增強免疫力功能評價方法及修訂說明

1、附件1：增強免疫力功能評價方法（征求意見稿）保健食品評價試驗項目、試驗原則及結(jié)果判定Items,PrinciplesandResultAssessment1試驗項目動物實驗1.1.1 體重1.1.2 臟器/體重比值測定：胸腺/體重比值，脾臟/體重比值1.1.3 細胞免疫功能測定：小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗，遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)實驗1.1.4 體液免疫功能測定：抗體生成細胞檢測，血清溶血素測定1.1.5 單核巨噬細胞功能測定：小鼠碳廓清實驗，小鼠腹腔巨噬細胞吞噬熒光微球?qū)嶒?.1.6 NK細胞活性測定2 試驗原則所列的指標(biāo)均為必做項目分為正常動物實驗方案和免疫功能低下模型動物實驗兩種方案,可任選其一進行實

2、驗.采用免疫功能低下動物模型實驗方案時需做外周血白細胞總數(shù)測定3 結(jié)果判定采用正常動物實驗，受試樣品具有增強免疫力作用。在細胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細胞功能及NK細胞活性四個方面測定中，任兩個方面試驗結(jié)果為陽性，可以判定該受試樣品具有增強免疫力作用。其中細胞免疫功能測定項目中兩個實驗的結(jié)果均為陽性，判定細胞免疫功能試驗結(jié)果陽性。體液免疫功能測定項目中兩個實驗的結(jié)果均為陽性，判定體液免疫功能試驗結(jié)果陽性。單核巨噬細胞功能測定項目中兩個實驗的結(jié)果均為陽性，判定單核一巨噬細胞功能試驗結(jié)果陽性。NK細胞活性測定實驗的一個以上劑量結(jié)果陽性，判定NK細胞活性結(jié)果陽性。正常動物實驗需進行四個方面

3、的測性。采用免疫功能低下動物實驗，受試樣品對免疫功能低下者具有增強免疫力作用。在免疫功能低下模型成立條件下，血液白細胞總數(shù)、細胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細胞功能及NK細胞活性五個方面測定中，任兩個方面試驗結(jié)果為陽性，判性該受試樣品對免疫功能低下者具有增強免疫力作用。其中細胞免疫功能測性項目中兩個實驗的結(jié)果均為陽性，或任一個實驗的兩個劑量組結(jié)果陽性，可判性細胞免疫功能試驗結(jié)果陽性。體液免疫功能測性項目中兩個實驗的結(jié)果均為陽性，或任一個實驗的兩個劑量組結(jié)果陽性，可判性體液免疫功能試驗結(jié)果陽性。單核巨噬細胞功能測性項目中兩個實驗的結(jié)果均為陽性，或任一個實驗的兩個劑量組結(jié)果陽性，可判性單核巨

4、噬細胞功能試驗結(jié)果陽性。NK細胞活性測定實驗的一個以上劑量結(jié)果陽性，可以判定NK細胞活性結(jié)果陽性。血液白細胞總數(shù)測性的二個以上劑量結(jié)果陽性，可以判性血液白細胞總數(shù)結(jié)果陽性。免疫功能低下模型動物實驗至少需進行三個方面的測性。同時在各項實驗中，任何一項測試都不出現(xiàn)加重免疫抑制劑作用的結(jié)果。增強免疫力功能檢驗方法MethodfortheAssessmentofEnhancingImmuneFunction1. 原理：免疫系統(tǒng)主要包括中央和外周淋巴器官、淋巴組織和全身各處的淋巴細胞、抗原呈遞細胞等，還包括血液中的白細胞。淋巴細胞經(jīng)血液和淋巴使各處的淋巴器官和淋巴組織連成一個功能整體。胸腺屬中央淋巴器官

5、，主要功能是確保T淋巴細胞的產(chǎn)生和成熟。外周淋巴器官包括血液、淋巴管和免疫活性細胞；脾臟對抗原發(fā)生免疫應(yīng)答作用，脾竇的巨噬細胞具有清除功能，脾白髓含有記憶B細胞，產(chǎn)生對T依賴抗原的體液免疫應(yīng)答。淋巴細胞是特異性免疫應(yīng)答的主要細胞群，按其表面標(biāo)志物，分為T細胞、B細胞和天然殺傷細胞（NKK三大類，T細胞又分為CD4（Th）細胞和CD8T淋巴細胞。B淋巴細胞轉(zhuǎn)化為漿細胞后能合成和釋放抗原特異抗體，所有抗體都是免疫球蛋白，但并非所有的免疫球蛋白分子都具有抗體功能。免疫系統(tǒng)可產(chǎn)生特異性免疫和非特異性免疫功能，檢測上述免疫系統(tǒng)的各種代表性指標(biāo)的改變可對增強免疫力作用的功能做出相應(yīng)判定。2. 實驗動物選擇

6、推薦用近交系小鼠，如C57BL/6J、BALB/C等，68周齡，1822g（BALB/C種可16-18g）,單一性別，雌雄均可，每組1015只。3. 劑量分組及受試樣品給予時間實驗設(shè)三個劑量組和1個陰性對照組。以人體推薦量的10倍為其中一個劑量，另設(shè)二個劑量組。必要時設(shè)陽性對照組。選做免疫低下模型法時，應(yīng)設(shè)模型對照組。受試樣品給予時間四周或30天。4免疫功能低下動物模型可選用環(huán)磷酰胺、氫化可的松或其他合適的免疫抑制劑進行藥物造模。造模原理：4.1.1 環(huán)磷酰胺主要通過DNA烷基化破壞DNA的合成而非特異性地殺傷淋巴細胞，并可抑制淋巴細胞轉(zhuǎn)化；環(huán)磷酰胺對B細胞的抑制比T細胞強，一般對體液免疫有很

