質(zhì)粒種類與應用

1、克隆載體polylinker載體的功能及特征載體的功能及特征載體的功能載體的功能運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細胞運送外源基因高效轉(zhuǎn)入受體細胞為外源基因提供復制能力或整合能力為外源基因提供復制能力或整合能力為外源基因的擴增或表達提供必要的條件為外源基因的擴增或表達提供必要的條件載體的功能及特征載體的功能及特征載體應具備的條件載體應具備的條件具有針對受體細胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性）具有針對受體細胞的親緣性或親和性（可轉(zhuǎn)移性） 具有合適的篩選標記具有合適的篩選標記 具有較具有較高的外源高的外源DNA的載裝能力的載裝能力 具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識別切割位點具有多種單一的核酸內(nèi)切酶識別切割位點 具有與

2、特定受體細胞相適應的復制位點或整合位點具有與特定受體細胞相適應的復制位點或整合位點 質(zhì)粒質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒是生物細胞內(nèi)固有的、能獨立于寄主染色體而自主復制、并質(zhì)粒是生物細胞內(nèi)固有的、能獨立于寄主染色體而自主復制、并被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子被穩(wěn)定遺傳的一類核酸分子質(zhì)粒常見于原核細菌和真菌中質(zhì)粒常見于原核細菌和真菌中絕大多數(shù)的質(zhì)粒是絕大多數(shù)的質(zhì)粒是DNA型的型的絕大多數(shù)的天然絕大多數(shù)的天然DNA質(zhì)粒具有共價、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，質(zhì)粒具有共價、封閉、環(huán)狀的分子結(jié)構(gòu)，即即cccDNA質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分子量范圍：的分子量范圍：1 - 300 kb質(zhì)粒質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的基本特征質(zhì)

3、粒的自主復制性質(zhì)粒的自主復制性質(zhì)粒能利用寄主細胞的質(zhì)粒能利用寄主細胞的DNA復制系統(tǒng)進行自主復制復制系統(tǒng)進行自主復制質(zhì)粒質(zhì)粒DNA上的復制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對應關系上的復制子結(jié)構(gòu)決定了質(zhì)粒與寄主的對應關系根據(jù)在每個細胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)粒可分為根據(jù)在每個細胞中的分子數(shù)（拷貝數(shù)）多寡，質(zhì)?？煞譃閮纱髲椭祁愋停簝纱髲椭祁愋停簢谰o型復制控制的質(zhì)粒嚴緊型復制控制的質(zhì)粒 1 - 3 拷貝拷貝 stringent plasmid松弛型復制控制的質(zhì)粒松弛型復制控制的質(zhì)粒 10 - 60 拷貝拷貝 stringent plasmid質(zhì)粒質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的自主復制性：質(zhì)粒的自

4、主復制性：拷貝數(shù)的控制機制拷貝數(shù)的控制機制 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA復制啟動控制復制啟動控制控制復制引物與模板的結(jié)合控制復制引物與模板的結(jié)合oriE.coli ColE1 plasmid復制方向復制方向rop（+）RopRNA IIRNA I3553質(zhì)粒質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的自主復制性：質(zhì)粒的自主復制性：拷貝數(shù)的控制機制拷貝數(shù)的控制機制 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA復制啟動控制復制啟動控制控制復制起始因子與復制起始位點（控制復制起始因子與復制起始位點（ori）的結(jié)合的結(jié)合PcopcopP/OrepreporiCopRep質(zhì)粒質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的不相容性質(zhì)粒的不相容性任何兩種含有相似復

5、制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時存在于任何兩種含有相似復制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，不能同時存在于一個細胞中，這種現(xiàn)象稱為一個細胞中，這種現(xiàn)象稱為質(zhì)粒的不相容性質(zhì)粒的不相容性，不相容性的質(zhì)，不相容性的質(zhì)以大腸桿菌的質(zhì)粒為例：以大腸桿菌的質(zhì)粒為例：ColE1、pMB1 擁有相似的復制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容擁有相似的復制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容pSC101、F、RP4 擁有相似的復制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容擁有相似的復制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容p15A及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容及其衍生質(zhì)粒擁有相似的復制子結(jié)構(gòu)，彼此不相容粒組成粒組成不相容性群不相容性群質(zhì)粒質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的不相容性：質(zhì)粒的不相

6、容性：分子機制分子機制兩種含有相似復制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復制時受到同一種兩種含有相似復制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復制時受到同一種拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的干擾，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)不同，兩種含有不同復制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復制時各受自己的兩種含有不同復制子結(jié)構(gòu)的不同質(zhì)粒，在復制時各受自己的拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)恒定，拷貝數(shù)控制系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，致使兩種質(zhì)粒的最終拷貝數(shù)恒定，因此在經(jīng)過若干復制周期和細胞分裂周期后仍能共處于同一因此在經(jīng)過若干復制周期和細胞分裂周期后仍能共處于同一細胞內(nèi)細胞內(nèi)其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細胞分裂周期中更具優(yōu)

7、勢其中拷貝數(shù)多的質(zhì)粒在以后的細胞分裂周期中更具優(yōu)勢質(zhì)粒質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移性革蘭氏陰性菌的質(zhì)?？煞殖蓛纱箢悾焊锾m氏陰性菌的質(zhì)?？煞殖蓛纱箢悾航雍闲唾|(zhì)粒接合型質(zhì)粒 能在天然條件下自發(fā)地從一個細胞轉(zhuǎn)移到能在天然條件下自發(fā)地從一個細胞轉(zhuǎn)移到另一個細胞（接合作用），如另一個細胞（接合作用），如F、Col、R質(zhì)粒等質(zhì)粒等如如Col、R的其它成員的其它成員非接合型質(zhì)粒非接合型質(zhì)粒 不能在天然條件下獨立地發(fā)生接合作用不能在天然條件下獨立地發(fā)生接合作用值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒（值得注意的是，某些非接合型質(zhì)粒（ColE1）在接合型質(zhì)粒在接合型質(zhì)粒的存在和協(xié)助下，也能發(fā)

8、生的存在和協(xié)助下，也能發(fā)生DNA轉(zhuǎn)移，這個過程由轉(zhuǎn)移，這個過程由 bom 和和mob 基因決定基因決定20060421質(zhì)粒質(zhì)粒質(zhì)粒的基本特征質(zhì)粒的基本特征攜帶特殊的遺傳標記攜帶特殊的遺傳標記野生型的質(zhì)粒野生型的質(zhì)粒DNA上往往攜帶一個或多個遺傳標記基因，這上往往攜帶一個或多個遺傳標記基因，這使得寄主生物產(chǎn)生正常生長非必需的附加性狀，包括：使得寄主生物產(chǎn)生正常生長非必需的附加性狀，包括：物質(zhì)抗性物質(zhì)抗性 抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機物抗生素、重金屬離子、毒性陰離子、有機物物質(zhì)合成物質(zhì)合成 抗生素、細菌毒素、有機堿抗生素、細菌毒素、有機堿這些標記基因?qū)@些標記基因?qū)NA重組分子的篩選具有

