基因工程知識(shí)點(diǎn)

1、基因工程各章知識(shí)點(diǎn)第一章緒論1基因工程的首例操作實(shí)驗(yàn)三大理論基礎(chǔ)：DNA 是遺傳物質(zhì)、DNA 的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制、遺傳密碼的破譯和遺傳物質(zhì)傳遞方式的確定三大技術(shù)基礎(chǔ)：限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)與DNA 的切割、 DNA 連接酶的發(fā)現(xiàn)與DNA 片段的連接、基因工程載體的研究與應(yīng)用基因工程的誕生：72 年， P.Berg 首次實(shí)現(xiàn)體外DNA 重組：體外用EcoRI 分別切割SV40 和DNA, 并用 T4 DNA 連接酶連接成為重組的雜種DNA 分子73 年， S.Cohen 體外重組DNA 并轉(zhuǎn)化：具Kanr 的 E.Coli 質(zhì)粒 R6 5 和具 Tetr 的 E.Coli 質(zhì)粒 pSC10

2、1 切割并連接轉(zhuǎn)化的大腸桿菌具有雙重抗性S.Cohen 和 H.Boyer 首次實(shí)現(xiàn)真核基因在原核中表達(dá)：將非洲爪蟾的DNA 與 E.Coli 質(zhì)粒（ pSC101）體外切割并連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌2基因工程的基本概念基因工程是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進(jìn)行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種新物體（受體）內(nèi)，使之穩(wěn)定遺傳并表達(dá)出新產(chǎn)物或具有新性狀的DNA 體外操作技術(shù)，也稱為分子克隆或重組DNA技術(shù)。供體、載體、受體是基因工程的三大基本元件。3基因工程的基本操作過(guò)程a 分離目的DNA 片段：酶切、 PCR 擴(kuò)增、化學(xué)合成等。b 重組：體外連接的DNA 和載體 DNA ，形成重組DNA 分子。c

3、 轉(zhuǎn)化：將重組DNA 分子導(dǎo)入受體細(xì)胞并與之一起增殖。d 篩選：鑒定出獲得了重組DNA 分子的受體細(xì)胞。e 對(duì)獲得外源基因的細(xì)胞或生物體通過(guò)培養(yǎng)，獲得所需的遺傳性狀或表達(dá)出所需要的產(chǎn)物。第二章載體1理解用 PBR322 和 PUC18 作載體的克隆外源基因的原理。答案不確定PBR322 作載體的克隆外源基因的原理: PBR322質(zhì)粒 具有 12 種限制性內(nèi)切酶的單一識(shí)別位點(diǎn)：Tetr基因內(nèi)有 7 個(gè)酶切位點(diǎn)： Bam H ， Sal： Amp r 基因內(nèi)有 3個(gè)酶切位點(diǎn)： Pst。 Eco R 和 Hind 不在抗生素基因內(nèi)，不導(dǎo)致插入失活。如果在 pBR322 質(zhì)粒的 Tet r 基因內(nèi)位點(diǎn)

4、 插入外源 DNA 片斷，將切斷了 tetr 基因編碼序列的連續(xù)性，使 tetr失去活性，產(chǎn)生出 Amp r Tet s 表型的重組 pBR322 質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入Amp s Tets 的大腸桿菌細(xì)胞。先涂布在含氨芐青霉素的選擇培養(yǎng)基上，篩選出具Amp r 菌落，再將它們影印于含四環(huán)素的選擇性培養(yǎng)基上。插入外源片斷的重組質(zhì)粒不能在這種培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，這樣就找出了含重組質(zhì)粒的大腸桿菌。如果在pBR322 質(zhì)粒的Amp r 基因內(nèi)位點(diǎn) 插入外源DNA 片斷，則反之。PUC18 作載體的克隆外源基因的原理：在 pBR322 的基礎(chǔ)上，在其5-端帶有一段多克隆位點(diǎn)的lacZ 基因，而發(fā)展的具有雙功能檢測(cè)特性

5、的新型質(zhì)粒載體系列。典型的 pUC 系列的質(zhì)粒載體包括如下4 個(gè)組成部分： a、 pBR322 的復(fù)制起始點(diǎn)。b、氨芐青霉素抗性基因但它的DNA核苷酸序列已經(jīng)發(fā)生了變化，不再含有原來(lái)的核酸內(nèi)切限制酶的識(shí)別位點(diǎn)。c、大腸桿菌 -半乳糖苷酶基因（ lacZ ）的啟動(dòng)子及編碼 -肽鏈的 DNA 序列，此結(jié)構(gòu)稱之為 lacZ 基因。 d、位于 lacZ 基因中的靠近 5-端的一段多克隆位點(diǎn)（ MCS ）區(qū)段。但它并不破壞該基因的功能。2理想載體的必備條件（ 1）、較小的分子量和較高的拷貝數(shù)。（ 2）、應(yīng)最大限度的具有各種常用限制性內(nèi)切酶的單一酶切位點(diǎn)。（ 3）、具兩種以上的選擇標(biāo)記基因。（ 4）、重組

