高效液相制備色譜設(shè)備進展及應(yīng)用課件

1、高效液相制備色譜設(shè)備進展及應(yīng)用課件目錄目錄液體制備色譜液體制備色譜展望展望高效液相制備色高效液相制備色譜柱設(shè)備譜柱設(shè)備2022-2-191 1液相色譜是將分離填料填裝在色譜柱內(nèi)，以液體流動相進行洗脫，利用藥物不同活性成分與填料相互作用力的差異進行分離。輸液系統(tǒng)進樣系統(tǒng)分離系統(tǒng)檢測系統(tǒng)數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)高壓輸液泵在線脫氣裝置液體制備色譜液體制備色譜2022-2-19分類 兩種模式，一種是在柱上方加壓，另一種是在柱下方減壓。在低壓制備色譜中使用的是顆粒較大的填料，因此其分辨率是有限的。 利用恒流泵抽送流動相，帶著樣品流經(jīng)色譜柱，實現(xiàn)對樣品的分離。其色譜柱一般是由耐壓的強化玻璃制成，填料顆粒大小比低壓制備

2、色譜所用填料小，分離效率更高。高壓液相色譜低壓制備色譜中壓制備色譜 利用更細的高效填料進行分離的，具有高柱效、高流速、分離時間短的特點。與經(jīng)典液相色譜相比高效液相色譜有很大不同。 2022-2-192022-2-192 2 制備型液相色譜制備型液相色譜1.制備型HPLC與分析型HPLC的區(qū)別2.PHPLC的裝置輸液泵進樣系統(tǒng)色譜柱系統(tǒng)檢測器餾分收集器數(shù)據(jù)采集與處理系統(tǒng)柱結(jié)構(gòu)柱尺寸柱型對填裝的要求2022-2-19 目的不同流速不同進樣模式不同上樣量不同 色譜柱不同理論基礎(chǔ)不同檢測池不同1.與分析型HPLC的區(qū)別2022-2-19 2.PHPLC裝置 輸液泵 進樣系統(tǒng) 色譜柱系統(tǒng) 檢測器 餾分收

3、集器 數(shù)據(jù)采集與處理系統(tǒng)色譜柱是核心部件，色譜填料的填裝是其操作的關(guān)鍵技術(shù)。制備型HPLC由于采用細的填料、高壓操作，所以色譜柱多用不銹鋼制作。2022-2-19制備HPLC的色譜柱系統(tǒng) 在此處主要提出色譜柱系統(tǒng)，因為相對于分析型色譜,制備色譜的核心就是色譜柱。為提供既穩(wěn)定又高效的色譜柱,并用小尺寸顆粒進行填充,最常用也是最易實現(xiàn)的效果較為理想的是動態(tài)軸向壓縮柱(DACTM)技術(shù)。DAC技術(shù)為使用者提供了用任一種填料自己裝填色譜柱、方便快速地調(diào)整柱長度的可能性。在制備型HPLC中,色譜柱的內(nèi)徑可在100500mm之間。一般增大色譜柱的直徑意味著可以承載更多的樣品,從而增加產(chǎn)量。增加色譜柱的長度

4、則意味著可加入的樣品量和分辨率的增大,但同時也增加了柱壓。研究表明對于難分離物系,可以采用直徑較小的色譜填料,以提高分離效率,但在分離度可以滿足分離要求的前提下,使用較大直徑的色譜填料將更為有利。色譜填料的填裝是其操作的關(guān)鍵技術(shù)。制備型HPLC由于采用細的填料、高壓操作，所以色譜柱多用不銹鋼制作。2022-2-19制備HPLC的色譜柱系統(tǒng)柱尺寸： 柱短、內(nèi)徑大、呈圓餅狀在制備型HPLC分離過程中,在滿足分離度要求的前提下,可以采用增加制備柱內(nèi)徑的方法提高制備量。柱型：錐型柱與圓柱型柱錐型柱優(yōu)于圓柱型柱,錐型柱的樣品容量約為圓柱型柱的2倍,柱效比圓柱型柱高36%,色譜流出曲線峰值高于圓柱型柱12