7、強的抑制作用，對NK細胞的抑制作用較弱。4.1.2 氫化可的松主要通過與相應(yīng)受體結(jié)合成復(fù)合物后進入細胞核，阻礙NF-kB進入細胞核，抑制細胞因子與炎癥介質(zhì)的合成和釋放，達到免疫抑制目的。氫化可的松還可損傷漿細胞，抑制巨噬細胞對抗原的吞噬、處理、和呈遞作用，所以氫化可的松對細胞免疫、體液免疫和巨噬細胞的吞噬、NK作用都有一定的抑制作用。免疫抑制劑劑量選擇環(huán)磷酰胺可選擇40mgkg，腹腔注射，連續(xù)兩天，末次注射給藥后第5天測定各項指標(biāo)；氫化可的松可選擇40mgkg，肌內(nèi)注射，隔天一次，共5次，末次注射給藥后次日測定各項指標(biāo)。各指標(biāo)對兩種模型敏感性不同，環(huán)磷酰胺模型比較適合抗體生成細胞檢測、血清溶血

8、素測定、白細胞總數(shù)測定；氫化可的松模型比較適合遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、碳廓清實驗、腹腔巨噬細胞吞噬熒光微球?qū)嶒?、NK細胞活性測定，建議根據(jù)不同的免疫功能指標(biāo)選擇合適的模型。受試物給予連續(xù)給予受試物4周或30天，在第3周后開始給予免疫抑制劑，進行模型與預(yù)防性給藥相結(jié)合的實驗。5.實驗方法血液白細胞數(shù)測定小鼠外周血白細胞總數(shù)和淋巴細胞數(shù)檢測方法（儀器法）全血用EDTAa抗凝后經(jīng)血細胞分析儀檢測，可測定白細胞數(shù)量，并可對白細胞進行分分類計數(shù)。5.1.1 儀器和材料乙二胺四乙酸二鉀(EDTAK22H2Q),離心管，全血細胞分析儀上樣管，眼科鑷子，振蕩器，加樣槍，冷凍離心機，全血細胞分析儀。5.1.2 實驗步驟

9、5.1.2.1 試劑配制血液抗凝：EDTA&能與血液中的鈣離子結(jié)合成為螯合物，從而阻止血液凝固，的EDTA&可阻止1ml血液凝固。抗凝劑配制：稱量8mgEDTAK2加純凈水至100ml制成抗凝劑，50屋抗凝劑可抗凝1ml小鼠全血。5.1.2.2 采血以摘除小鼠眼球的方法采集全血，采用干凈無菌的眼科鑷子摘取小鼠一側(cè)或雙側(cè)眼球，讓血液自由滴入裝有抗凝劑的離心管(或商品化的抗凝管)中，采血過程中不斷混勻血液與抗凝劑防止血液凝固，每只動物采集抗凝全血約1ml。5.1.2.3 檢測分析上機前血液顛倒混勻，注意檢查是否存在凝塊。在24h內(nèi)以全血細胞分析儀檢測白細胞總數(shù)和淋巴細胞數(shù)。上機操作

10、參照儀器說明書。5.1.3 數(shù)據(jù)分析一般采用方差分析，按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，p>,結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性意義；F值>，P<,用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊性要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。受試樣品組的白細胞總數(shù)顯著高于陰性對照組，可判定該項實驗結(jié)果陽性。ConA誘導(dǎo)的小鼠脾淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗可任選下列方法之一5.2.1 MTT法5.2.1.1 原理當(dāng)T淋巴細胞受ConAM激后發(fā)生母細胞增殖反應(yīng)，

11、活細胞特別是增殖細胞通過線粒體水解酶將MTT（一種淡黃色的唾氮鹽）分解為蘭紫色結(jié)晶而顯色，其光密度值能反映細胞的增殖情況。5.2.1.2 儀器和材料RPMI1640細胞培養(yǎng)液、小牛血清、2-琉基乙醇（2-ME）、青霉素、鏈霉素、刀豆蛋白A（ConA、鹽酸、異丙醇、MTTHank's液、PBSg沖液（）紗布、200目篩網(wǎng)、24孔培養(yǎng)板，96孔培養(yǎng)板（平底），手術(shù)器械、大號注射器內(nèi)芯、二氧化碳培養(yǎng)箱、酶標(biāo)儀、分光光度計、超凈工作臺、高壓滅菌器、無菌濾器。5.2.1.3 實驗步驟5.2.1.3.1 試劑配制完全培養(yǎng)液RPMI1640培養(yǎng)液過濾除菌，用前加入10小牛血清，1谷氨酰胺（200mm

12、ol/L）,青霉素（100U/mD,鏈霉素（100ug/L）及5X105mol/L的2-琉基乙醇，用無菌的1mol/L的HCl或1mol/L的NaOHSpH至，即完全培養(yǎng)液。ConA液用雙蒸水配制成100ug/mL的溶液，過濾除菌，在低溫冰箱（-20C）保存。無菌Hank's液用前以的無菌NaHCOtl。MTT液將5mgMTW于1mL的PBS中，現(xiàn)配現(xiàn)用。酸性異丙醇溶液96mL異丙醇中加入4mL1mol/L的HCl,臨用前配制。5.2.1.3.2脾細胞懸液制備無菌取脾，置于盛有適量（3-5ml）無菌Hank's液平皿中，并在脾上面放置一塊紗布，用大號注射器內(nèi)芯輕輕將脾磨碎，制成

13、單個細胞懸液。經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，用Hank's液洗2次，每次離心10min（1000r/min）。然后將細胞懸浮于2mL的完全培養(yǎng)液中，用全自動細胞計數(shù)儀計數(shù)脾細胞，或用臺酚蘭染色計數(shù)活細胞數(shù)（應(yīng)在95%Z上），調(diào)整細胞濃度為3X106個/mL。5.2.1.3.3淋巴細胞增殖反應(yīng)將細胞懸液分兩孔加入24孔培養(yǎng)板中，每孔1mL一孔加75仙lConA液（相當(dāng)于Ng/mL）,另一孔作為對照，置5%CO,37cCO孵箱中培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束前4h,每孔輕輕吸去上清液，加入不含小牛血清的RPMI1640W養(yǎng)液，同時加入MTT（5mg/mL50l/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4h。培養(yǎng)結(jié)束后，每孔加入1mL酸性