6、質(zhì)粒較易導(dǎo)入宿主細(xì)胞并復(fù)制和表達(dá)。3穿梭載體和a-互補(bǔ)A 穿梭質(zhì)粒載體是指一類由人工構(gòu)建的具有兩種不同復(fù)制起點(diǎn)和選擇標(biāo)記，因而可在兩種不同的宿主細(xì)胞中存活和復(fù)制的質(zhì)粒載體。常見(jiàn)的穿梭質(zhì)粒有大腸桿菌-土壤農(nóng)桿菌穿梭質(zhì)粒載體、大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭質(zhì)粒載體、大腸桿菌 -釀酒酵母穿梭質(zhì)粒載體。BlacZ基因的突變體M15質(zhì)粒（缺失氨基酸殘基11 到41）是沒(méi)有野生型lacZ基因產(chǎn)物那種分解X-gal能力的。但如果在M15突變體的抽取物中加入-半乳糖苷酶的第3 至第92 氨基酸殘基的肽段（肽）則能恢復(fù)M15分解X-gal ，而顯示藍(lán)色的能力。這樣一種基因內(nèi)互補(bǔ)現(xiàn)象稱做互補(bǔ) 。第三章核酸操作的基本技

7、術(shù)1堿解法提取質(zhì)粒DNA 的原理？提取DNA 時(shí)常用試劑的作用原理堿裂解法是基于DNA的變性與復(fù)性差異而達(dá)到分離目的的。堿性使質(zhì)粒DNA變性，再將pH值調(diào)至中性使其復(fù)性，復(fù)性的為質(zhì)粒DNA ，而染色體DNA不會(huì)復(fù)性，纏結(jié)成網(wǎng)狀物質(zhì)，通過(guò)離心除去。堿裂解法是一種應(yīng)用最為廣泛的制備質(zhì)粒DNA的方法，堿變性抽提質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離目的。在pH值高達(dá)12.6 的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開(kāi)而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分離，當(dāng)以pH4.8的NaAc/KAc高鹽緩沖液去調(diào)節(jié)其pH值至中性

8、時(shí)，變性的質(zhì)粒DNA又恢復(fù)原來(lái)的構(gòu)型，保存在溶液中，而染色體DNA不能復(fù)性而形成纏連的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，通過(guò)離心，染色體DNA與不穩(wěn)定的大分子RNA 、蛋白質(zhì) SDS 復(fù)合物等一起沉淀下來(lái)而被除去。常用試劑的作用溶菌酶： 溶解菌體細(xì)胞壁的 -1 ，4糖苷鍵，即具溶菌作用。葡萄糖 ：增加溶液粘度，防止 DNA受機(jī)械切力作用而降解EDTA：金屬離子螯合劑，抑制脫氧核糖核酸酶（Dnase)對(duì)DNA的降解作用SDS：陰離子表面活性劑，可破壞細(xì)胞膜，使DNA釋放出來(lái)，結(jié)合蛋白質(zhì)，使蛋白質(zhì)沉淀下來(lái)抑制脫氧核糖核酸酶（RNase)的活性。酚、氯仿： 蛋白質(zhì)變性劑。使蛋白質(zhì)失水變性，；離心后與水相（含DNA ）分離。

9、異戊醇： 降低分子表面張力，可減少氣泡的產(chǎn)生；有助于分相。無(wú)水乙醇： DNA 的沉淀劑。奪取DNA 周圍的水分，使DNA 失水而易于聚合。NaOH ：核酸在 pH=59 的溶液中穩(wěn)定，pH>12 或 pH<3 時(shí)會(huì)引起氫鍵斷裂。KAc ： KAc-HAc ， pH=4.8 緩沖液，變性的質(zhì)粒DNA 在此溶液中發(fā)生復(fù)性。2RNA 分離的關(guān)鍵因素。（ RNA 酶是一種蛋白質(zhì)，所以提取時(shí)利用氯仿抽提可以很好去除，得到高質(zhì)量的 RNA 。）RNA分離的關(guān)鍵因素是盡量減少RNA 酶（ RNase）的污染 ，因此在RNA 制備過(guò)程中，必須注意控制RNase酶的活性，并設(shè)法抑制其活性。造成 RN

