LSC(激光掃描細(xì)胞儀)基本應(yīng)用之一細(xì)胞凋亡檢測(cè)

1、LSC（激光掃描細(xì)胞儀）基本應(yīng)用之一：細(xì)胞凋亡檢測(cè)1， Annexin V/PI雙染凋亡或稱為細(xì)胞程序性死亡是一種在許多細(xì)胞系統(tǒng)中觀察到的普遍現(xiàn)象。細(xì)胞調(diào)亡特征包括細(xì)胞形態(tài)變小，染色質(zhì)濃縮和由于核酸內(nèi)切酶的作用而形成的核小體。在細(xì)胞凋亡早期，細(xì)胞膜的磷酸雙分子層會(huì)發(fā)生變化。磷酸雙分子層的組成物phosphotidylserine會(huì)曝露出來并在經(jīng)熒光標(biāo)記后可被檢測(cè)。Annexin V是annexin家族成員之一，是一種鈣依賴性的磷脂結(jié)合蛋白。Annexin V與磷脂雙分子層中的PS有高度親合力。使用FITC標(biāo)記的Annexin V和PI染料可識(shí)別出細(xì)胞膜發(fā)生改變的和喪失膜完整性的細(xì)胞群體。當(dāng)使用

2、LSC分析時(shí)，細(xì)胞可在Annexin V 和PI染色的指引下通過CompuSort被定位。LSC檢測(cè)優(yōu)點(diǎn)：檢測(cè)時(shí)需要的樣本量極少；每種類型的細(xì)胞都可觀察其形態(tài)；Annexin V染色擴(kuò)展應(yīng)用：1， 與DNA電泳相結(jié)合，分析DNA慧星實(shí)驗(yàn)2， 與DAPI染色相結(jié)果，查看DNA含量與AnnexinV陽性之間關(guān)系2， 單鏈DNA檢測(cè)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，DNA雙鏈會(huì)解開從而形成單鏈。AO染料與雙鏈DNA結(jié)合時(shí)發(fā)出330nm的熒光，當(dāng)與單鏈DNA結(jié)合時(shí)發(fā)出600nm以上的熒光。據(jù)此可以識(shí)別出具有單鏈結(jié)構(gòu)的凋亡細(xì)胞。3， DNA皺縮或DNA小體形成細(xì)胞發(fā)生凋亡后，DNA會(huì)生皺縮并逐步碎裂成為DNA小體。如果G

3、2/M期細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，其DNA調(diào)亡峰會(huì)形成在S期細(xì)胞群體間；G0/G1期細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，其凋亡細(xì)胞出現(xiàn)在Sub-G1期位置。LSC通過Max Pixel信號(hào)，可以識(shí)別出因凋亡而發(fā)生DNA皺縮的細(xì)胞。疑似的凋亡細(xì)胞，都可通過觀察其形態(tài)來進(jìn)行確認(rèn)。4， Bax蛋白遷移至線粒體（集中化），N-kappa B由胞漿向胞核轉(zhuǎn)移正常細(xì)胞Bax蛋白分散分布在細(xì)胞漿及細(xì)胞核內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)Bax蛋白會(huì)集中到線粒體內(nèi)。LSC通過Max Pixel信號(hào)并給合DNA周期信號(hào)，可分析出Bax蛋白的再分布情況。核因子N-kappa -b（NF-b）是一具有多功能轉(zhuǎn)錄與調(diào)節(jié)作用的蛋白質(zhì)因子，它能與多種細(xì)胞因子和粘附

4、因子基因啟動(dòng)子部位發(fā)生結(jié)合，增強(qiáng)某些基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，還可能延緩PMN的凋亡，從而廣泛參與基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)，特別是一些與機(jī)體免疫應(yīng)答反映密切相關(guān)的基因的轉(zhuǎn)錄和調(diào)控。其活化所導(dǎo)致的Tnf-、IL-1、IL-6、ICAM-1等細(xì)胞因子發(fā)生改變。正常細(xì)胞的N-kappa B分布在胞漿內(nèi)，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)其會(huì)聚集到細(xì)胞核內(nèi)。通過LSC的識(shí)別細(xì)胞核及細(xì)胞漿能力可分別檢測(cè)它的分布含量。5， H2AX-DNA斷裂點(diǎn)檢測(cè)DNA雙鏈斷裂是電離輻射對(duì)DNA的重要損傷類型，與細(xì)胞死亡、基因突變甚至細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化有密切聯(lián)系。DNA發(fā)生雙鏈斷裂后最早反應(yīng)之一是位于斷裂點(diǎn)附近的組蛋白H2AX的C末端絲氨酸殘基發(fā)生磷酸化，形成

5、-H2AX。磷酸化的-H2AX快速轉(zhuǎn)導(dǎo)DNA損傷信號(hào)，導(dǎo)致下游分子磷酸化的激活，引發(fā)一系列的生物級(jí)聯(lián)反應(yīng)和和細(xì)胞學(xué)反應(yīng)。-H2AX是迄今所研究的最重要的DNA損傷感應(yīng)分子。HL-60細(xì)胞經(jīng)順鉑處理后，按不同時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)其DNA修復(fù)情況6， 活細(xì)胞檢測(cè)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞死亡Hoechst 33342可直接滲入活細(xì)胞內(nèi)染色DNA，從而可取得活細(xì)胞群體內(nèi)細(xì)胞周期的分布情況。Mitoshift探針可以檢測(cè)線粒體的膜電位，早期發(fā)生凋亡的細(xì)胞仍保持膜電位，后期凋亡則喪失膜電位。YO-PRO-1在細(xì)胞發(fā)生凋亡細(xì)胞膜通透性發(fā)性改變后就可染色細(xì)胞。當(dāng)細(xì)胞死亡后核膜完整性喪失后，可被PI染色，表示細(xì)胞死亡。R3：YoPro+/Mitoshif+ 膜通透改變，線粒體膜電位存在，早期凋亡細(xì)胞R4：YoPro+/Mitoshif- 膜通透改變，線粒體膜電位喪失，晚期凋亡細(xì)胞R