14、異丙醇，超聲震蕩（2秒）或人工吹打混勻，使紫色結(jié)晶完全溶解。然后分裝到96孔培養(yǎng)板中，每個孔分裝3孔作為平行樣，用酶聯(lián)免疫檢測儀，以570nm波長測定光密度值。也可將溶解液直接移入2mL比色杯中，分光光度計上在波長570nm測定ODfi。5.2.1.4 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F(xiàn)®<,結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值,P0,用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的

15、，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。用加ConAfL的光密度值減去不加ConAfL的光密度值代表淋巴細胞的增殖能力，受試樣品組的光密度差值顯著高于對照組的光密度差值，可判定該項實驗結(jié)果陽性。5.2.1.5 注意事項ConA的濃度很重要，濃度過低不能刺激足夠的細胞增殖，濃度過高會抑制細胞增殖，不同批號的ConA在實驗前要預(yù)試，以找到最佳濃度。5.2.2 XTT法5.2.2.1 原理由于MTT經(jīng)還原所產(chǎn)生的甲臜產(chǎn)物不溶于水，且溶解甲臜的有機溶劑有毒性，可選擇XTT法替代MTT去。其原理是：XTT是二甲氧唾黃，在電子耦合試劑存在的情況下，活細胞線粒體中的脫氫酶可將黃色的XTT還原成水溶性的橘黃色的甲臜，生成的甲

16、臜能夠溶解在組織培養(yǎng)基中，不形成顆粒，可直接用酶聯(lián)免疫檢測儀檢測定吸光值。5.2.2.2 實驗步驟脾細胞懸7制備同MTTt;淋巴細胞增殖反應(yīng)：調(diào)整細胞濃度為5X107,取細月fi懸液100屋分別加入96孔培養(yǎng)板中，一孔加510NlConA液，另一孔作為對照，設(shè)2個平行孔，置37c5%CO飽和濕度孵箱中培養(yǎng)72h。培養(yǎng)結(jié)束前4h,向各孔中加入2050屋的XTT工作液(按試劑盒說明現(xiàn)用現(xiàn)配)，孵育4小時。用酶標(biāo)儀在450nm波長處檢測每孔的光密度。5.2.2.3 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F(xiàn)®<,結(jié)論：各組均數(shù)間差

17、異無顯著性；F值,P0,用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。用加ConAfL的光密度值減去不加ConAfL的光密度值代表淋巴細胞的增殖能力，受試樣品組的光密度差值顯著高于對照組的光密度差值，可判定該項實驗結(jié)果陽性。5.2.2.4 注意事項細胞濃度及培養(yǎng)時間在實驗前要預(yù)試，以找到最佳效果。5.2.3 溴脫氧尿嘧啶核苷標(biāo)記酶聯(lián)免疫吸附測定法(BrdU-ELISA法)5.2.3.1 原理T淋巴細胞在有絲分裂原ConA等的刺激下產(chǎn)

18、生增殖反應(yīng)，BrdU可競爭摻入到增殖細胞中新合成的DNAg內(nèi)，將BrdU標(biāo)記的細胞作為抗原結(jié)合到固相載體表面，加入酶連接的抗-BrdU抗體，使BrdU抗原與酶標(biāo)抗體充分結(jié)合，抗原抗體復(fù)合物與底物作用后產(chǎn)生有色物質(zhì)，其光密度可反映細胞增殖的程度。5.2.3.2 儀器和材料低溫離心機，全自動酶標(biāo)儀、超凈工作臺、二氧化碳培養(yǎng)箱、96孔培養(yǎng)板（平底）、倒置顯微鏡、移液器、手術(shù)器械、200目篩網(wǎng)、細胞活性分析儀；RPMI1640細胞培養(yǎng)液、小牛血清、青霉素、鏈霉素、刀豆蛋白A（ConA）、Hank's液、PBS緩沖液（）、BrdU細胞增殖檢測試劑盒（ELISA）、純凈水、終止液。5.2.3.3

19、實驗步驟5.2.3.試劑配制完全培養(yǎng)液RPMI1640培養(yǎng)液過濾除菌，用前加入10%小牛血清，1%谷氨酰胺（200mmol/L）,青霉素（100U/mD,鏈霉素（100Ng/L）及5X105mol/L的2-琉基乙醇，用無菌的1mol/L的HCl或1mol/L的NaOHMpH至，即完全培養(yǎng)液。ConA液用雙蒸水配制成100ug/mL的溶液，過濾除菌，在低溫冰箱（-20C）保存。無菌Hank's液用前以的無菌NaHCOtl。BrdU標(biāo)記液將標(biāo)記劑（試劑盒）按1:100的比例加到培養(yǎng)液中混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用?？贵w貯存液（母液）在Anti-BrdU-POD（試劑盒）中加雙蒸水充分混合，存于-20備用

20、?？贵w工作液每100屋抗體母液加10ml抗體稀釋液（試劑盒），現(xiàn)配現(xiàn)用。洗液每10ml清洗緩沖液（試劑盒）加100ml雙蒸水。5.2.3.脾細胞懸液制備無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank's液平皿中，并在脾上面放置一塊紗布，用大號注射器內(nèi)芯輕輕將脾磨碎，制成單個細胞懸液。經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，用Hank's液洗2次，每次離心10min（1000r/min）。然后將細胞懸浮于2mL的完全培養(yǎng)液中，用全自動細胞計數(shù)儀計數(shù)脾細胞，或用臺酚蘭染色計數(shù)活細胞數(shù)（應(yīng)在95姒上），調(diào)整細胞濃度為2X107個/mL。5.2.3.淋巴細胞培養(yǎng)將細胞加入96孔培養(yǎng)板中，10仙1/孔，每份細胞加2孔，