10、ase酶污染源有：所用的器皿、所用的溶液、實(shí)驗(yàn)人員的手及飛沫。玻璃器皿：烘箱中（180 )烘烤 8h以上。塑料器皿：0.1%DEPC （ diethylpyrocarbonate ，二乙基焦碳酸鹽)浸泡或用氯仿洗滌。配置的溶液應(yīng)盡可能用0.1% DEPC 在 37處理 12h以上，然后高壓滅菌。全部實(shí)驗(yàn)過(guò)程均需戴手套操作, 并經(jīng)常更換。RNA 電泳槽常用去污劑洗滌，0.1%DEPC 處理。提取中出現(xiàn)RNA降解原因 ：操作過(guò)程中溫度太高、操作時(shí)有RNA 酶的污染或RNase抑制劑量不足等都有可能使RNA降解。解決方法 ：做好使用器皿的RNase去除工作；在整個(gè)操作過(guò)程中最好在低溫(4) 或是冰上

11、進(jìn)行；操作者自始至終戴手套。3電泳法和紫外分光光度法都能檢測(cè)DNA 的濃度和純度，哪種方法更好。A 、紫外光度法原理： 核酸中含有嘌呤和嘧啶環(huán)，在256265nm 處顯示出特征吸收峰，在230 nm 處吸收最小。 DNA 或RNA 分子在 260 nm 處有特異吸收峰，吸收強(qiáng)度與系統(tǒng)中DNA 或 RNA 的濃度成正比。方法： 首先用 TE 或 ddH2O 稀釋待測(cè) DNA 樣品；用 TE 或 ddH2O 為空白對(duì)照，在260 nm 及 280 nm 處調(diào)節(jié)紫外分光光度計(jì)讀數(shù)為0；加入 DNA 稀釋液與上述兩波長(zhǎng)處讀取OD 值；A260值為 1 時(shí)相當(dāng)于 50ug/mL的 dsDNA ， 40u

12、g/mL 的 ssDNA 或 RNA ；通過(guò)計(jì)算公式計(jì)算濃度及純度。雙鏈 DNA （ ds DNA ）濃度（ g /ml ）=50× OD260×稀釋倍數(shù)單鏈 DNA 或 RNA （ ssDNA ssRNA ）濃度 （ g /ml ） =40 ×OD260 ×稀釋倍數(shù)DNA 純度可通過(guò) OD260/ OD280 來(lái)衡量：純的 DNA 的 OD260/OD280 為 1.82.0 ；OD260/ OD280 2.0 為 RNA 污染， 1.8 為蛋白質(zhì)污染； OD260/OD280 0.9 時(shí)適當(dāng)稀釋樣品， 可再進(jìn)行一次抽提； OD260/OD280 2

13、時(shí)則 RNA 過(guò)高，要除去 RNA 。B、水平式瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)DNA在生理?xiàng)l件下，核酸分子是多聚陰離子當(dāng)核酸分子被放置在電場(chǎng)當(dāng)中時(shí)，它們就會(huì)向正電極的方向遷移。在一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下，DNA 分子的電泳遷移率，取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。原理： 在瓊脂糖凝膠中加入EB，當(dāng)與 DNA 混合時(shí) EB 可插入到DNA 分子中形成熒光絡(luò)合物。而EB 在紫外光照射下能發(fā)射熒光，熒光的強(qiáng)度與DNA 的含量成正比。便可十分敏感而方便地檢測(cè)出凝膠介質(zhì)中DNA的存在、強(qiáng)度和譜帶的位置。在適當(dāng)?shù)娜旧珬l件下，熒光的強(qiáng)度同DNA數(shù)量成正比，據(jù)此，人們可以估計(jì)DNA的濃度。不同大小的DNA片段在凝膠中的遷移速度不

14、同，據(jù)此，科研工作者們便能判斷DNA的分子質(zhì)量，其有無(wú)降解；同時(shí)，通過(guò)同已知分子質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)DNA片段之間的比較，還可測(cè)定出隨遷移的DNA片段的分子質(zhì)量。4為什么核酸保存在TE 溶液（ Tris-HCl和 EDTA ）中比較穩(wěn)定在基因操作實(shí)驗(yàn)中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA 的穩(wěn)定性及緩沖液成分不產(chǎn)生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統(tǒng)（ pKa=7.2 ）和硼酸系統(tǒng)（ pKa=9.24 ）等雖然也都符合細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的生理范圍，可作 DNA 的保存液，但在轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)時(shí)， 磷酸根離子的種類及數(shù)量將與 Ca2+產(chǎn)生 Ca 3（PO 4） 2 沉淀；在 DNA 反應(yīng)時(shí)，不同的酶對(duì)輔助因子的種類及數(shù)量要求不同，有的