5、%。柱結(jié)構(gòu)：空管柱、軸向壓縮柱和徑向壓縮柱對填裝的要求：填料的種類 、裝填技術(shù)2022-2-19柱結(jié)構(gòu) 1.空管柱與分析柱相同，常用柱內(nèi)徑為10100 mm，采用勻漿填充技術(shù)填裝色譜填料。 2.軸向壓縮柱是采用活塞壓縮床層，以使色譜柱內(nèi)填料均勻、密實，得到更高的柱效。其原理是通過活塞的上下移動來裝柱、維持柱壓和卸柱，活塞周邊配置了特殊設(shè)計的密封圈，能容許活塞上下自由移動，同時又能保持高的密封性。在柱內(nèi)的兩端均配有多孔不銹鋼濾板和能使樣品及洗脫液在柱截面上均勻分布的分散器。液流分散器保證了大量樣品盡可能地瞬時分散在柱截面上，進而快速均勻進入柱床，克服了柱中心樣品局部過濃的現(xiàn)象，保證了色譜柱的高效

6、。 根據(jù)在分離制備過程中提供給活塞的壓力是否持續(xù)，可將軸向壓縮柱分為靜態(tài)和動態(tài)兩種，靜態(tài)軸向壓縮柱的效果比動態(tài)的差，但是設(shè)備比動態(tài)便宜。采用動態(tài)軸向壓縮柱工藝裝填的色譜柱現(xiàn)已基本上主宰了整個制備型色譜柱市場，國內(nèi)已有動態(tài)軸向壓縮柱制備色譜系統(tǒng)產(chǎn)品。2022-2-19聊城萬合工業(yè)制造有限公司自主研發(fā)了高效液相軸向加壓（自振）制備層析柱系統(tǒng)，配套高壓輸液泵和檢測器，通過計算機自動控制，成功開發(fā)了高效液相層析中藥提取裝備。圖1為高效液相軸向加壓（自振）制備色譜柱（HPLC-C200型）系統(tǒng)的示意圖。2022-2-19 徑向壓縮柱使用雙管的色譜柱，填料裝在管壁可壓縮的高聚物柱管內(nèi)制成柱芯，再將裝有填料

7、的柱芯放入不銹鋼外套中，利用氣體或液體施壓于柱芯外壁和不銹鋼外套之間，壓緊柱芯內(nèi)的填料，使色譜柱得到徑向壓縮。該技術(shù)目的是消除顆粒間及顆粒與管壁間的空隙。徑向色譜柱的結(jié)構(gòu)如圖4所示，圖中表明進入到徑向色譜柱的樣品和流動相并非如傳統(tǒng)的軸向色譜柱從柱的一端流向另一端，而是沿徑向流動，即樣品和流動相是從色譜柱的周圍流向柱圓心。2022-2-19 徑向壓縮柱的主要缺點是柱芯長度固定，不如軸向壓縮柱可以任意調(diào)節(jié)。此外直徑較大的色譜柱中徑向經(jīng)常出現(xiàn)粒度梯度，造成流動相徑向流速分布不均勻。由于徑向擴散太慢，不能抵消柱截面積流速差異所產(chǎn)生的濃度梯度，所以徑向流速是峰展寬的一個重要來源。徑向壓縮柱主要是由Wat

