弓形蟲環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增快速檢測(cè)方法的建立_圖文

1、弓 形 蟲 環(huán) 介導(dǎo) 等 溫 擴(kuò) 增快 速檢 測(cè) 方 法的 建 立李月梅 , 薛書江 , 其木格 , 邢 瑩 , 張守發(fā) 3(延邊大學(xué)農(nóng)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系 , 吉林 龍井 133400摘要 :為了建立弓形蟲的快速檢測(cè)方法 , 本研究建立了一種靈敏、 特異 、 快速的分子生物學(xué)檢測(cè)方法 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù) (LAMP 。用 10倍系列稀釋的 DNA 樣品對(duì)該檢測(cè)方法的靈敏度進(jìn)行了測(cè)試 , 同時(shí)通過(guò)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物做內(nèi)切酶驗(yàn)證 ; 為證明 LAMP 技術(shù)的特異性 , 對(duì)新孢子蟲、附 紅細(xì)胞體、 瑟氏泰勒蟲等病原體進(jìn)行檢測(cè)。 結(jié)果顯示 :利用 LAMP 技術(shù)成功檢測(cè)到弓形蟲基因區(qū) , 此方法的靈敏度可達(dá)到能檢

2、測(cè) 5個(gè)拷貝 DNA 分子水平 , 酶切分析結(jié)果正確 , 并且特異性強(qiáng) , 對(duì)新孢子蟲 、 附紅細(xì)胞體、 瑟氏泰勒蟲等病原體檢測(cè)均為陰性。 說(shuō)明 LAMP 技術(shù)可應(yīng)用于弓形蟲 的快速檢測(cè) 。關(guān)鍵詞 :弓形蟲 ; 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)中圖分類號(hào) :S85217 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 :A 文章編號(hào) :05292 0030D evelop m en ed l am pli f i ca ti on a ss ay fora gondiiL I Yue 2mei, XUE Shu 2jiang, Q IMu 2ge, X I N G Ying, ZHANG Shou 2fa 3(Veterinary Depar

3、t m ent of Agricultural College, Yanbian University, Longjing 133400, China Abstract:I n order t o devel op a rap id and si m p le method f or Toxoplas m a gondii infecti on, a novel l oop 2mediated is other mal amp lificati on (LAMP assay f or T 1gondii was established . Ten serial diluti ons of DN

4、A sa mp le was used t o evaluate the sensitivity of assay, and the accu 2 racy was de monstrated by incisi on enzy me . The pathogens, N eospora, Eperythrozoon and Sergenti, were detected in order t o evaluate the s pe 2 cificity . The result showed that T 1gondii gene could be detected by LAM P, an

5、d the detecti on li m it was 5cop ies . The result of incisi on en 2 zy me was correct . The s pecificity of LAMP assay was good and no amp lificati on p r oduct was found in the sa mp les of N eospora, Eperythrozoon and Sergenti . It suggested LAMP assay was feasible for detecti on of T 1gondii .Ke

6、y words:Toxoplas m a gondii ; l oop 2mediated is other mal a mp lificati on (LAMP 弓形蟲 (Toxoplas m a gondii 是一種嚴(yán)重危害人 類及家畜的機(jī)會(huì)性致病原蟲 , 呈世界性分布 , 可侵犯 除成熟紅細(xì)胞以外的任何有核細(xì)胞 , 引起多種組織 、 器官病變和損害 1。對(duì)于一般人群 , 弓形蟲可引起 慢性隱性感染 2; 對(duì)于特殊人群 , 如艾滋病患者 、 妊娠期婦女 、 器官移植者等可引起嚴(yán)重的后果 , 甚至 死亡 3。 弓形蟲在畜禽中傳播 、流行 , 導(dǎo)致家畜大 批死亡 , 給 畜牧 業(yè)造成 重大 的

7、經(jīng) 濟(jì) 損 失 4。我 國(guó) 中華人民共和國(guó)動(dòng)物防疫法 將其列為多種動(dòng)物共 患病二類疫病 。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增 (l oop 2mediated is other mal a mp li 2 ficati on, LAMP 反應(yīng)在等溫條件下進(jìn)行 , 沒有核酸 收稿日期 :2009205223作者簡(jiǎn)介 :李月梅 (19842 , 女 , 碩士研究生。3通訊作者 。 變復(fù)性過(guò) 程 , 不 但節(jié)省 了大 量的時(shí) 間 , 又 減少 了 RNA 酶和擴(kuò)增核酸污染的機(jī)會(huì) 。更重要的是 , 擴(kuò)增 反應(yīng)只有在 4條引物完全與識(shí)別的靶序列 6個(gè)結(jié)合區(qū) 匹配的情況下才能順利進(jìn)行 , 所有這些特性都在很大 程度上減少了擴(kuò)