15、要求高離子濃度，有的則要求低鹽濃度， 采用 Tris-Hcl（pKa=8.0 ）的緩沖系統(tǒng)， 由于緩沖液是 TrisH/Tris ，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA 時(shí)，大都采用Tris-HCL 系統(tǒng)，而TE 緩沖液中的 EDTA 更能穩(wěn)定 DNA 的活性。第四章 限制性內(nèi)切酶1寄主的限制與修飾的作用R/M 中的限制作用（restriction) 是指一定類型的細(xì)菌可以通過(guò)限制酶的作用，破壞入侵的噬菌體DNA （外源 DNA ）導(dǎo)致噬菌體寄主幅度受到限制的現(xiàn)象。限制酶來(lái)完成R/M 中的修飾作用(modification)是指寄主本身的DNA 由于合成后通過(guò)甲基化作用得以甲基化，使

16、 DNA 獲得修飾，從而避免遭自身限制酶的破壞。寄主的限制與修飾有兩個(gè)方面的作用：保護(hù)自身的 DNA 不受限制；破壞外源DNA 使之迅速降解。細(xì)菌正是利用限制與修飾系統(tǒng)來(lái)區(qū)分自身DNA 與外源 DNA 的。2 RE 識(shí)別序列的特點(diǎn)主要類型型型型限制修飾多功能單功能雙功能蛋白結(jié)構(gòu)異源三聚體同源三聚體異源二聚體輔助因子ATP， Mg 2+， SAMMg 2+ATP， Mg2+， SAM識(shí)別序列TGAN 8 TGCT 或AACN 6GTGC旋轉(zhuǎn)對(duì)稱序列GAGCC 或CAGCAG切割位點(diǎn)距離識(shí)別位點(diǎn) 1Kb 處隨機(jī)性切割識(shí)別序列內(nèi)或附近特異性切割距識(shí)別序列下游 2426bp處3同裂酶同尾酶完全消化不完

17、全消化星號(hào)活性同裂酶（ isoschizomers ）：來(lái)自不同有機(jī)體，識(shí)別切割相同序列的一組酶。同尾酶（ isocaudamer ）：來(lái)源不同，識(shí)別序列也各不相同，但能產(chǎn)生出相同的粘性末端的RE 。由同尾酶所產(chǎn)生的 DNA 片段可通過(guò)粘性末端之間的互補(bǔ)作用而連接，在基因克隆中很有用。完全酶切消化 （ complete disestion ) ：如果一種RE 對(duì)某個(gè) DNA 分子的所有識(shí)別位點(diǎn)均實(shí)現(xiàn)了完全的切割，稱為完全酶切消化。限制性內(nèi)切酶的不完全消化（partialdigestion) ： RE 對(duì) DNA 分子的消化不完全，即未能在所有分子的所有識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行完全的切割，可獲得分子量大小有

18、所增加的限制片段產(chǎn)物。星號(hào)活性： 非最適條件（酶量大、甘油高、低離子強(qiáng)度，高pH 等）常使酶發(fā)生不正確切割（切割特異性序列相似的序列） 。4影響酶切的因素（ 1）、 DNA 純度： DNA 制劑中， Pro.酚，氯仿，酒精，EDTA ，高鹽濃度等，影響RE 的活性。提高酶切效率方法：增加RE 用量；擴(kuò)大反應(yīng)體積以使?jié)撛诘囊种埔蛩叵鄳?yīng)稀釋；延長(zhǎng)酶切時(shí)間。（ 2）、 DNA 甲基化程度：甲基化作用會(huì)強(qiáng)烈影響酶活性；基因工程中用的菌株為喪失了甲基化酶的；不同位點(diǎn)之間的甲基化程度是不相同的且與DNA 來(lái)源的細(xì)胞類型有密切關(guān)系。（ 3）、酶切反映溫度：（ 4）、 DNA 分子結(jié)構(gòu)：超螺旋比線性 DNA