9、重要意義重組分子的篩選具有重要意義質(zhì)粒質(zhì)粒質(zhì)粒的構(gòu)建質(zhì)粒的構(gòu)建天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點天然存在的野生型質(zhì)粒由于分子量大、拷貝數(shù)低、單一酶切位點少、遺傳標記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往少、遺傳標記不理想等缺陷，不能滿足克隆載體的要求，因此往往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎進行人工構(gòu)建。往需要以多種野生型質(zhì)粒為基礎進行人工構(gòu)建。目前實驗室使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多是由少數(shù)幾個野生型質(zhì)粒構(gòu)目前實驗室使用的大腸桿菌質(zhì)粒大多是由少數(shù)幾個野生型質(zhì)粒構(gòu)建的：建的：pSC101 8.8 kb 拷貝數(shù)拷貝數(shù) 5 四環(huán)素抗性標記基因四環(huán)素抗性標記基因 TcrColE1 6.

10、5 kb 拷貝數(shù)拷貝數(shù) 20 - 30 大腸桿菌內(nèi)毒素標記基因大腸桿菌內(nèi)毒素標記基因 E1RSF2124 ColE1衍生質(zhì)粒衍生質(zhì)粒 氨芐青霉素抗性標記基因氨芐青霉素抗性標記基因 Apr質(zhì)粒質(zhì)粒質(zhì)粒的分類質(zhì)粒的分類人工人工構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類：構(gòu)建的質(zhì)粒根據(jù)其功能和用途可分成如下幾類： 高拷貝高拷貝質(zhì)粒質(zhì)粒 突變拷貝數(shù)控制基因突變拷貝數(shù)控制基因 拷貝數(shù)拷貝數(shù)1000-3000 擴增基因擴增基因低拷貝低拷貝質(zhì)粒質(zhì)粒 來自來自pSC101 拷貝數(shù)小于拷貝數(shù)小于10 表達某些毒性基因表達某些毒性基因溫敏溫敏質(zhì)粒質(zhì)粒 在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)、整合等不同性質(zhì)在不同溫度下表現(xiàn)出拷貝數(shù)

11、、整合等不同性質(zhì)測序測序質(zhì)粒質(zhì)粒 含有測序通用引物互補序列和多酶接頭含有測序通用引物互補序列和多酶接頭polylinker整合整合質(zhì)粒質(zhì)粒 裝有整合促進基因及位點裝有整合促進基因及位點 便于外源基因的整合便于外源基因的整合穿梭穿梭質(zhì)粒質(zhì)粒 裝有針對兩種不同受體的復制子裝有針對兩種不同受體的復制子 便于基因克隆便于基因克隆表達表達質(zhì)粒質(zhì)粒 裝有強化外源基因表達的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件裝有強化外源基因表達的轉(zhuǎn)錄、翻譯、純化的元件探針探針質(zhì)粒質(zhì)粒 裝有報告基因裝有報告基因 便于啟動子等元件的克隆篩選便于啟動子等元件的克隆篩選重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體松弛型復制松弛型復制 pBR32

12、24363 bpOrigin of ReplicationROPROISal IBamH ITcrPvu IPst IPst IEcoR ICla IHind IIIHind IIBal IAprpBR322： 氯霉素可擴增氯霉素可擴增拷貝數(shù)拷貝數(shù) 50 - 100 / cell用于基因克隆用于基因克隆 pBR322AmpTet重組 DNAAmprTcs提 取DNA 電泳AmprAmprAmprAmprTcrTcrTcAmprTcsTcs轉(zhuǎn) 化 無 菌落陽 性菌 落篩 選重 組 子2)DNA重組無 DNA插入有 DNA插入外 源DNA1)限制 酶 切EcoSacKpnSmaBamXbaSalP

13、stSphHinRI I I I HI I I I I dIIIpUC18pUC19HinSphPst SalXbaBamSmaKpnSacEcodIII I I I I HI I I I RIApOriLacZ(2.68kb)r重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pUC18 / 19： 拷貝數(shù)拷貝數(shù) 2000 - 3000 / cell用于基因克隆和測序用于基因克隆和測序 裝有多克隆位點（裝有多克隆位點（MCS）正選擇顏色標記正選擇顏色標記 lacZBamHIpUC182686 bpAprlacZoriGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCT

14、GCAGGCATGCAAGCTT396452EcoRISstIKpnISmaIXbaISalIPstISphIHindIII質(zhì)粒質(zhì)粒重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pUC18 / 19：正選擇標記正選擇標記 lacZ 的顯色原理的顯色原理pUC18/19PlaclacZMCSb b-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的a a-肽段肽段OHHHOHHOHHOHCH2OHONClBrClBrClBrONN5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚基吲哚基-b b-D-半乳糖苷半乳糖苷X-gal重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體重要的大腸桿菌質(zhì)粒載體pGEM-3Z：多拷貝多拷貝裝有兩個噬菌體的強啟動子裝有兩個噬菌體的強啟動子

15、裝有多克隆位點（裝有多克隆位點（MCS）正選擇顏色標記正選擇顏色標記 lacZ用于外源基因的高效表達用于外源基因的高效表達 注意：注意：T7和和SP6啟動子特異性地由噬菌體啟動子特異性地由噬菌體DNA編碼的編碼的RNA聚合聚合2743 bpMCSlacZPT7oriAprpGEM-3EPSP6酶所識別，因此相應的受體菌必須表達噬菌體酶所識別，因此相應的受體菌必須表達噬菌體RNA聚合酶，如聚合酶，如：E.coli BL21（DE3）等等 AmN2HlacZEcoRIHindIIIOriOri復制起點復制起點LacZAPRpUC19質(zhì)粒質(zhì)粒質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離純化的分離純化實驗室實驗室一般使用下列

16、三種方法制備質(zhì)粒一般使用下列三種方法制備質(zhì)粒DNA： 氯化銫密度梯度離心法氯化銫密度梯度離心法 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA純度高、周期長、設備要求高、溴乙錠污染純度高、周期長、設備要求高、溴乙錠污染堿溶法堿溶法 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA純度底、快速、操作簡便純度底、快速、操作簡便沸水浴法沸水浴法 質(zhì)粒質(zhì)粒DNA純度、操作周期介于純度、操作周期介于氯化銫法和堿溶法之間氯化銫法和堿溶法之間質(zhì)粒質(zhì)粒質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離純化的分離純化氯化銫密度梯度離心法：氯化銫密度梯度離心法： 用含有用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體的緩沖液懸浮菌體 加溶菌酶裂解細菌細胞壁加溶菌酶裂解細菌細胞壁 加加CsCl和和溴乙錠溴乙錠超速離心過夜超速離