8、增反應(yīng)的背景 , 從而使檢測(cè)特異性得 到改善 。1 材料和方法111 材料 B st DNA 聚合酶購(gòu)自 NE B 公司 ; SY BR Green 購(gòu)自上海百維信公司 ; 限制性內(nèi)切酶 B an 為 TaKa 2 Ra 公司產(chǎn)品 ; 弓形蟲 GRA3基因序列的質(zhì)粒 pGEX 2 GRA3、 菌株 BL 221、新孢子蟲 、附紅細(xì)胞體 、瑟氏 泰勒蟲病原體由本校預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存 。3 Ani m al Husbandry &VeterinaryMedicine 2009 Vol 141 No 111112 引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù) Gen Bank AF414079中 已 發(fā) 表 的

9、弓 形 蟲 GRA3致密顆粒蛋白基因序列 , 利用 DNAStar 610進(jìn) 行引物設(shè)計(jì) 。 引物包括 F3、 B3、 F I P 、 B I P 4條引物 , 分別識(shí)別 6個(gè)基因位點(diǎn) 。113 弓形蟲 LAMP 檢測(cè)方法的建立11311 LAMP 反應(yīng)體系的建立 弓形蟲 LAMP 的反應(yīng)體系為 25L, 各組份的終 濃 度 為 :F3/B3各 012mol/L、 F I P /BI P 各 116mol/L、 d NTP 114mmol/L(each 、 Tris 2HCl 20 mmol/L、 (NH 4 2S O 410mmol/L、 KCl 10mmol/L、 MgS O 46mmol

10、/L、 Trit on X 2100011%、 B st DNA 聚合 酶 8U 、 模板 2L 。將水浴鍋溫度調(diào)至 63 后 , 將 含 LAMP 反應(yīng)液的 PCR 反應(yīng)管置于水浴鍋內(nèi)等溫?cái)U(kuò) 增 3060m in, 結(jié)束后 80 加熱 2m in 。11312 弓形蟲 LAMP 檢測(cè)反應(yīng)結(jié)束后 ,于 115%LAMP 擴(kuò) 增產(chǎn) 物 中 加 入 1的 SY BR Green 染 料 , 觀 察 LAMP 反應(yīng)液是否發(fā)生顏色變化 , 再將 PCR 反應(yīng)管 置于紫外燈下照射 , 觀察是否有強(qiáng)烈的熒光產(chǎn)生 。 114 LAMP 擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切鑒定對(duì) LAMP 擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶 B an 進(jìn)行

11、消化 , 水浴消化 4h, 115%瓊脂糖凝膠電泳 , 觀察結(jié) 果 。115 LAMP 的敏感性試驗(yàn)將得到的模板進(jìn)行 10倍系列稀釋成 5到 5×105 5個(gè)稀釋度 。 用所建立的 LAMP 檢測(cè)方法和 PCR 檢測(cè) 方法進(jìn)行敏感性比對(duì)試驗(yàn) 。116 LAMP 的特異性試驗(yàn)抽提新孢子蟲 、 附紅細(xì)胞體 、 瑟氏泰勒蟲基因組 DNA , 按照所建立的弓形蟲 LAMP 檢測(cè)方法 , 進(jìn)行特 異性試驗(yàn) 。2 結(jié)果211 LAMP 擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)對(duì) 弓 形 蟲 重 組 質(zhì) 粒 pGEX 2GRA3樣 品 進(jìn) 行 了 LAMP 檢測(cè) , 電泳結(jié)果顯示條帶呈階梯狀分布 , 與理 論結(jié)果相符 (圖

12、 1 。在加入弓形蟲重組質(zhì)粒 pGEX 2 GRA3樣品反應(yīng)管中加入染料后置紫外燈下照射 , 發(fā) 出強(qiáng)烈的綠色熒光 (圖 2 。212 LAMP 擴(kuò)增產(chǎn)物的酶切鑒定用 B an 對(duì) LAMP 產(chǎn)物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶切分 析 , 酶切產(chǎn)物與 115%濃度的瓊脂糖凝膠中電泳 。結(jié) 果顯示 , 經(jīng) B an 酶切 , 得到了 90bp 和 150bp 的 2條特異性條帶 , 與預(yù)期的大小相符 (圖 3 。 213 LAMP 的敏感性試驗(yàn)將得到的模板 10倍系列稀釋成 5到 5×105共 1 3畜牧與獸醫(yī) 2009年 第 41卷 第 11期5個(gè)稀釋度 。 結(jié)果顯示 5拷貝以上的稀釋度均顯示了典