19、需酶量大 ; DNA 的邊側(cè)序列也有影響。（ 5）、RE 的緩沖液： Mg 2+。Tris-HCl ：使 pH 處于最佳數(shù)值范圍內(nèi)。 保護(hù)酶穩(wěn)定性的物質(zhì)-巰基乙醇、（ DDT) 、（ BSA) 。第五章DNA 的連接1連接酶的作用及范圍作用：連接酶是一種能夠催化DNA 上裂口兩側(cè)（相鄰）核苷酸裸露的3羥基和 5磷酸之間形成共價(jià)結(jié)合的磷酸二酯鍵， 使原來(lái)斷開(kāi)的DNA 裂口重新連接起來(lái)的酶。在 DNA 復(fù)制、修復(fù)以及重組過(guò)程中起重要作用。范圍： 可連接切口 (nick ），但不可連接缺口 (gap)。可連接雙鏈DNA分子的一部分，但不可連接兩條單鏈DNA 分子或環(huán)化的單鏈DNA分子。DNA 連接酶

20、的種類：1、 T4噬菌體 DNA 連接酶： T4 噬菌體 DNA 連接酶 (又稱 T4DNA 連接酶 )分子質(zhì)量為 68Ku ，需要 ATP 作為輔助因子，最早是從T4 噬菌體感染的大腸桿菌中提取的。范圍T4 噬菌體 DNA 連接酶可以連接： （ 1）兩個(gè)帶有互補(bǔ)黏性末端的雙鏈DNA 分子。（ 2）兩個(gè)帶有平頭末端的雙鏈DNA 分子。（ 3）一條鏈帶有切口的雙鏈 DNA分子。（4） RNA ： DNA 雜合體中 RNA 鏈上的切口，也可將RNA 末端與 DNA 鏈連接。2、大腸桿菌 DNA 連接酶：大腸桿菌 DNA 連接酶分子質(zhì)量為75Ku ，需要 NAD +作輔助因子。范圍大腸桿菌 DNA

21、連接酶可連接： （ 1）兩個(gè)帶有互補(bǔ)黏性末端的雙鏈DNA 分子。（ 2）一條鏈帶有切口的雙鏈 DNA 分子。2影響連接的因素A 、影響因素： 反應(yīng)溫度、離子濃度、DNA末端的結(jié)構(gòu)、DNA末端的相對(duì)濃度、DNA片段的濃度和相對(duì)分子量等對(duì)連接效率都有影響。連接反應(yīng)速度完全由互相匹配的DNA 末端濃度所決定。在連接反應(yīng)體系中，一般可形成兩種不同構(gòu)型的DNA 分子： 線性分子； 環(huán)狀分子。 在基因克隆操作技術(shù)中，DNA分子的構(gòu)型直接影響轉(zhuǎn)化過(guò)程。對(duì)于兩個(gè)以上的DNA分子的連接，不僅要考慮反應(yīng)體系中DNA末端的總濃度，而且還要考慮載體與插入片段的末端濃度的比例。原則上，應(yīng)該保證一個(gè)DNA 分子的未端具有

22、較高的幾率與另一個(gè)DNA 分子連接，以減少自連，從而達(dá)到重組的目的DNA 分子間的連接。B、提高連接效率的方法：a 適宜的溫度：為粘性末端的Tm 與 DNA 連接酶最適溫度的折衷。b 插入片段 > 載體片段 10-20 倍。c 適當(dāng)加大酶的用量，但單位含酶量低時(shí)，隨著用量的加大，甘油含量也提高了，反而影響連接效率。d 用堿性磷酸酶處理載體，使5-P 變?yōu)?5-OH ，減少載體自連，提高重組分子形成比率。3平齊末端的連接方法A 、直接用T4連接酶連接B、同聚物加尾法：不需模板鏈的存在，末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶可將核苷酸加到DNA分子單鏈延伸末端的3-OH上。故在反應(yīng)物中存在一種脫氧核苷酸的條件

23、下，便構(gòu)成由同一種類型核苷酸組成的多聚核苷酸尾巴，當(dāng)兩種DNA分子帶有可互補(bǔ)配對(duì)的poly尾巴時(shí)， 能彼此連接起來(lái)， 此種連接方式稱為同聚物加尾（一般加10-40個(gè)堿基就足夠了） 。應(yīng)用 （ 1）、酶切后形成的平齊末端。（ 2）、機(jī)械切割大分子DNA產(chǎn)生平齊末端。 （ 3）、 RNA ： cDNA具有平齊末端。缺點(diǎn) ：無(wú)法在尾巴處（原位）再進(jìn)行切割。C、銜接物連接法：所謂銜接物 （ linker) 是指用化學(xué)方法合成的一段由10-12個(gè)核苷酸組成具有一個(gè)或數(shù)個(gè)限制酶識(shí)別位點(diǎn)的平齊末端的雙鏈寡聚核苷酸片段。將銜接物的5末端和待克隆的DNA的 5末端用多核苷酸激酶處理使之磷酸化，然后通過(guò)T4連接酶