17、心過夜在紫外燈下吸取在紫外燈下吸取cccDNA稀釋沉淀稀釋沉淀cccDNAproteinsocDNAL-DNAcccDNARNAs質(zhì)粒質(zhì)粒質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離純化的分離純化堿溶法：堿溶法： 用含有用含有EDTA的緩沖液懸浮菌體的緩沖液懸浮菌體 加溶菌酶裂解細菌細胞壁加溶菌酶裂解細菌細胞壁 加加NaOH和和SDS的混合溶液，去膜釋放內(nèi)含物的混合溶液，去膜釋放內(nèi)含物 加高濃度的醋酸鉀溶液，沉淀染色體，去除染加高濃度的醋酸鉀溶液，沉淀染色體，去除染色體色體DNA及大部分蛋白質(zhì)及大部分蛋白質(zhì) 離心取上清液，用苯酚離心取上清液，用苯酚- -氯仿萃取，去除痕量的蛋白質(zhì)氯仿萃取，去除痕量的蛋白質(zhì)乙醇或異丙醇

18、沉淀水相質(zhì)粒乙醇或異丙醇沉淀水相質(zhì)粒DNA用無用無DNase的的RNase去除殘余的去除殘余的RNA cccDNAL-DNAocDNAD-DNAT-DNA質(zhì)粒質(zhì)粒質(zhì)粒質(zhì)粒DNA的分離純化的分離純化沸水浴法：沸水浴法： 用含有用含有EDTA和和Triton X-100的緩沖液懸浮菌體的緩沖液懸浮菌體 加溶菌酶裂解細菌細胞壁加溶菌酶裂解細菌細胞壁 沸水浴沸水浴40秒鐘秒鐘離心，用無菌牙簽挑去沉淀物離心，用無菌牙簽挑去沉淀物 乙醇或異丙醇沉淀質(zhì)粒乙醇或異丙醇沉淀質(zhì)粒DNA噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA噬菌體或病毒是一類非細胞微生物，能高效率高特異性地侵染噬菌體或病毒是一類非細胞微生物，能高效率高特異

19、性地侵染宿主細胞，然后或自主復制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏宿主細胞，然后或自主復制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來，而且在一定的條件下上述兩種狀態(tài)還會相互轉(zhuǎn)化。起來，而且在一定的條件下上述兩種狀態(tài)還會相互轉(zhuǎn)化。噬菌體或病毒的上述特性使得它們的噬菌體或病毒的上述特性使得它們的DNA能被開發(fā)成為基因工能被開發(fā)成為基因工程的有用載體，因為：程的有用載體，因為：高效率的感染性能使外源基因高效導入受體細胞高效率的感染性能使外源基因高效導入受體細胞自主復制繁殖性能使外源基因在受體細胞中高效擴增自主復制繁殖性能使外源基因在受體細胞中高效擴增噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的大腸桿菌的 l l 噬

20、菌體噬菌體DNAl l 噬菌體的生物學特性：噬菌體的生物學特性： 生物結(jié)構(gòu)生物結(jié)構(gòu)l l 噬菌體是噬菌體是大腸桿菌的溫和型噬菌體大腸桿菌的溫和型噬菌體l l 噬菌體噬菌體由外殼包裝蛋白和由外殼包裝蛋白和l l-DNA組組成成 l l-DNA全長全長48502個核苷酸個核苷酸l l-DNA上上至少有至少有61個基因個基因l l 噬菌體生物學特性：噬菌體生物學特性： 生物結(jié)構(gòu)生物結(jié)構(gòu)5 TCCAGCGGCGGGG33CCCGCCGCTGGA 5 COSCOScos頭部合成基因頭部合成基因尾部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因溶菌控制基因晚期控制基因晚期控制基因DNA合成控制合成控制基因基因阻遏基因阻

21、遏基因早期控制基因早期控制基因阻遏基因阻遏基因重組基因重組基因刪除與整合基因刪除與整合基因l - DNA噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的大腸桿菌的 l l 噬菌體噬菌體DNAl l 噬菌體生物學特性：噬菌體生物學特性： 感染周期感染周期E.coli吸附吸附LamB受體受體注入注入復制復制包裝包裝裂解裂解噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的大腸桿菌的 l l 噬菌體噬菌體DNAl l 噬菌體生物學特性：噬菌體生物學特性： 感染周期感染周期體內(nèi)包裝體內(nèi)包裝100個左右的拷貝個左右的拷貝包裝范圍為原包裝范圍為原DNA的的75 - 105%即即 36 - 51 kbDA包裝范圍為原包裝范圍

22、為原DNA的的75 - 105%即即 36 - 51 kb噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的大腸桿菌的 l l 噬菌體噬菌體DNAl l 噬菌體生物學特性：噬菌體生物學特性： 溶原狀態(tài)溶原狀態(tài) l l噬菌體感染大腸桿菌后，除能裂解細胞外，也可能將其噬菌體感染大腸桿菌后，除能裂解細胞外，也可能將其DNA直接整合到宿主細胞的染色體直接整合到宿主細胞的染色體DNA上，并不產(chǎn)生子代噬上，并不產(chǎn)生子代噬菌體顆粒，這種情況為菌體顆粒，這種情況為溶原狀態(tài)溶原狀態(tài)。整合主要由。整合主要由l l-DNA上的上的cI和和int兩基因的產(chǎn)物所激活，而這兩個基因的開放與關閉又取決于兩基因的產(chǎn)物所激活，而這兩個基

23、因的開放與關閉又取決于宿主細胞本身的性質(zhì)。人們可以根據(jù)需要改變宿主細胞本身的性質(zhì)。人們可以根據(jù)需要改變l l-DNA或宿主細或宿主細胞的性質(zhì)，使噬菌體或處于胞的性質(zhì)，使噬菌體或處于溶原狀態(tài)溶原狀態(tài)，或處于裂解狀態(tài)，或處于裂解狀態(tài) DNA重組技術一般需要重組技術一般需要l l噬菌體進入溶原狀態(tài)噬菌體進入溶原狀態(tài)噬菌體整個基因組如圖所示，可分為三個部分噬菌體整個基因組如圖所示，可分為三個部分n 左臂：從左臂：從A到到J長約長約20kb，其中的基因編碼構(gòu)成頭部、尾，其中的基因編碼構(gòu)成頭部、尾部、尾絲對組裝完整噬菌體所需要的蛋白質(zhì)。部、尾絲對組裝完整噬菌體所需要的蛋白質(zhì)。n中段：長約中段：長約20kb