21、第1孔再加入90N11640培養(yǎng)液，第2孔加入85仙11640培養(yǎng)液和世CConA同時設(shè)3個空白孔，每孔僅加100以11640培養(yǎng)液，置5%CO37c培養(yǎng)箱孵育72h,培養(yǎng)結(jié)束前4h加入BrdU標(biāo)記液，10屋/孔，培養(yǎng)結(jié)束后離心（1000r/min,10min）,棄上清，吹干細胞，放4冰箱保存待測。5.2.3.酶聯(lián)免疫吸附測定每孔加200屋固定液，常溫放置30min后，吸棄固定液。加入100仙1BrdU抗體工作液，37c孵育60min；吸棄未結(jié)合的抗體，力口250屋洗液洗3次，輕拍移去洗液。加底物溶液（含TMB1001/孔，常溫孵育15min。用酶標(biāo)儀測量吸光值，不加終止液時，測定發(fā)射波長為3

22、70nm（記為樂。），參考波長492nm（記為A92）；加終止液時，測定發(fā)射波長為450nm（記為性。），參考波長690nm（記為A690）。5.2.3.4數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定計算每孔標(biāo)記指數(shù)（LI）,LI=（A370-A空白370）-A492-A空白492）或LI=（A450-A空白450）-（A690-A空白690）。用加ConA孔的LI值減去不加ConA孔的LI值所得的差值代表淋巴細胞的增殖程度。采用方差分析對標(biāo)記指數(shù)差值進行統(tǒng)計學(xué)分析，按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F(xiàn)®<,則各組均數(shù)間差異無顯著性；F值,P<,用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的

23、兩兩比較方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。受試樣品組的LI值差值顯著高于對照組的LI值差值，可判定該項實驗結(jié)果陽性。5.2.3.5注意事項選擇有絲分裂原時ConA的濃度很重要，ConA的濃度過高會產(chǎn)生抑制作用，不同批號的ConA在實驗前要預(yù)試，以找到最佳刺激分裂濃度遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)（DTH）遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)是細胞免疫的體內(nèi)檢測法，當(dāng)致敏T細胞再次與抗原接觸，引起T細胞活化，釋放出多種細胞因子，致局部組織發(fā)生以單核細胞為主的炎癥反應(yīng)，一般在2448h達高峰?？扇芜x下

24、列方法之一試驗。5.3.1 二硝基氟苯誘導(dǎo)小鼠DTH（耳月中脹法）5.3.1.1 原理二硝基氟苯（DNFB）稀釋液可與腹壁皮膚蛋白結(jié)合成完全抗原，由此刺激T淋巴細胞增殖成致敏淋巴細胞。47d后再將其涂抹于耳部進行抗原攻擊，使局部月中脹，一般在抗原攻擊后2448h達高峰，其月中脹程度可以反映遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)程度。5.3.1.2 材料DNFB、丙酮、麻油、硫化鋇、打孔器。5.3.1.3 實驗步驟5.3.1.3.1 試劑配制DNFB§液DNFB溶液應(yīng)新鮮配制，稱取DNFB50mg置清潔干燥小瓶中，將預(yù)先配好的5mL丙酮麻油溶液（丙酮：麻油=1:1）,倒入小瓶，蓋好瓶塞并用膠布密封?；靹蚝?，用

25、250屋注射器通過瓶蓋取用。5.3.1.3.2 致敏每鼠腹部皮膚用硫化鋼脫毛，范圍約3cmX3cm用DNFB溶液50屋均勻涂抹致敏。5.3.1.3.3 DTH的產(chǎn)生與測定5天后,用DNFB溶液10仙1均勻涂抹于小鼠右耳（兩面）進行攻擊。攻擊后24h頸椎脫臼處死小鼠，剪下左右耳殼。用打孔器取下直徑8mml勺耳片，稱重。5.3.1.4 數(shù)據(jù)處理與結(jié)果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F(xiàn)®<,結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值,P0,用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正

26、態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。用左右耳重量之差表示DTH的程度。受試樣品組的重量差值顯著高于與對照組的重量差值，可判定該項實驗結(jié)果陽性。5.3.1.5 注意事項：操作時應(yīng)避免DNFBW皮膚接觸。5.3.2 綿羊紅細胞（SRBC誘導(dǎo)小鼠DTH（足跖增厚法）5.3.2.1 原理SRBC可刺激T淋巴細胞增殖成致敏淋巴細胞，4天后，當(dāng)再以SRBCC擊時，攻擊部位出現(xiàn)腫脹，其腫脹程度可反映遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)程度。5.3.2.2 儀器與材料游標(biāo)卡尺（精密度0.02mm、SRBC微量注射器（50膜）、足趾容積測量儀。5.3.2.3 實驗步

27、驟5.3.2.3.1 致敏小鼠用2%（v/v）SRBC腹腔或靜脈免疫，每只鼠注射（約1X108個SRBC）。5.3.2.3.2 DTH的產(chǎn)生與測定免疫后4天，測量左后足跖部厚度或腫脹度，然后在測量部位皮下注射20%（v/v）SRBC,每只鼠20屋（約1X108個SRBC,注射后于24h測量左后足跖部厚度或腫脹度，同一部位測量三次，取平均值。測量方法：用游標(biāo)卡尺測量肉眼讀數(shù)?；蛴米阒喝莘e測量儀進行測量足跖部腫脹度，操作方法按儀器操作指引進行。5.3.2.4 數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F(xiàn)®<,結(jié)論：各組均數(shù)間差異無

28、顯著性；F值,P0,用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。以攻擊前后足跖厚度或腫脹度的差值來表示DTH的程度。受試樣品組的差值顯著高于對照組的差值，可判定該項實驗結(jié)果陽性。5.3.2.5 注意事項前后兩次測量足跖厚度時，最好由專人來進行?？ǔ呔o貼足跖部，但不要加壓，否則會影響測量結(jié)果。攻擊時所用的SRB翌新鮮（保存期不超過1周）?？贵w生成細胞檢測（改良法）5.4.1 原理溶血空斑試驗是檢測產(chǎn)生IgM、IgG等抗體分泌細胞數(shù)體