24、的作用將兩者連接起來(lái)。接著用適當(dāng)?shù)腞E消化具有銜接物的DNA分子和克隆載體分子，這樣的結(jié)果使二者產(chǎn)生出了的互補(bǔ)的粘性末端，則可用連接酶將DNA 分子和載體分子按常規(guī)的粘性末端連接法將二者連接起來(lái)。優(yōu)點(diǎn)：兼具同聚加尾法和粘性末端法各自的優(yōu)點(diǎn)；可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要設(shè)計(jì)不同RE 識(shí)別位點(diǎn)的銜接物，從而大提高平齊末端DNA 片段的連接效率；可實(shí)現(xiàn)外源片段定向克隆。缺點(diǎn)：基因內(nèi)部有相同酶位點(diǎn)時(shí)，酶切會(huì)把該基因切斷，從而給后續(xù)的亞克隆和其他操作帶來(lái)麻煩。D、接頭連接法第六章 轉(zhuǎn)化及重組體的鑒定1感受態(tài)感受態(tài)： 凡是能吸收游離DNA 片段的細(xì)菌稱為感受態(tài)細(xì)菌或者說(shuō)處于感受態(tài)；正常生長(zhǎng)條件下的一個(gè)或多個(gè)不同生長(zhǎng)時(shí)

25、期都處于高度感受態(tài)的細(xì)菌；經(jīng)過(guò)特殊處理才表現(xiàn)感受態(tài)；對(duì)于轉(zhuǎn)化表現(xiàn)強(qiáng)烈抑制的細(xì)菌。2在 DNA 水平上檢測(cè)轉(zhuǎn)化體的方法有哪些； RNA 水平的檢測(cè)方法。答案不確定 DNA 水平上質(zhì)粒 DNA 的提取和限制性酶切分析；質(zhì)粒 DNA 與分子雜交。 觀察是否有表型變化的重組體。聯(lián)合運(yùn)用直接和間接的手段進(jìn)行快速而準(zhǔn)確的鑒定。重組體的篩選：直接選擇法：抗藥性標(biāo)記選擇，插入失活法；標(biāo)志補(bǔ)救如互補(bǔ)；分子雜交法原位雜交；Southern印跡。非直接選擇法：免疫學(xué)方法如免疫化學(xué)方法酶免檢測(cè)法。第七章目的基因的獲得1什么是 cNA？如何通過(guò)構(gòu)建cNA 文庫(kù)和基因組文庫(kù)獲得目的基因cDNA （ complementa

26、ryDNA) ：是指與 mRNA互補(bǔ)的 DNA ，是由mRNA 通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄而成的。cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建基本過(guò)程：通過(guò)一系列的酶促作用，使總poly(A)mRNA 制劑轉(zhuǎn)變成雙鏈cDNA 群體，并插入到適當(dāng)?shù)妮d體分子上，然后再轉(zhuǎn)化給大腸桿菌寄主菌株的細(xì)胞內(nèi)。如此便構(gòu)成了包含產(chǎn)所有基因編碼的cDNA 基因文庫(kù)（ cDNA library)。mRNA反轉(zhuǎn)錄酶cDNA復(fù)制雙鏈 cDNA載體重組 DNA分子受體菌含重組 DNA分子的受體具體步驟第一步：分離總RNA ，然后從總RNA 中分離出mRNA 部分，約占細(xì)胞總RNA 的 1-2。第二步：以mRNA 為模板，經(jīng)過(guò)逆轉(zhuǎn)錄合成第一條cDNA

27、 。第三步：將mRNA-cDNA雜交分子轉(zhuǎn)變?yōu)殡p鏈cDNA 分子。第四步：將合成的雙鏈cDNA 重組到質(zhì)粒載體或噬菌體上。第五步：將重組分子轉(zhuǎn)入大腸桿菌主細(xì)胞中進(jìn)行增殖。應(yīng)用噬菌體構(gòu)建基因組文庫(kù)：1、基本步驟：從供體基因組DNA 產(chǎn)生適當(dāng)大小的DNA 片段；在體外將這些DNA 片段同適當(dāng)?shù)氖删w連接成重組分子；轉(zhuǎn)化到大腸桿菌的受體細(xì)胞中去；從轉(zhuǎn)化子克隆群體中挑選出含有目的基因的片段。2. 供體 DNA 制備：（ 1）、機(jī)械切割產(chǎn)生合適大小的外源DNA片段。（ 2）、 RE的部分消化產(chǎn)生合適大小的外源DNA 片段。從基因組DNA文庫(kù)獲取目的基因：組織或細(xì)胞染色體DNA限制性內(nèi)切酶基因片段克隆載體