24、，是，是DNA整合和切出，溶原生長所需的整合和切出，溶原生長所需的序列。序列。n右臂：長約右臂：長約10kb，是調(diào)控區(qū)，控制溶菌和溶原生長最重要，是調(diào)控區(qū)，控制溶菌和溶原生長最重要的調(diào)控基因和序列、以及的調(diào)控基因和序列、以及DNA復制起始均在這區(qū)域內(nèi)。左復制起始均在這區(qū)域內(nèi)。左右臂包含右臂包含DNA復制、噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白合成、組裝成熟噬菌復制、噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白合成、組裝成熟噬菌體、溶菌生長所需全部序列；對溶菌生長來說，中段是非必體、溶菌生長所需全部序列；對溶菌生長來說，中段是非必需的。需的。 噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的大腸桿菌的 l l 噬菌體噬菌體DNAl l-DNA載體的構(gòu)建：載

25、體的構(gòu)建：縮短長度縮短長度 野生型野生型l l-DNA包裝的上限為包裝的上限為51kb，本身長度為本身長度為48.5kb，只有只有當插入的外源當插入的外源DNA片段不大于片段不大于2.5kb時時，才能被包裝成有感染，才能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型力的噬菌體顆粒。因此縮短野生型l l-DNA的長度的長度，可以提高裝，可以提高裝載量。其實野生型載量。其實野生型l l-DNA上約有上約有40-50%的片段是復制和裂解的片段是復制和裂解所非必需的。根據(jù)切除的多少，可將所非必需的。根據(jù)切除的多少，可將l l-DNA分成兩大類載體：分成兩大類載體： 插入型載體插入型載體取代型載體取代型載

26、體 噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的大腸桿菌的 l l 噬菌體噬菌體DNAl l-DNA載體的構(gòu)建：載體的構(gòu)建：縮短長度縮短長度 插入型載體插入型載體體外包裝體外包裝插入位點插入位點體外包裝體外包裝插入片段插入片段載體長度載體長度 37 kb插入片段大?。翰迦肫未笮。? - 14 kb（51 37）噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的大腸桿菌的 l l 噬菌體噬菌體DNAl l-DNA載體的構(gòu)建：載體的構(gòu)建：縮短長度縮短長度 取代型載體（置換型載體）取代型載體（置換型載體）體外包裝體外包裝體外包裝體外包裝插入片段插入片段最小裝載長度最小裝載長度 10 kb（51 26）載體長度載

27、體長度 26 kb插入片段插入片段最大裝載長度最大裝載長度 25 kb（36 26）n允許外源允許外源 DNA 片段替換非必須片段替換非必須 DNA 片段的載體，稱為片段的載體，稱為置換型載體（置換型載體（replacement vectors）。一般情況下，置）。一般情況下，置換型載體克隆外源片段的大小范圍是換型載體克隆外源片段的大小范圍是 9-23kb ，故而該載，故而該載體主要用來構(gòu)建基因組文庫。體主要用來構(gòu)建基因組文庫。 噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的大腸桿菌的 l l 噬菌體噬菌體DNAl l-DNA載體的構(gòu)建：載體的構(gòu)建：刪除重復的酶切位點刪除重復的酶切位點野生型的野生型

28、的l l-DNA鏈上有鏈上有5個個EcoRI位點和位點和7個個HindIII位點，位點，不不利于重組操作，必須刪除至利于重組操作，必須刪除至1 - 2個個同時，為了便于各種來源的同時，為了便于各種來源的DNA片段的克隆，還需要增加一片段的克隆，還需要增加一些單一的酶切位點些單一的酶切位點除了簡單的切割外，還需要采用定點突變技術去除或增添酶除了簡單的切割外，還需要采用定點突變技術去除或增添酶位點位點噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的大腸桿菌的 l l 噬菌體噬菌體DNAl l-DNA載體的構(gòu)建：載體的構(gòu)建：加裝選擇標記加裝選擇標記與質(zhì)粒不同，野生型與質(zhì)粒不同，野生型l l-DNA上缺少合適

29、的選擇標記，因此上缺少合適的選擇標記，因此加裝加裝選擇標記是選擇標記是l l-DNA克隆載體構(gòu)建的重要內(nèi)容克隆載體構(gòu)建的重要內(nèi)容l l-DNA克隆載體上的選擇標記主要有下列兩類：克隆載體上的選擇標記主要有下列兩類：免疫功能類標記免疫功能類標記顏色反應類標記顏色反應類標記噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的大腸桿菌的 l l 噬菌體噬菌體DNAl l-DNA載體的構(gòu)建：載體的構(gòu)建：加裝選擇標記加裝選擇標記 imm434imm434基因編碼一種阻止基因編碼一種阻止l l-噬菌體噬菌體進入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標記進入溶菌循環(huán)的阻遏物。含有完整標記基因的基因的l l-載體進入受體細胞后，建立

30、溶載體進入受體細胞后，建立溶原狀態(tài)，細菌生長緩慢，形成渾濁斑；原狀態(tài)，細菌生長緩慢，形成渾濁斑；當外源當外源DNA插入到標記基因中，基因滅插入到標記基因中，基因滅活，活， l l-重組分子便進入溶菌循環(huán)，形成重組分子便進入溶菌循環(huán)，形成透明斑透明斑噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的大腸桿菌的 l l 噬菌體噬菌體DNAl l-DNA載體的構(gòu)建：載體的構(gòu)建：加裝選擇標記加裝選擇標記 lacZlacZ基因編碼基因編碼b b-半乳糖苷酶，能催化半乳糖苷酶，能催化無色的無色的X-gal生成藍色化合物。當外源基生成藍色化合物。當外源基因插入到因插入到lacZ基因中，基因滅活，不能基因中，基因滅活，

31、不能合成藍色化合物；而空載體合成藍色化合物；而空載體l l-DNA則產(chǎn)則產(chǎn)生藍色透明斑生藍色透明斑噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的大腸桿菌的 l l 噬菌體噬菌體DNAl l-DNA載體的構(gòu)建：載體的構(gòu)建：構(gòu)建琥珀密碼子的突變體構(gòu)建琥珀密碼子的突變體 琥珀型突變（琥珀型突變（sup) )是指由是指由CAG（Gln）向向UAG（stop）的突變。的突變。大腸桿菌的某些菌株含有特異性的校正基因，其編碼產(chǎn)物校正大腸桿菌的某些菌株含有特異性的校正基因，其編碼產(chǎn)物校正tRNA能專一性地糾正這一突變。能專一性地糾正這一突變。將野生型將野生型l l-DNA上上D和和E兩個頭部包裝蛋白的基因中的兩個頭