13、型的 LAMP 擴(kuò)增帶型 , 且信號(hào)依次遞增 。 說(shuō)明該檢 測(cè)方法的靈敏度理論上可達(dá)到大約 5個(gè)拷貝的水平 (圖 4 。1. 5個(gè)拷貝 2. 51; 3. 5×3DNA LAMP 擴(kuò)增產(chǎn)物 ; 4. 5×104個(gè)拷貝 DNA LAMP 擴(kuò)增產(chǎn)物 ; 5. 5×106個(gè)拷貝 DNA LAMP 擴(kuò)增產(chǎn)物 ; M. 100bp DNA 標(biāo)準(zhǔn)分子量圖 4 LA M P 敏感性試驗(yàn)結(jié)果214 LAMP 特異性試驗(yàn)所建立的弓形蟲 LAMP 檢測(cè)方法可以檢測(cè)出弓形 蟲的核酸 。 但將等溫?cái)U(kuò)增時(shí)間延長(zhǎng)至 2h, 仍不能檢 測(cè)出新孢子蟲 、 附紅細(xì)胞體 、 瑟氏泰勒蟲的核酸 。3

14、討論環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)依賴于能夠識(shí)別靶序列上 6個(gè)特異區(qū)域的引物和一種具解旋功能且呈瀑布式擴(kuò)增 的 B st DNA 聚合酶 , 在等溫條件下可高效 、 快速 、 特 異地?cái)U(kuò)增靶序列5。 LAMP 是呈瀑布式擴(kuò)增 , 擴(kuò)增效率高 ; 由于 LAMP 識(shí)別的是核酸上的 68個(gè)特異性 的位點(diǎn) , 所以其特異性強(qiáng) ; LAMP 只在 6065 進(jìn) 行恒溫?cái)U(kuò)增 , 只要水浴鍋即可 , 也不需要特殊的儀器 , 因此非常簡(jiǎn)便 ; 而且由于 LAMP 是恒溫?cái)U(kuò)增 , 不 需要反轉(zhuǎn)錄步驟 , 不需要 PCR 儀升降溫的時(shí)間 , 所 以擴(kuò)增時(shí)間短 。 為了提高檢測(cè)準(zhǔn)確性和檢測(cè)效率 , 縮 短檢測(cè)周期 , 本研究

15、建立了檢測(cè)弓形蟲的 LAMP 檢測(cè) 方法 , 結(jié)果顯示該方法是一種新型 、 快速 、 實(shí)用 、 靈 敏的檢測(cè)技術(shù) 。目前大多數(shù)弓形蟲病原體的基因檢測(cè)中都選用保 守區(qū)基因 , 本試驗(yàn)選擇了 GRA3基因 , 該基因是在基 因保守區(qū)內(nèi)選擇的 , 這樣就提高了擴(kuò)增的特異性 。 對(duì)于梯度稀釋的模板檢測(cè)結(jié)果顯示 , 該 LAMP 方法的靈 敏度比普通 PCR 方法高 , 能夠檢測(cè)到 5拷貝的模板 ; 特異性和重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果表明 , 該方法是可靠的 , 對(duì) 于其他的病原體都沒有出現(xiàn)非特異 性擴(kuò) 增 。由 于 LAMP 具有快速 、靈敏 、特異 、簡(jiǎn)便的特點(diǎn) , 因此 , 非常適合基層部門和養(yǎng)殖場(chǎng)使用 ,

16、尤 其適 合現(xiàn) 場(chǎng) 檢測(cè) 。LAMP 技術(shù)與 PCR 相比具有以下優(yōu)點(diǎn) 6-8: 反 應(yīng)條件簡(jiǎn)單 , 在一恒溫水箱中即可完成 ; 優(yōu)化步驟 非常簡(jiǎn)單 , 由于 LAMP 反應(yīng)體系中起決定作用的是引物濃度 、 dNTP 濃度和 Mg 2+濃度 , 所以只要將這 3個(gè) 因素的濃度調(diào)至最佳 , 即可實(shí)現(xiàn)對(duì) LAMP 的優(yōu)化 ; 快速高效 , LAMP 在 1h 10910; 6個(gè)特異序, ; 結(jié) , , 從 dNTP 析出的焦磷Mg 2+結(jié)合 , 產(chǎn)生大量的副 產(chǎn)物焦磷酸鎂沉淀 , 肉眼即可直接觀察結(jié)果 。 總之 , LAMP 是一種便捷 、特異而又靈敏的快速 基因檢測(cè)技術(shù) , 如果進(jìn)一步優(yōu)化 、

17、完善和推廣 , 該技 術(shù)將會(huì)在遺傳和傳染病的早期診斷及預(yù)防控制方面發(fā) 揮重要作用 。參考文獻(xiàn) :1 LUfr B J. Toxoplas m a vencephalitis in MDS J .Clin I nf D is,1992, 15(2 :2112222.2 斯特勞 , 阿萊爾 , 蒙加林 , 等 . 豬病學(xué) M.趙德明 , 張中秋 , 沈建 中 , 等 譯 . 北 京 :中 國(guó) 農(nóng) 業(yè) 大 學(xué) 出 版 社 , 2000:6812685.3 Bout D T, Mevelec M N, Velge Roussel F, et al . Pr os pects for ahuman To

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