28、重組DNA 分子受體菌含重組分子的轉(zhuǎn)化2 PCR的原理；引物；簡(jiǎn)并引物；RT-PCR;PCR 的原理： 實(shí)質(zhì)為體內(nèi)DNA復(fù)制的體外模擬。當(dāng)雙鏈DNA變性為單鏈后，DNA 聚合酶以單鏈DNA為模板，并利用反應(yīng)混合物中的四種dNTPs，以與模板互補(bǔ)的核苷酸為引物，合成新生的DNA 互補(bǔ)鏈。理想拷貝數(shù) =2n，（ n：循環(huán)次數(shù)）；實(shí)際拷貝數(shù)=(1+x) n，（ X ：平均效率 ,約為 0.85 ， n：循環(huán)次數(shù)）9引物定義：是（兩條）人工合成的與模板DNA互補(bǔ)的核苷酸鏈長(zhǎng)度 : 一般為 15-30bp，且與單鏈 DNA模板互補(bǔ)，短的 6-12bp, 長(zhǎng)的 35bp。兩引物與模板結(jié)合位點(diǎn)之間的距離決定

29、了擴(kuò)增區(qū)段的長(zhǎng)度，1kb為理想的擴(kuò)增跨度， 2kb左右為有效擴(kuò)增跨度。簡(jiǎn)并引物： 簡(jiǎn)并引物是由多種寡核苷酸組成的混合物，彼此之間僅有一個(gè)或數(shù)個(gè)核苷酸的差異。RT-PCR:先將 RNA轉(zhuǎn)錄成 cDNA，接著以 cDNA為模板進(jìn)行 PCR擴(kuò)增。這一技術(shù)稱為反轉(zhuǎn)錄 PCR （reverse transcription PCR RT-PCR) 。3設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單的引物；如何通過(guò) PCR 獲得目的基因給出 DNA 序列，寫出引物第八章 凝膠電泳與分子雜交1如何通過(guò)瓊脂糖凝膠檢測(cè)DNA （電泳的原理及影響因素）電泳原理在生理?xiàng)l件下，核酸分子是多聚陰離子當(dāng)核酸分子被放置在電場(chǎng)當(dāng)中時(shí)，它們就會(huì)向正電極的方向遷移。在

30、一定的電場(chǎng)強(qiáng)度下， DNA分子的電泳遷移率，取決于核酸分子本身的大小和構(gòu)型。凝膠濃度的高低影響凝膠介質(zhì)孔隙的大小，濃度越高，孔隙越小，其分辨能力也就越強(qiáng)；反之，濃度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就隨之減弱。瓊脂糖凝膠電泳（ agrose gel electrophisis）（1）支持介質(zhì)：瓊脂糖是一種線性多糖聚合物，系從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來(lái)的。（2）分辨能力：瓊脂糖凝膠基質(zhì)的孔徑大小可以通過(guò)調(diào)整瓊脂糖的濃度來(lái)改變。其分辨力為為0.250kb 范圍之間的 DNA片段；凝膠濃度越大，介質(zhì)孔徑越小，分辨能力越強(qiáng)。影響 DNA電泳的因素DNA分子大小、 DNA分子構(gòu)型、凝膠濃度、電場(chǎng)強(qiáng)度、EB、

31、電泳緩沖液2 Southern 雜交；缺口平移法制備探針Southern 雜交：根據(jù)毛細(xì)管作用的原理， 使在電泳中分離的 DNA片段轉(zhuǎn)移并結(jié)合在適當(dāng)?shù)臑V膜上，然后通過(guò)同標(biāo)記的單鏈 DNA或RNA探針的雜交作用檢測(cè)這些被轉(zhuǎn)移的 DNA片段，這種實(shí)驗(yàn)方法叫做 DNA印跡雜交技術(shù)。由于它是由 E. Southern 于1975年首先設(shè)計(jì)出來(lái)的，故又叫做 Southern DNA印跡轉(zhuǎn)移技術(shù)。缺口平移法制備探針： 首先用適當(dāng)濃度的 DNA 酶（ DNAse ）在探針 DNA 雙鏈上造成缺口，然后再借助于 DNA 聚合酶（ DNa poly meras ）的 5 3的外切酶活性，切去帶有 5磷酸的核苷酸