32、部包裝蛋白的基因中的CAG密碼密碼子突變成子突變成UAG。當這種當這種l l-DNA進入一般的大腸桿菌菌株后，不進入一般的大腸桿菌菌株后，不能合成有活性的頭部蛋白，也就不能被包裝和裂解細菌，這樣就能合成有活性的頭部蛋白，也就不能被包裝和裂解細菌，這樣就可以阻止有害重組體的生物污染及擴散，而基因工程實驗中使用可以阻止有害重組體的生物污染及擴散，而基因工程實驗中使用的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌株的受體則是具有琥珀型突變體校正功能的菌株 噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的大腸桿菌的 l l 噬菌體噬菌體DNAl l-DNA載體的主要類型：載體的主要類型：插入滅活型載體插入滅活型載體C

33、haron2、Charon6、l lgt11取代型載體取代型載體l lEMBL4、l lgtl lc、l lNM762、Charon40正選擇型載體正選擇型載體l lEMBL1、l lL47、l l1059野生型的野生型的l l噬菌體不能在噬菌體不能在P2噬菌體溶源性噬菌體溶源性的細菌中繁殖（的細菌中繁殖（Spi+），），這種生長抑制表型受這種生長抑制表型受l l-DNA上的上的red和和gam兩個基因控制。若將外兩個基因控制。若將外源源DNA取代取代red和和gam，重組重組噬菌體便擁有噬菌體便擁有Spi-表型，能在表型，能在P2噬菌噬菌體體溶源性溶源性的大腸桿菌受體菌中繁殖，并形成透明斑的

34、大腸桿菌受體菌中繁殖，并形成透明斑噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的大腸桿菌的 l l 噬菌體噬菌體DNAl l-DNA重組分子的體外包裝：重組分子的體外包裝：l l-DNA重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆重組分子需在體外人工包裝成有感染力的噬菌體重組顆粒，方可高效導入受體細胞粒，方可高效導入受體細胞用于體外包裝的蛋白質(zhì)可直接從感染了用于體外包裝的蛋白質(zhì)可直接從感染了l l噬菌體的大腸桿菌中提噬菌體的大腸桿菌中提取，現(xiàn)已商品化。這些包裝蛋白通常分為相互互補的兩部分：取，現(xiàn)已商品化。這些包裝蛋白通常分為相互互補的兩部分：一部分缺少一部分缺少E組份，另一部分則缺少組份，另一部

35、分則缺少D組份。包裝時，當且僅當組份。包裝時，當且僅當這兩部分包裝蛋白與重組這兩部分包裝蛋白與重組l l-DNA分子混合后，包裝才能有效進分子混合后，包裝才能有效進行，任何一種蛋白包裝液被重組行，任何一種蛋白包裝液被重組l l-DNA污染后，均不能被包裝污染后，均不能被包裝成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安全而設計的成有感染力的噬菌體顆粒，這也是基于安全而設計的噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的大腸桿菌的 l l 噬菌體噬菌體DNAl l-DNA及其重組分子的分離純化：及其重組分子的分離純化：將大腸桿菌在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期將大腸桿菌在含有麥芽糖的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長

36、期 加入加入l l噬菌體或重組噬菌體或重組l l噬菌體的懸浮液，噬菌體的懸浮液，37培養(yǎng)培養(yǎng)1小時小時 用新鮮培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)用新鮮培養(yǎng)基稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)4 -12小時。這時噬菌體顆粒小時。這時噬菌體顆粒 密度已達密度已達1013 -1014 / L，大腸桿菌細胞已完全裂解大腸桿菌細胞已完全裂解 超速離心，沉淀噬菌體超速離心，沉淀噬菌體 苯酚抽提，釋放苯酚抽提，釋放l l-DNA 乙醇或異丙醇沉淀乙醇或異丙醇沉淀l l-DNA 噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的大腸桿菌的 l l 噬菌體噬菌體DNAl l-DNA作為載體的優(yōu)點：作為載體的優(yōu)點：l l-DNA可在體外包裝成噬菌體顆粒，能

37、高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌可在體外包裝成噬菌體顆粒，能高效轉(zhuǎn)染大腸桿菌 l l-DNA載體的裝載能力為載體的裝載能力為25 kb，遠遠大于質(zhì)粒的裝載量遠遠大于質(zhì)粒的裝載量 重組重組l l-DNA分子分子的篩選較為方便的篩選較為方便 重組重組l l-DNA分子的提取較為簡便分子的提取較為簡便 l l-DNA載體適合克隆和擴增外源載體適合克隆和擴增外源DNA片段，但不適合表達片段，但不適合表達 外源基因外源基因n表達載體表達載體 pET-5a 是典型的是典型的 pET 載體，其組成是在載體的載體，其組成是在載體的基本結(jié)構(gòu)的基礎上加入了基本結(jié)構(gòu)的基礎上加入了 T7 噬菌體啟動子序列及其下游的噬菌體啟動子序列及

38、其下游的幾個酶切位點。當外源基因插入到這些酶切位點后，就可幾個酶切位點。當外源基因插入到這些酶切位點后，就可在特定的宿主細胞中誘導表達。在特定的宿主細胞中誘導表達。 噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的大腸桿菌的M13單鏈噬菌體單鏈噬菌體DNAM13噬菌體的生物學特性：噬菌體的生物學特性： 生物結(jié)構(gòu)生物結(jié)構(gòu)M13噬菌體的外型呈絲狀噬菌體的外型呈絲狀M13 噬菌體噬菌體由外殼包裝蛋白和由外殼包裝蛋白和正正鏈鏈DNA組成組成 M13 DNA全長全長6407個核苷酸個核苷酸M13 DNA上上至少有至少有10個基因個基因2700個外殼蛋白分子個外殼蛋白分子M13 噬菌體噬菌體不裂解宿主細胞，但抑制

39、其生長不裂解宿主細胞，但抑制其生長 nM13 噬菌體顆粒是絲狀的，只感染雄性大腸桿菌。感染噬菌體顆粒是絲狀的，只感染雄性大腸桿菌。感染宿主后不裂解宿主細胞，而是從感染的細胞中分泌出噬宿主后不裂解宿主細胞，而是從感染的細胞中分泌出噬菌體顆粒，宿主細胞仍能繼續(xù)生長和分裂。菌體顆粒，宿主細胞仍能繼續(xù)生長和分裂。M13 噬菌體的基因組為單鏈噬菌體的基因組為單鏈 DNA ，由，由 6407 的堿基組成的堿基組成 （GenBank 注冊號為注冊號為 V00604） ?；蚪M?；蚪M 90% 以上的序列可編以上的序列可編碼蛋白質(zhì)，共有碼蛋白質(zhì)，共有 11 個編碼基因個編碼基因，基因之間的間隔區(qū)多為幾個，基因