29、外試驗法。用綿羊紅細胞（SRBC免疫的小鼠脾細胞懸液與一定量的SRBC昆合，在補體參與下，使抗體分泌細胞周圍的SRBCS解，形成肉眼可見的空斑。5.4.2 儀器和材料溶血空斑自動圖象分析儀、二氧化碳培養(yǎng)箱、恒溫水浴、離心機、手術(shù)器械、200目篩網(wǎng)、SRBC補體（豚鼠血清）、Hank's液、RPMI1640W養(yǎng)液、SA緩沖液（C4H4N2O30.46g,MgCl20.1g,0.2g,NaCl8.38g,NaHC3O0.252gandC8H11N2NaO30.3g,加蒸餾水至1000mL）、滅菌生理鹽水、瓊脂糖。5.4.3 實驗步驟：5.4.3.1 SRBC綿羊頸靜脈取血，將羊血放入有玻璃

30、珠的滅菌錐形瓶中，朝一個方向搖動，以脫纖維，生理鹽水2500rpm/min,15min,洗滌3次，制備壓積SRBC放入4c冰箱保存?zhèn)溆谩?.4.3.2 完全培養(yǎng)基的制備：新生小牛血清經(jīng)綿羊紅細胞（v/v，5：1）吸收，4，30-60min后，加入不完全培養(yǎng)基RPMI1640中，制備成含20%小牛血清的完全培養(yǎng)基。5.4.3.3 補體制備股動脈取血，靜置30-60min，2500rpm/min，15min分離5.4.3.4血清，將5-10只豚鼠血清混合后，與壓積SRBCZ5:1（v/v）比例混合，4c冰箱放置30-60min,問或震蕩，2500rpm/min,15min分離血清，分裝，-80C冰

31、箱保存。用時以完全培養(yǎng)基1：10（v/v）比例稀釋。免疫動物壓積SRBC以生理鹽水制成2%（v/v）的細胞懸液（約1X108個SRBC,每只鼠腹腔注射。5.4.3.5 脾細胞懸液制備將SRBQfe疫4-5天后的小鼠頸椎脫臼處死，無菌取脾臟，并在脾上面放置一塊紗布，用大號注射器內(nèi)芯輕輕將脾磨碎，制成單個細胞懸液，200目篩網(wǎng)過濾，1000rpm/min,10min,去上清，Hank'液洗2遍，以完全培養(yǎng)基RPMI1640制備成5X1061X107個細胞/mL的脾細胞懸液。5.4.3.6 空斑的測定5.4.3.6.1 底層培養(yǎng)基制備0.5g瓊脂糖加入100mL滅菌生理鹽水中，加熱溶解，待溫

32、度于50c左右時，以1mL仇的量加至六孔培養(yǎng)板中，瓊脂凝固后備用。5.4.3.6.2 頂層培養(yǎng)基制備0.5g瓊脂糖加入100mLHanks液中（）,加熱溶解，以試管的量加至46-50恒溫的試管中。5.4.3.6.3 鋪板：50屋20%SRBC生理鹽水配制，v/v）、200屋脾細胞懸液先后加入含有頂層的試管中，迅速混勻，倒入六孔板中并鋪平頂層混合液，每個樣本做兩個平行孔。5.4.3.6.4 空斑測定：已制備好培養(yǎng)板放入37C、5%CO加養(yǎng)箱中孵育1h,然后每孔加入500屋以完全培養(yǎng)基稀釋的補體（v/v,1:10）,繼續(xù)孵育2h,自動圖象分析儀讀取溶血空斑圖象分析軟件計數(shù)溶血空斑數(shù)。取平行孔空斑數(shù)

33、的平均值為樣本的溶血空斑數(shù)值，以空斑數(shù)/106脾細胞表示。5.4.4 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F(xiàn)®<,結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值,P0,用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。用空斑數(shù)/106脾細胞或空斑數(shù)/全脾細胞來表示，受試樣品組的空斑數(shù)顯著高于對照組的空斑數(shù)，可判定該項實驗結(jié)果陽性。血清溶血素的測定可任選下列方法之一。5.5.1

34、 血凝法5.5.1.1 原理用SRBCfe疫動物后，產(chǎn)生抗SRBCG體(溶血素)，利用其凝集SRBC勺程度來檢測溶血素的水平。5.5.1.2 儀器和材料SRBC、生理鹽水、微量血凝實驗板、離心機5.5.1.3 實驗步驟5.5.1.3.1 SRBC綿羊頸靜脈取血，將羊血放入有玻璃珠的滅菌錐形瓶中，朝一個方向搖動，以脫纖維，放入4冰箱保存?zhèn)溆茫杀４?周。5.5.1.3.2 免疫動物及血清分離取羊血，用生理鹽水洗滌3次，每次離心(2000r/min)10min。將壓積SRBCffl生理鹽水配成2%(v/v)的細胞懸液，每只鼠腹腔注射進行免疫。45d后，摘除眼球取血于離心管內(nèi)，放置約1h,將凝固血與

35、管壁剝離，使血清充分析出，2000r/min離心10min,收集血清。5.5.1.3.3 凝集反應(yīng)用生理鹽水將血清倍比稀釋，將不同稀釋度的血清分別置于微量血凝實驗板內(nèi)，每孔100仙1,再加入100仙l%(v/v)的SRB喝液，混勻，裝入濕潤的平盤內(nèi)加蓋，于37c溫箱孵育3h,觀察血球凝集程度。5.5.1.4 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F(xiàn)®<,結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值,P0,用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換

36、后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。血清凝集程度一般分為5級(0-IV)記錄，按下式計算抗體積數(shù)，受試樣品組的抗體積數(shù)顯著高于對照組的抗體水平，可判定該項實驗結(jié)果陽性?？贵w水平=(Si+2S+3&nS)式中1、2、3n代表對倍稀釋的指數(shù)，S代表凝集程度的級別，抗體積數(shù)越大，表示血清抗體越高。0級紅細胞全部下沉，集中在孔底部形成致密的圓點狀，四周液體清皙。I級紅細胞大部分沉集在孔底成園點狀，四周有少量凝集的紅細胞。R級凝集的紅細胞在孔底形成薄層，中心可以明顯見到一個疏松的紅點。田級凝集的紅細胞均勻地鋪散在孔底成一薄層，中心隱約可見一個小紅點。I