32、；同時(shí)又利用該酶的 5 3聚酶活性， 使32P 標(biāo)記的互補(bǔ)核苷酸補(bǔ)入缺口， DNA 聚合酶的這兩種活性的交替作用，使缺口不斷向 3的方向移動(dòng)，同時(shí) DNA 鏈上的核苷酸不斷為 32P 標(biāo)記的核苷酸所取代。3什么是 Northern 雜交和 western 雜交Northern 雜交： 將變性（用甲醛、乙二醇，防止 RNA形成二級(jí)結(jié)構(gòu)）瓊脂糖膠電泳分離的 RNA 或mRNA，轉(zhuǎn)移吸印到特殊（疊氮化的或其它化學(xué)修飾的）的活性濾膜或?yàn)V紙上，通過(guò)共價(jià)交聯(lián)作用而使它們永久地結(jié)合在一起，與標(biāo)記的探針 RNA或 DNA雜交，然后放射自顯影以分析 RNA（大小、數(shù)量）的方法，這種方法同薩瑟恩的 DNA印跡雜交

33、技術(shù)十分類似， 所以叫做諾塞恩 RNA吸印雜交技術(shù)（ Northern blotting）。western雜交 :將蛋白質(zhì)從電泳凝膠中轉(zhuǎn)移并結(jié)合到硝酸纖維素濾膜上，然后同放射同位素125標(biāo)記的特定蛋白質(zhì)之抗體進(jìn)行反應(yīng)，以檢測(cè)蛋白質(zhì)的雜交技術(shù)，這種技術(shù)叫做韋斯頓蛋白質(zhì)雜交技術(shù)（ Western blotting ）。第九章測(cè)序Sanger 測(cè)序的原理（ 2 分題）利用 DNA聚合酶和雙脫氧鏈終止物測(cè)定核苷酸順序的方法。 也稱為引物合成法或酶催引物合成法。原理： DNA聚合酶能利用單鏈 DNA為模板，離體合成出其互補(bǔ)鏈，當(dāng)反應(yīng)液中存在 2 ，3 - 雙脫氧核苷三磷酸（ ddNTP），它可以象 2-

34、 脫氧核苷三磷酸（ dNTP）那樣直接摻入新合成的DNA鏈中，但 因ddNTP3 端不具 -OH基團(tuán)，所以寡核苷酸鏈就不能再繼續(xù)延長(zhǎng)了即 DNA鏈合成中止了。第十章 植物基因工程1反義核酸Ti 質(zhì)粒GFP反義核酸 是指能與特定mRNA 精確互補(bǔ)、特異阻斷其翻譯的RNA 或 DNA 分子。利用反義核酸特異地封閉某些基因表達(dá)，使之低表達(dá)或不表達(dá)，這種技術(shù)即為反義核酸技術(shù)。Ti 質(zhì)粒是根癌農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì)， 為雙股共價(jià)閉合的環(huán)狀 DNA分子，其分子量為 95 156×106D, 約有 200kb左右。具有接合轉(zhuǎn)移特性GFP（綠色熒光蛋白基因）： 這種蛋白質(zhì)最早是由下村修等人在196

35、2 年在一種學(xué)名Aequoreavictoria 的水母中發(fā)現(xiàn)。其基因所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，在藍(lán)色波長(zhǎng)范圍的光線激發(fā)下，會(huì)發(fā)出綠色螢光。這個(gè)發(fā)光的過(guò)程中還需要冷光蛋白質(zhì)Aequorin 的幫助， 且這個(gè)冷光蛋白質(zhì)與鈣離子(Ca2+) 可產(chǎn)生交互作用。2 Ti 質(zhì)粒的改造應(yīng)掌握以下幾個(gè)原則： a、保留 TDNA的轉(zhuǎn)移功能和 vir 區(qū)。b、除去 TDNA的致瘤性（激素基因）。 c 、通過(guò)簡(jiǎn)便手段使外源 DNA插入 T DNA，并可隨之整合到植物染色體上。3農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的原理農(nóng)桿菌共培養(yǎng)法最早是由Marton等（ 1979年）以原生質(zhì)體為受體建立起來(lái)的，經(jīng)過(guò)一系列改進(jìn)后，目前已經(jīng)成為最常用的轉(zhuǎn)化方法。共培養(yǎng)法是利用Ti 質(zhì)粒系統(tǒng)，將農(nóng)桿菌與植物原生質(zhì)體、懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、葉盤、莖段等共同培養(yǎng)的一種轉(zhuǎn)化方