40、之間的間隔區(qū)多為幾個堿基。較大的間隔位于基因堿基。較大的間隔位于基因 和基因和基因 以及基因以及基因 和基因和基因 之間，其間有調(diào)節(jié)基因表達之間，其間有調(diào)節(jié)基因表達和和 DNA 合成的元件。合成的元件。M13 噬菌體基因組可編碼噬菌體基因組可編碼 3 類類蛋白質(zhì)，包括復制蛋白（基因蛋白質(zhì)，包括復制蛋白（基因 ， 和和 ），形態(tài)發(fā)生蛋白），形態(tài)發(fā)生蛋白（基因（基因， 和和 ），結(jié)構(gòu)蛋），結(jié)構(gòu)蛋白（基因白（基因 、 和和 ）?；蚪M）?；蚪M DNA 為正鏈，按為正鏈，按基因基因 至基因至基因 方向合成，方向合成，與噬菌體的與噬菌體的 mRNA 序列同義。序列同義。 nM13 噬菌體顆粒為絲狀長管

41、噬菌體顆粒為絲狀長管狀結(jié)構(gòu)，長狀結(jié)構(gòu)，長 880nm ，直徑，直徑 6-7nm 。噬菌體顆粒的核心。噬菌體顆粒的核心由由 2700 個基因個基因 編碼的結(jié)編碼的結(jié)構(gòu)蛋白呈管狀排列而成，成構(gòu)蛋白呈管狀排列而成，成熟的基因熟的基因 的產(chǎn)物為由的產(chǎn)物為由 50 個氨基酸殘基組成的個氨基酸殘基組成的 螺旋螺旋蛋白。頂端由蛋白。頂端由 5 個基因個基因 和和 5 個基因個基因 產(chǎn)物組成，作用產(chǎn)物組成，作用于間隔區(qū)中的包裝信號。于間隔區(qū)中的包裝信號。 5 個基因個基因 蛋白和蛋白和 5 個基因個基因 蛋白位于絲桿的末端，參蛋白位于絲桿的末端，參與對性纖毛的吸咐。右圖是與對性纖毛的吸咐。右圖是 M13 噬菌

42、體結(jié)構(gòu)模型。噬菌體結(jié)構(gòu)模型。噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的大腸桿菌的M13單鏈噬菌體單鏈噬菌體DNAM13噬菌體的生物學特性：噬菌體的生物學特性： 感染周期感染周期+ DNA（+）DNARFDNARFDNARFDNA- DNAIIV在宿主細胞內(nèi)，感染性的單鏈噬菌體 DNA （正鏈）在宿主酶的作用下轉(zhuǎn)變成環(huán)狀雙鏈 DNA ，用于 DNA 的復制，因此這種雙鏈 DNA 稱為復制型 DNA （replicative form DNA） ，即 RF DNA 。通過 復制方式， RF DNA 進行擴增，基因的轉(zhuǎn)錄也隨即開始。基因組中的任意一個啟動子都可以啟動基因的轉(zhuǎn)錄，單方向地終止于下游的終止

43、子。啟動子和終止子的位置關系使得靠近終止子的基因轉(zhuǎn)錄更頻繁。 n單鏈單鏈 DNA 的酶切和連接是比較困難的，因此的酶切和連接是比較困難的，因此 M13 噬菌噬菌體在用作載體時是利用其雙鏈狀態(tài)的體在用作載體時是利用其雙鏈狀態(tài)的 RF DNA。RF DNA 很容易從感染細胞中純化出來，可以象質(zhì)粒一樣進很容易從感染細胞中純化出來，可以象質(zhì)粒一樣進行操作，并可通過轉(zhuǎn)化方法再次導入細胞。行操作，并可通過轉(zhuǎn)化方法再次導入細胞。 噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的大腸桿菌的M13單鏈噬菌體單鏈噬菌體DNAM13 DNA載體的構(gòu)建：載體的構(gòu)建：III VI I IV II X V VII IX VIII

44、野生型野生型M13RF-DNAIII VI I IV II X V VII IX VIIIM13mp系列載體系列載體lacZpolylinker噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA大腸桿菌的大腸桿菌的M13單鏈噬菌體單鏈噬菌體DNAM13 DNA載體的特點：載體的特點：使克隆的使克隆的DNA片段以特定單鏈的形式輸出受體細胞外片段以特定單鏈的形式輸出受體細胞外這在這在DNA定向突變中非常有用定向突變中非常有用M13重組分子篩選簡便重組分子篩選簡便被被M13噬菌體感染的受體細胞生長緩慢，形成混噬菌體感染的受體細胞生長緩慢，形成混濁斑，易于辨認挑選。而且重組分子越大，混濁濁斑，易于辨認挑選。而且重組分子越

45、大，混濁斑的混濁度亦越大斑的混濁度亦越大 但但M13-DNA載體的最大缺陷是裝載量小，只有載體的最大缺陷是裝載量小，只有1.5 kb噬菌體或病毒噬菌體或病毒DNA 與動植物受體細胞相適應的載體一般選擇相應動植物的病與動植物受體細胞相適應的載體一般選擇相應動植物的病 毒基因組毒基因組DNA。 動植物病毒種類繁多，每一種動植物都有多種特異性的病動植物病毒種類繁多，每一種動植物都有多種特異性的病毒。毒。按照基因組的結(jié)構(gòu)，可將動植物病毒分成四大類：按照基因組的結(jié)構(gòu)，可將動植物病毒分成四大類： 單鏈單鏈DNA病毒病毒雙鏈雙鏈DNA病毒病毒單鏈單鏈RNA病毒病毒雙鏈雙鏈RNA病毒病毒 RNA病毒在自我復制

46、時大多存在相應的病毒在自我復制時大多存在相應的DNA中間反應物，中間反應物，這些中間體可作為載體進行常規(guī)的這些中間體可作為載體進行常規(guī)的DNA重組重組?？妓官|(zhì)粒與噬菌?？妓官|(zhì)粒與噬菌粒 l l-DNA載體和載體和M13-DNA載體的裝載量最大分別為載體的裝載量最大分別為25 kb和和1.5 kb，但在很多情況下，往往需要但在很多情況下，往往需要克隆更大的外源克隆更大的外源DNA片段，片段， 考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的構(gòu)建就是為了進一步提高噬菌體考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的構(gòu)建就是為了進一步提高噬菌體DNA的裝載量。的裝載量。 在包裝上限固定的條件下，大幅度縮短噬菌體在包裝上限固定的條件下，大幅度縮短噬菌