37、V級凝集的紅細胞均勻地鋪散在孔底成一薄層，凝塊有時成卷折狀。5.5.1.5 注意事項血清稀釋時要充分混勻。最后一個稀釋度應(yīng)不出現(xiàn)凝集現(xiàn)象。5.5.2 半數(shù)溶血值（HG）的測定5.5.2.1 原理用SRBC&疫動物后，產(chǎn)生抗SRBCM體（溶血素），在補體參與下，與SRBC一起孵育，可發(fā)生溶血反應(yīng)，釋放血紅蛋白，通過測定血紅蛋白含量反映動物血清中溶血素的含量。5.5.2.2 儀器和材料分光光度計、全自動酶標(biāo)儀、恒溫培養(yǎng)箱、96孔培養(yǎng)板、離心機、恒溫水浴、SRBC補體（豚鼠血清）、SA緩沖液（CHNQ0.46g,MgC20.1g,0.2g,NaCl8.38g,NaHCOO.252gandGH

38、iNNaOOFg,加蒸儲水至1000mL、都氏試劑（碳酸氫鈉1.0g、高鐵氟化鉀0.2g、氟化鉀0.05g,加蒸儲水至1000mL5.5.2.3實驗步驟5.5.2.3.1 SRBC綿羊頸靜脈取血，將羊血放入有玻璃珠的滅菌錐形瓶中朝一個方向搖動，以脫纖維，放入4冰箱保存?zhèn)溆?，可保?周。5.5.2.3.2 制備補體采集豚鼠血，分離出血清（至少5只豚鼠的混合血清），將1mL壓積SRBO入到5mL豚鼠血清中，放4c冰箱30min,經(jīng)常振蕩，離心取上清，分裝，70c保存。用時以SA緩沖液按1:8稀釋。5.5.2.3.3 免疫動物及血清分離取羊血，用生理鹽水洗滌3次，每次離心（2000r/min）10m

39、in。將壓積SRBCffl生理鹽水配成2%（v/v）的細胞懸液，每只鼠腹腔注射進行免疫。45d后，摘除眼球取血于離心管內(nèi)，放置約1h,使血清充分析出，2000r/min離心10min,或6000r/min,4min,收集血清。5.5.2.3.4 溶血反應(yīng)測定5.5.2.3. 檢測方法1（分光光度計測定）：取血清用SA緩沖液稀釋（一般為200500倍）。將稀釋后的血清1mL置試管內(nèi)，依次加入10%（v/v）SRBC,補體1mL（用SA液按1:8稀釋）。另設(shè)不加血清的對照管（以SA液代替）。置37恒溫水浴中保溫1530min后，冰浴終止反應(yīng)。2000r/min離心10min。取上清液1mL加都氏試

40、劑3mL同時取10%（v/v）SRBC加都氏試劑至4mL充分混勻，放置10min后，于540nm處以對照管作空白，分別測定各管光密度值。5.5.2.4. 檢測方法2（全自動酶標(biāo)儀測定）：設(shè)樣品孔和空白對照孔，樣品孔：取血清10仙1,用1mL1:5稀釋的SA緩沖液稀釋；每孔加入稀釋后的血清100履；空白對照孔：每孔加入100屋1:5稀釋的SA緩沖液，再依次加入10%（v/v）SRBC50屋，補體100膜（用SA溶液或PBS容液按1:8稀釋），置37c恒溫水浴中保溫30min,1500r/min離心10min。然后樣品孔和空白對照孔各取上清液50加入另一個96孔培養(yǎng)板內(nèi)，加都氏試劑150仙1。同時

41、設(shè)半數(shù)溶血孔，加入10%（v/v）SRBC屋，再加都氏試劑至200屋。用震蕩器充分混勻，放置10min后，于540nm處用全自動酶標(biāo)儀測定各孔光密度值。5.5.2.5. 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F(xiàn)®<,結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值,P0,用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。溶血素的量以半數(shù)溶血值（HQ）表示，按下列公式計算：樣品光密

42、度值X稀釋倍數(shù)樣品HC50=SRBC半數(shù)溶血時的光密度值樣品光密度值-空白光密度值或樣品HC5o=X稀釋倍數(shù)SRBC半數(shù)溶血時的光密度值-空白光密度值受試樣品組的HQ顯著高于對照組的HQ,可判定該項實驗結(jié)果陽性。小鼠碳廓清實驗5.6.1 原理在一定范圍內(nèi)，碳顆粒的清除速率與其劑量呈指函數(shù)關(guān)系。以血碳濃度對數(shù)值為縱座標(biāo)，時間為橫座標(biāo)，兩者呈直線關(guān)系。此直線斜率(K)可表示吞噬速率。動物肝、脾重量影響吞噬速率，一般以校正吞噬指數(shù)a表示。5.6.2 儀器和試劑分光光度計、全自動酶標(biāo)儀、計時器、血色素吸管、印度墨汁、Na2CO35.6.3 實驗步驟5.6.3.1 溶液配制注射用墨汁將印度墨汁原液用生理

43、鹽水稀釋34倍。Na2CO溶液取，加蒸儲水至100mL5.6.3.2 注射墨汁稱體重，從小鼠尾靜脈注入稀釋的印度墨汁，按每10g體重計算。待墨汁注入，立即計時。5.6.3.3 測定注入墨汁后2、10min,分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20小，并立即將其加到2mL%N2CO溶液中。用分光光度計或全自動酶標(biāo)儀在600nm波長處測光密度值(OD,以NaCO溶液作空白對照。將小鼠處死，取肝臟和脾臟，用濾紙吸干臟器表面血污，稱重。以吞噬指數(shù)表示小鼠碳廓清的能力。按下式計算吞噬指數(shù)a：K=lgOD1-lgOD2體重3吞噬指數(shù)a=xJK肝重十脾重5.6.4 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先

