ppt23蛋白質(zhì)與多緩沖液的分離蛋白質(zhì)與多緩沖液的分離 一般多緩沖液不干擾酶的測活或氨基酸分析一般多緩沖液不干擾酶的測活或氨基酸分析 雖然多緩沖液不影響雖然多緩沖液不影響考馬斯考馬斯亮亮蘭反應(yīng)蘭反應(yīng)，但與，但與銅離子會形成復(fù)合物，所以干擾銅離子會形成復(fù)合物，所以干擾Lowry反應(yīng)反應(yīng) 如用如用Lowry反應(yīng)測蛋白有必要將蛋白與多緩反應(yīng)測蛋白有必要將蛋白與多緩沖液分開。這時(shí)用沖液分開。這時(shí)用硫酸銨沉淀法，凝膠過濾硫酸銨沉淀法，凝膠過濾法或親和層析法法或親和層析法等都可以將蛋白與多緩沖液等都可以將蛋白與多緩沖液分開。分開。整理ppt24再生再生

16、多緩沖液交換樹脂的再生很容易，只要用多緩沖液交換樹脂的再生很容易，只要用2-3倍床體積的倍床體積的1MNaCl在柱內(nèi)洗滌就行了在柱內(nèi)洗滌就行了 如 果 有 強(qiáng) 結(jié) 合 力 的 蛋 白 未 除 去 ， 可 用如 果 有 強(qiáng) 結(jié) 合 力 的 蛋 白 未 除 去 ， 可 用0.1MHCI洗滌，但要立刻用高洗滌，但要立刻用高pH溶液洗去溶液洗去HCI，再用所選擇的起始緩沖液平衡后，即，再用所選擇的起始緩沖液平衡后，即可使用可使用 整理ppt25應(yīng)用簡介應(yīng)用簡介聚焦層析最適合于分離某些蛋白質(zhì)聚焦層析最適合于分離某些蛋白質(zhì)分子量和極性方面的性分子量和極性方面的性質(zhì)十分相似，而等電點(diǎn)有區(qū)別質(zhì)十分相似，而等電

17、點(diǎn)有區(qū)別的物質(zhì)。尤其對用其他的層的物質(zhì)。尤其對用其他的層析方法難以分離的混合物，采用此法可得到較好的效果析方法難以分離的混合物，采用此法可得到較好的效果整理ppt26人血清載脂蛋白人血清載脂蛋白C亞型的分離亞型的分離 華西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院方定志等利用此方華西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院方定志等利用此方法分離了人血清載脂蛋白法分離了人血清載脂蛋白C亞型亞型 他們用密度梯度超速離心法他們用密度梯度超速離心法,從混合人血清中從混合人血清中分離極低密度脂蛋白，經(jīng)脫脂后再進(jìn)行聚焦分離極低密度脂蛋白，經(jīng)脫脂后再進(jìn)行聚焦層析分離其中的載脂蛋白。獲得的純品載脂層析分離其中的載脂蛋白。獲得的純品載脂蛋白蛋白C1和和C2

18、經(jīng)等電聚焦電泳均呈現(xiàn)一經(jīng)等電聚焦電泳均呈現(xiàn)一條帶條帶整理ppt27具體操作具體操作 將將 1 0 0 m l P B E 9 4 混 懸 于混 懸 于 1 0 0 m l 平 衡 緩 沖 液平 衡 緩 沖 液(25mmol/L咪唑咪唑,7.2mol/L尿素尿素,1mmol/L Na2EDTA,pH7.4)裝入裝入1.5cm75cm層析柱層析柱 于于4用用10倍床體積平衡緩沖液平衡后倍床體積平衡緩沖液平衡后,用溶解的用溶解的apoVLDL(含蛋白含蛋白4550mg)上柱上柱 然 后 于然 后 于 4 用用 1 0 0 0 m l 洗 脫 緩 沖 液洗 脫 緩 沖 液(polybuffer74 8

19、mol/L尿素為尿素為1 8，pH4.0)洗脫洗脫,形成形成pH梯度梯度 洗脫速度為洗脫速度為2025ml/min，每管，每管2.53.0ml分部收集分部收集 測定各管測定各管280nm紫外光吸收值紫外光吸收值,收集各蛋白峰收集各蛋白峰 經(jīng)經(jīng)HTP柱層析除去柱層析除去polybuffer，最后對標(biāo)準(zhǔn)透析緩，最后對標(biāo)準(zhǔn)透析緩沖液沖液( 20mmol/L Tris-HCl, 0.85% NaCl, 0.01%Na2EDTA,0.01% NaN3,pH7.4)于于4透析透析 整理ppt28洗脫曲線洗脫曲線整理ppt29昆蟲谷胱甘肽昆蟲谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶的分離轉(zhuǎn)移酶的分離 北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的周先碗在分離純化北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的周先碗在分離純化昆蟲谷胱甘肽昆蟲谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶過程中也用到了聚焦轉(zhuǎn)移酶過程中也用到了聚焦層析層析整理ppt30具體操作具體操作 首先將冷凍的蠟螟幼蟲在磷酸緩沖液中勻槳首先將冷凍的蠟螟幼蟲在磷酸緩沖液中勻槳,經(jīng)經(jīng)10 000 g和和100 000 g分級離心分級離心 取上清液通過取上清液通過QAE-Sephadex A-25離子交換柱層析離子交換柱層析除去部分色素和雜蛋白除去部分色素和雜蛋白 然后采用谷胱甘肽然后采用谷胱甘肽-瓊脂糖凝膠親和層析瓊脂糖凝膠親和層析(GSH-QT4),四溴酚酞二磺酸鹽四溴酚酞二磺酸鹽-瓊脂糖凝膠親和層析瓊脂糖凝膠