47、體DNA的長度，的長度，就能同步增加載體的裝載能力。將噬菌體就能同步增加載體的裝載能力。將噬菌體DNA與包裝有關的序與包裝有關的序列與質(zhì)粒組裝在一起，既能最大限度地縮短載體的長度，同時列與質(zhì)粒組裝在一起，既能最大限度地縮短載體的長度，同時又能保證重組又能保證重組DNA分子在體外仍被包裝成有感染力的顆粒，這分子在體外仍被包裝成有感染力的顆粒，這便是構(gòu)建考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的思路。當然，由于考斯質(zhì)粒便是構(gòu)建考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的思路。當然，由于考斯質(zhì)粒和噬菌粒不再攜帶包裝蛋白基因，因此重組和噬菌粒不再攜帶包裝蛋白基因，因此重組DNA分子在細胞內(nèi)分子在細胞內(nèi)不能形成噬菌體顆粒。不能形成噬菌體顆粒。n

48、粘粒（粘粒（cosmid）實際是質(zhì)粒的衍生物，是帶有）實際是質(zhì)粒的衍生物，是帶有 cos 序序列的質(zhì)粒。列的質(zhì)粒。 cos 序列是序列是 l l 噬菌體噬菌體 DNA 中將中將 DNA 包裝到包裝到噬菌體顆粒中所需的噬菌體顆粒中所需的 DNA 序列。序列。n粘粒的組成包括質(zhì)粒復制起點（粘粒的組成包括質(zhì)粒復制起點（colE1），抗性標記（），抗性標記（ampr），）， cos 位點，因而能象質(zhì)粒一樣轉(zhuǎn)化和增殖。它位點，因而能象質(zhì)粒一樣轉(zhuǎn)化和增殖。它的大小一般的大小一般 5-7kb 左右，用來克隆大片段左右，用來克隆大片段 DNA ，克隆，克隆的最大的最大 DNA 片段可達片段可達 45kb 。有

49、的粘粒載體含有兩個。有的粘粒載體含有兩個 cos 位點，在某種程度上可提高使用效率。位點，在某種程度上可提高使用效率。考斯質(zhì)粒與噬菌?？妓官|(zhì)粒與噬菌?？妓官|(zhì)粒（考斯質(zhì)粒（cosmid）考斯質(zhì)粒載體的構(gòu)建：考斯質(zhì)粒載體的構(gòu)建：考斯質(zhì)粒是一類人工構(gòu)建的含有考斯質(zhì)粒是一類人工構(gòu)建的含有1978年年Collins和和Hohn發(fā)明構(gòu)建發(fā)明構(gòu)建pHC796400 bpTcrl l fragmentcosoriAprPstIBamHISalIl l-DNA cos序列和序列和質(zhì)粒復制子的質(zhì)粒復制子的特殊類型的載體特殊類型的載體cos site - carrying plasmid1.8 kb的的l l-DN

50、A片段片段 + pBR322片段片段裝載范圍為裝載范圍為31 - 45 kb考斯質(zhì)粒與噬菌?？妓官|(zhì)粒與噬菌?？妓官|(zhì)粒（考斯質(zhì)粒（cosmid）考斯質(zhì)粒載體的特點：考斯質(zhì)粒載體的特點：能像能像l l-DNA那樣進行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細胞那樣進行體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細胞 裝載量大（裝載量大（45 kb）且克隆片段具有一定的大小范圍且克隆片段具有一定的大小范圍能像質(zhì)粒那樣在受體細胞能像質(zhì)粒那樣在受體細胞中自主復制中自主復制重組操作簡便，篩選容易重組操作簡便，篩選容易不能體內(nèi)包裝，不裂解不能體內(nèi)包裝，不裂解受體細胞受體細胞考斯質(zhì)粒與噬菌?？妓官|(zhì)粒與噬菌粒噬菌粒（噬菌粒（phagemid or

51、 phasmid）噬菌粒載體的特點：噬菌粒載體的特點：噬菌粒是一類人工構(gòu)建的含有單鏈噬菌體噬菌粒是一類人工構(gòu)建的含有單鏈噬菌體包裝序列、復制子包裝序列、復制子以及以及質(zhì)粒復制子、克隆位點、標記基因的特殊類型的載體質(zhì)粒復制子、克隆位點、標記基因的特殊類型的載體能像能像M13-DNA那樣體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細胞那樣體外包裝，并高效轉(zhuǎn)染受體細胞 裝載量比常規(guī)的裝載量比常規(guī)的M13mp系列要大很多（系列要大很多（10 kb）能像質(zhì)粒那樣在受體細胞能像質(zhì)粒那樣在受體細胞中自主復制中自主復制重組操作簡便，篩選容易重組操作簡便，篩選容易通過克隆雙鏈通過克隆雙鏈DNA能獲得同等長度的單一單鏈能獲得同等長度

52、的單一單鏈DNA考斯質(zhì)粒與噬菌?？妓官|(zhì)粒與噬菌粒噬菌粒（噬菌粒（phagemid or phasmid）重要的噬菌粒載體：重要的噬菌粒載體：pUC118 / 119pUC118 pUC18 + M13間隔區(qū)間隔區(qū) IGpUC119 pUC19 + M13間隔區(qū)間隔區(qū) IG500 個拷貝個拷貝3200 bpMCSlacZlacIoriAprM13-MGpUC118 / 119表示表示M13輔助噬菌體輔助噬菌體DNA考斯質(zhì)粒與噬菌?？妓官|(zhì)粒與噬菌粒噬菌粒（噬菌粒（phagemid or phasmid）重要的噬菌粒載體：重要的噬菌粒載體：pBluescript 體外轉(zhuǎn)錄載體體外轉(zhuǎn)錄載體pBlues

53、cript = pUC + f1-ori + PT3 + PT72958 bpMCSlacZPT7oriAprf1-oripBluescriptPT3噬菌體啟動子噬菌體啟動子PT3和和PT7強化外強化外源基因的轉(zhuǎn)錄源基因的轉(zhuǎn)錄提取出來的單鏈提取出來的單鏈DNA重組分重組分子子在噬菌體在噬菌體RNA聚合酶的存聚合酶的存在下，又可實現(xiàn)外源基因在下，又可實現(xiàn)外源基因的體外轉(zhuǎn)錄的體外轉(zhuǎn)錄n人們設計出一些多功能的質(zhì)粒載體，這人們設計出一些多功能的質(zhì)粒載體，這類質(zhì)粒載體有多克隆位點、類質(zhì)粒載體有多克隆位點、 -互補、互補、噬菌體啟動子和單鏈噬菌體的復制與包噬菌體啟動子和單鏈噬菌體的復制與包裝信號。裝信號。