44、進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F(xiàn)®<,結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值,P0,用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。受試樣品組的吞噬指數(shù)顯著高于對照組的吞噬指數(shù)，可判定該項實驗結(jié)果陽性。5.6.5 注意事項靜脈注入碳粒的量、取血時間、取血量一定要準(zhǔn)確。墨汁放置中，碳?？沙劣谄康?，臨用前應(yīng)搖勻。使用新的墨汁時，應(yīng)在實驗前摸索一個最適墨汁注入量，即正常小鼠在2030min內(nèi)不易廓清。小鼠腹腔巨噬細胞吞噬熒

45、光微球試驗方法5.7.1 原理：激活的巨噬細胞具有吞噬表面帶有陽性可調(diào)理基團的熒光微球，將含有巨噬細胞的腹腔液與調(diào)理過的熒光微球孵育一定時間后，去除多余未被吞噬的微球，收集以巨噬細胞為主的標(biāo)本，用流式細胞儀檢測巨噬細胞，計數(shù)吞噬熒光微球的巨噬細胞，計算吞噬百分率和吞噬指數(shù)，據(jù)此判定巨噬細胞的吞噬能力。5.7.2 儀器和材料Hank's液，小牛血清，PB或沖液，生理鹽水，熒光微球（2m）,1%小牛血清白蛋白（BSA。流式細胞儀，超聲清洗儀，二氧化碳細胞培養(yǎng)箱，離心機，6孔培養(yǎng)板，細胞刮，過濾器（75mj）,流式上樣管，流式細胞儀專用鞘液，移液槍及吸頭，白細胞計數(shù)板，手術(shù)器械一套，注射器，

46、滴管，膠頭吸管。5.7.3 實驗步驟5.7.3.1 試劑配制5.7.3.1.1 含5%小牛血清的Hank's液：取10ml小牛血清加入200mlHank's液中，混勻，臨用前配。5.7.3.1.2 PBS緩沖液的配制方法：KHPO6.66g,NaHPO12HO6.38g,將上述試劑溶于1000ml蒸儲水中調(diào)PH值至即成。5.7.3.1.3 2%綿羊紅細胞懸液的配制方法：實驗前取綿羊頸靜脈血，置于盛有玻璃珠（20個左右）的三角瓶內(nèi)，連續(xù)順一個方向充分搖動510分鐘，除去纖維蛋白，用生理鹽水洗滌3次，每次1500rPm,離心10分鐘，4c冰箱保存。實驗前棄去上清，按血球壓積用生理鹽

47、水配制成2%的紅細胞懸液。5.7.3.1.4 1%BSA勺配制：溶于50mlPBSg沖液中，臨用前配較好。5.7.3.1.5 熒光微球預(yù)調(diào)理：100屋熒光微球與10ml1%BSA37c避光孵育30min,超聲處理5min,臨用前配。5.7.3.2 腹腔巨噬細胞吞噬熒光微球過程實驗前4天給每只小鼠腹腔注射2%綿羊血紅細胞激活小鼠巨噬細胞，實驗當(dāng)天用頸椎脫臼法處死小鼠，腹腔注射加小牛血清的Hank's液3ml/只，輕輕按揉腹部20次，以充分洗出腹腔巨噬細胞，然后將腹壁剪開一個小口，吸取腹腔洗液2ml用75m過濾器過濾至試管內(nèi)，調(diào)整巨噬細胞數(shù)為46X105/ml。用移液槍吸取1ml腹腔洗液于

48、6孔培養(yǎng)板中,加入已經(jīng)預(yù)調(diào)理過的熒光微球（1X107/板），37c二氧化碳細胞培養(yǎng)箱（或室溫）避光孵育90120分鐘，孵育結(jié)束后棄上清（含未貼壁細胞和多余熒光微球），每次使用緩沖液輕輕洗滌2次，去上清后再加入4CPBS緩沖液，用細胞刮刮下貼壁細胞，輕輕吹打均勻后經(jīng)75m過濾器過濾后上機分析。5.7.3.3 流式細胞儀檢測分析5.7.3.3.1 設(shè)門：首先設(shè)立FSC-SS5維散點圖，通過調(diào)節(jié)FSC?口SSC電壓值，以巨噬細胞設(shè)門界定分析的巨噬細胞群，最大限度地排除其它有核細胞、細胞碎片等的干擾;573.3.2獲?。涸跓晒馕⑶虬l(fā)射光的熒光通路檢測巨噬細胞的熒光強度，每份樣本獲取5000個巨噬細胞，

49、數(shù)據(jù)可顯示于二維散點圖和直方圖中。在二維散點圖中可通過設(shè)門圈定未吞噬熒光微球的巨噬細胞群和吞噬熒光微球的巨噬細胞群；在直方圖中可通過標(biāo)尺標(biāo)定未吞噬熒光微球的巨噬細胞群和吞噬熒光微球的巨噬細胞群，全部數(shù)據(jù)經(jīng)相關(guān)軟件分析未吞噬熒光微球的巨噬細胞和吞噬不同數(shù)量熒光微球的巨噬細胞的比例。吞噬一個熒光微球吞噬二個熒光微球圖1吞噬熒光微球后的小鼠腹腔巨噬細胞圖（熒光顯示400）圖2吞噬熒光微球后的小鼠腹腔巨噬細胞FSC-SS。口FL2-SSC二維散點圖R1:總巨噬細胞群R2:未吞噬熒光微球的巨噬細胞群R3:吞噬一個熒光微球的巨噬細胞群R4：吞噬兩個光微球的巨噬細胞群R5:吞噬三個熒光微球的巨噬細胞群R6:

50、吞噬四個或四個以上熒光微球的巨噬細胞群圖3吞噬熒光微球后的小鼠腹腔巨噬細胞FL2直方圖5.7.4 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定吞噬熒光微球的巨噬細胞數(shù)吞噬百分率（衿=X100計數(shù)的巨噬細胞數(shù)被吞噬的熒光微球總數(shù)吞噬指數(shù)=計數(shù)的巨噬細胞數(shù)以吞噬百分率或吞噬指數(shù)表示小鼠巨噬細胞的吞噬能力。吞噬百分率需進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，X=Sin-1JP，式中P為吞噬百分率，用小數(shù)表示，然后再進行方差分析，在進行方差分析時，需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F(xiàn)®<,結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F值,p0,用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當(dāng)