54、n典型的這類質(zhì)粒有典型的這類質(zhì)粒有 pBluescriptKS（），這類質(zhì)粒一般由），這類質(zhì)粒一般由 4 個質(zhì)粒組成一個質(zhì)粒組成一套系統(tǒng)，其差別在于多克隆位點方向相套系統(tǒng)，其差別在于多克隆位點方向相反（根據(jù)多克隆位點兩端反（根據(jù)多克隆位點兩端 Kpn 和和 Sac 的順序，用的順序，用 KS 或或 SK 表示），表示），或單鏈噬菌體的復制啟始方向相反（或或單鏈噬菌體的復制啟始方向相反（或者說，引導者說，引導 DNA 雙鏈中不同鏈合成單雙鏈中不同鏈合成單鏈鏈 DNA ，用，用 + 或或 - 表示）。表示）。 pBluescriptKS（） 的多克隆位點的多克隆位點與與 pUC18/19 的不同，

55、且使用的不同，且使用 f1 噬菌噬菌體的復制與包裝信號序列體的復制與包裝信號序列 。 人造染色體載體人造染色體載體 人類、動物、植物的全基因組序列分析往往人類、動物、植物的全基因組序列分析往往需要需要克隆數(shù)百克隆數(shù)百甚至上千甚至上千 kb 的的DNA片段，片段， 此時考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的裝載此時考斯質(zhì)粒和噬菌粒載體的裝載量也遠遠不能滿足需要。量也遠遠不能滿足需要。 將細菌接合因子或酵母菌染色體上的復制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)將細菌接合因子或酵母菌染色體上的復制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起，即可構(gòu)成染色體載體。當大片段的外定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起，即可構(gòu)成染色體載體。當大片段的外源源DNA克隆在這些染

56、色體載體上后，便形成重組人造染色體，克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體，它能像天然染色體那樣，在受體細胞中穩(wěn)定的復制并遺傳。它能像天然染色體那樣，在受體細胞中穩(wěn)定的復制并遺傳。 目前常用的人造染色體載體包括：目前常用的人造染色體載體包括：細菌人造染色體（細菌人造染色體（BAC）酵母人造染色體（酵母人造染色體（YAC）人造染色體載體人造染色體載體細菌人造染色體（細菌人造染色體（Bacterial Artificial Chromosomes BAC）細菌人造染色體通常是在大腸桿菌性因子細菌人造染色體通常是在大腸桿菌性因子F質(zhì)粒的基礎上質(zhì)粒的基礎上構(gòu)建的，其裝載量范圍在構(gòu)建的，其裝載量

57、范圍在50 - 300 kb之間之間各種類型的各種類型的pBACs在大腸桿菌受體菌只能維持單一拷貝在大腸桿菌受體菌只能維持單一拷貝pBACs主要適用于：主要適用于：克隆大型基因簇（克隆大型基因簇（gene cluster）結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)構(gòu)建動植物基因文庫構(gòu)建動植物基因文庫F 質(zhì)粒質(zhì)粒n大腸桿菌的大腸桿菌的 F 因子是一個約因子是一個約 100kb 的質(zhì)粒。它編碼的質(zhì)粒。它編碼60多多種參與復制、分配和接合過程的蛋白質(zhì)（種參與復制、分配和接合過程的蛋白質(zhì)（Willetts and Skurray，1987）。）。n雖然雖然F因子通常以雙鏈閉環(huán)因子通常以雙鏈閉環(huán)DNA（1-2個拷貝個拷貝/細胞）的形細胞

58、）的形式存在，但它可以在大腸桿菌染色體中至少式存在，但它可以在大腸桿菌染色體中至少30個位點處個位點處進行隨機整合（進行隨機整合（Low，1987）。）。n攜帶攜帶F因子的細胞，或以游離狀態(tài)或以整合狀態(tài)表達三根因子的細胞，或以游離狀態(tài)或以整合狀態(tài)表達三根發(fā)樣狀的發(fā)樣狀的F菌毛。菌毛。F菌毛為供體與受體細胞之間產(chǎn)生性接菌毛為供體與受體細胞之間產(chǎn)生性接觸所必需。觸所必需。n細菌人工染色體是基于大腸桿菌的細菌人工染色體是基于大腸桿菌的 F 質(zhì)粒構(gòu)建的，高通質(zhì)粒構(gòu)建的，高通量低拷貝的質(zhì)粒載體。量低拷貝的質(zhì)粒載體。n每個環(huán)狀每個環(huán)狀 DNA 分子中攜帶一個抗生素抗性標記，一個來分子中攜帶一個抗生素抗性標

59、記，一個來源于大腸桿菌源于大腸桿菌 F 因子（致育因子）的嚴謹型控制的復制因子（致育因子）的嚴謹型控制的復制子子 oriS （ Shizuya et al. 1992 ），一個易于），一個易于 DNA 復制復制的由的由 ATP 驅(qū)動的解旋酶（驅(qū)動的解旋酶（ （RepE） 以及三個確保低拷以及三個確保低拷貝質(zhì)粒精確分配至子代細胞的基因座貝質(zhì)粒精確分配至子代細胞的基因座 （ parA , parB , 和和 parC ） 。 nBAC 載體的低拷貝性可以避免嵌合體的產(chǎn)生，減小外源載體的低拷貝性可以避免嵌合體的產(chǎn)生，減小外源基因的表達產(chǎn)物對宿主細胞的毒副作用?；虻谋磉_產(chǎn)物對宿主細胞的毒副作用。20

60、060424真核生物載體真核生物載體n電穿孔技術是利用脈沖電場改變細胞膜的電穿孔技術是利用脈沖電場改變細胞膜的狀態(tài)和通透性，達到將狀態(tài)和通透性，達到將DNA導入細胞以及導入細胞以及促使細胞發(fā)生融合的目的。促使細胞發(fā)生融合的目的。n該技術目前一方面應用于細菌、真菌、植該技術目前一方面應用于細菌、真菌、植物、昆蟲和哺乳動物細胞的基因轉(zhuǎn)移，另物、昆蟲和哺乳動物細胞的基因轉(zhuǎn)移，另一方面應用于細胞融合制備雜交細胞和動一方面應用于細胞融合制備雜交細胞和動物克隆等。物克隆等。 顯微注射技術將外源顯微注射技術將外源DNA注入細胞注入細胞基因槍技術基因槍技術n是一種將核酸直接發(fā)送至細胞內(nèi)是一種將核酸直接發(fā)送至細