51、的變量轉(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。受試樣品組的吞噬百分率、吞噬指數(shù)與對照組吞噬百分率、吞噬指數(shù)比較，差異均有顯著性，可判定該項實驗結(jié)果陽性。5.7.5 注意事項5.7.5.1 頸椎脫臼處死小鼠勿用力過大，防止腹腔內(nèi)血管破裂出血，導(dǎo)致腹腔洗液中混雜大量紅細胞，影響流式細胞儀的結(jié)果分析。5.7.5.2 孵育、細胞洗滌和上機全程注意避光，以保持微球熒光穩(wěn)定性。5.7.5.3 巨噬細胞、熒光微球濃度要根據(jù)試劑說明書調(diào)整合適，否則影響結(jié)果準(zhǔn)確性。5.7.5.4 細胞處理過程要輕柔，盡量減少碎片和雜質(zhì)對結(jié)果分析的影響

52、。5.7.5.5 腹水細胞上機前一定要用足夠標(biāo)準(zhǔn)的濾器過濾，調(diào)理后多余的熒光微球要盡量去除，以防止流式細胞儀堵塞。NK細胞活性測定NKffl胞是沒有T和B細胞表面標(biāo)志的淋巴細胞，具有非特異性殺傷作用?？扇芜x下列方法之一測定。5.8.1 乳酸脫氫酶（LDH測定法5.8.1.1 原理正常情況下，活細胞的胞漿內(nèi)含有的LDH不能透過細胞膜，當(dāng)細胞受到NK細胞的殺傷后，LDHS放到細胞外。LDH可使乳酸鋰脫氫，進而使NADS®成NADH后者再經(jīng)遞氫體吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS）還原碘硝基氯化四氮唑（INT），INT接受U被還原成紫紅色甲月贊類化合物。在酶標(biāo)儀上用490nm比色測定。5.8.1.2

53、 儀器和材料酶標(biāo)儀、全自動細胞計數(shù)儀、YAC-1細胞、Hank's液（）、RPMI164沈全培養(yǎng)液、乳酸鋰或乳酸鈉、硝基氯化四氮唑（INT）、吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMS）、NADL的Tris-HCl緩沖液（）、1%NP40或Triton5.8.1.3 實驗步驟5.8.1.3.1 LDH基質(zhì)液的配制乳酸鋰5x10-2mol/L硝基氯化四氮唾（INT）x10-4mol/L吩嗪二甲酯硫酸鹽（PMSX10-4mol/L氧化型輔酶I（NADX10-3mol/L將上述試劑溶于L的Tris-HCl緩沖液中（）5.8.1.3.2 靶細胞的傳代（YAC-1細胞）實驗前24h將靶細胞進行傳代培養(yǎng)。應(yīng)用前以H

54、ank's液洗3次，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為4X105個/mL。5.8.1.3.3 脾細胞懸液的制備（效應(yīng)細胞）無菌取脾，置于盛有適量無菌Hank's液的小平皿中，并在脾上面放置一塊紗布，用大號注射器內(nèi)芯輕輕將脾磨碎，制成單個細胞懸液。經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，用Hank's液洗2次，每次離心10min（1000r/min）。棄上清將細胞漿彈起，力口入滅菌水20秒，裂解紅細胞后再加入倍Hank's液及8mLHanks液，1000rpm,10min離心，然后將細胞懸浮于2mL的完全培養(yǎng)液中，用全自動細胞計數(shù)儀計數(shù)脾細胞；或用1mL含10%、牛血清的RP

55、MI164沈全培養(yǎng)液重懸，用1麻醋酸稀釋后計數(shù)（活細胞數(shù)應(yīng)在95%Z上），用臺酚蘭染色計數(shù)活細胞數(shù)（應(yīng)在95%Z上）,最后用RPMI1640I全培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度為2X107個/mL。5.8.1.3.4 NK細胞活性檢測取靶細胞和效應(yīng)細胞各100仙l（效靶比50:1）,加入U型96孔培養(yǎng)板中；靶細胞自然釋放孔加靶細胞和培養(yǎng)液各100仙l,靶細胞最大釋放孔加靶細胞和1%NP40或Triton各100卜l;上述各項均設(shè)三個復(fù)孔，于37C、5%CO培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h,然后將96孔培養(yǎng)板以1500r/min離心5min,每孔吸取上清100口置平底96孔培養(yǎng)板中，同時加入LDHS質(zhì)液100仙l,反應(yīng)3mi

56、n,每孔加入1mol/L的HCl30小，在酶標(biāo)儀490nm處測定光密度值（OD。按下式計算NK細胞活性：反應(yīng)孔Ot>自然釋放孔ODNK細胞活性=X100%最大釋放孔OD-自然釋放孔OD5.8.1.4 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定NK細胞活性需進彳T數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，X=Sin-1行，式中P為NKffl胞活性，用小數(shù)表示，然后再進行方差分析，在進行方差分析時，需按方差分析的程序先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算F值，F(xiàn)值<,結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F<>,P<,用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求

57、后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。受試樣品組的NK細胞活性顯著高于對照組的NK細胞活性，即可判定該項實驗結(jié)果陽性。5.8.1.5 注意事項靶細胞和效應(yīng)細胞必須新鮮，細胞存活率應(yīng)大于95比色時環(huán)境溫度應(yīng)保持恒定LDH基質(zhì)液應(yīng)臨用前配制在一定范圍內(nèi)，NK細胞活性與效靶比值成正比。一般效靶比值不應(yīng)超過100。5.8.2同位素3H-TdR測定法5.8.2.1 原理將用同位素3H-TdR標(biāo)記的靶細胞與淋巴細胞共同培養(yǎng)時，靶細胞可被NK細胞殺傷。同位素便從被殺傷的靶細胞中釋放出來，其釋放的量與NK細胞活性成正比。通過測定靶細胞3H-TdR的釋放率即可反應(yīng)NKffl胞的活性。5.8.2.2 儀器和材料液體閃爍儀、多頭細胞取集器、二氧化碳培養(yǎng)箱、3H-TdRRPMI1640完全培