8、ers公司生產(chǎn)，并已有預(yù)制柱出售。2022-2-19柱尺寸 現(xiàn)代高效制備液相色譜柱具有柱短、內(nèi)徑大、呈圓餅狀(pancake)的特征。目前高效制備柱的柱長與常規(guī)分析柱相仿，一般為2050cm遠短于傳統(tǒng)柱1m甚至1m以上的制備柱，在制備型HPLC分離過程中，在滿足分離度要求的前提下，可以采用增加制備柱內(nèi)徑的方注提高制備量。柱型制備高效色譜柱按柱型可分為錐型柱與圓柱型柱兩大類。錐型柱優(yōu)于圓柱型柱，錐型柱的樣品容量約為圓柱型柱的2倍，柱效比圓柱型柱高36%，色譜流出曲線峰值高于圓林型林12%。2022-2-19制備色譜中對填料的要求一般來說，分析型色譜柱填料也可以用于制備型色譜柱中，但是制備色譜中使

9、用的量大，而且需要反復(fù)裝柱，因此對于制備色譜填料有一些特殊的要求：（1）機械強度高；（2）負載量高，單位重量的填料負載量高可以處理更多的樣品；（3）可大量供應(yīng)，批間的重現(xiàn)性好；（4）粒徑大小合適，布范圍窄，在制備分離過程中，對于難分離物系，可以采用較小粒徑的色譜填料，以提高分離效率。但在滿足分離要求的前提下，使用較大粒徑的色譜填料，可以獲得較大的生產(chǎn)能力；（5）化學(xué)穩(wěn)定性好，選擇性好，無毒，易于填充，價格合理等；（6）通常制備型HPLC每米的塔板數(shù)在20000以上，所用填料粒徑一般為5、7、10m。2022-2-19對填料的要求 填料的種類 制備柱的裝填技術(shù)干裝法勻漿法壓縮法使用最多的就是硅膠

10、及其衍生物的鍵合固定相填料近年來又發(fā)展了整體柱色譜。動態(tài)軸向壓縮法(DAC)填裝的色譜柱柱床均勻、性能穩(wěn)定、柱效高。目前，DAC柱己基本上主宰了整個制備型色譜柱市場，柱徑己從25mm發(fā)展到1.6m。2022-2-19 1.制備型HPLC的樣品預(yù)處理 在高壓液相色譜進樣之前,需對樣品進行過濾。使用能套在注射器上的濾片可以除去樣品中混有的顆粒狀雜質(zhì),既方便又廉價。在選用過濾膜時應(yīng)注意使其適合于所用的溶劑,這一點在使用含四氫呋喃的溶劑時尤其重要。 在色譜柱與進樣器之間安裝前置柱可除去顆粒狀雜質(zhì)和吸附性強的樣品組分。前置柱通常裝有少量與色譜柱相同的填料,如填充得當(dāng),對系統(tǒng)分離效果不會造成很大影響。 硅

11、膠預(yù)處理柱可防止含有緩沖鹽或堿的流動相所引起的麻煩,上訴物質(zhì)可破壞鍵合相填充料的硅膠骨架,常會在柱的上部形成空隙。預(yù)處理柱安裝在泵與進樣器之間,這樣盡管流動相被硅膠所飽和,但在進樣途中不會有空隙或氣泡。3應(yīng)用與實例應(yīng)用與實例2022-2-192 制備規(guī)模按照分離一次進樣量的多少,制備型HPLC有3種規(guī)模,即半制備級HPLC、克級HPLC和工業(yè)級HPLC,如下表所示制備型HPLC以生產(chǎn)純物質(zhì)為目的,在經(jīng)濟合理的前提下,規(guī)模越大越好2022-2-193 柱超載方式 分析型HPLC與制備型HPLC的根本區(qū)別在于分離目的不同。在制備型HPLC中,為了節(jié)省投資和操作費用,必須以最少的時間生產(chǎn)最大量的產(chǎn)品

12、。為了提高制備量,柱必須超載。柱的超載方式有兩種,一種是所謂的“質(zhì)量超載”,即維持較小的進樣體積,但提高進樣濃度;另一種是所謂的“體積超載”,即保持較小的進樣濃度,但增加進樣體積。在制備型HPLC中,一般認為采用質(zhì)量超載的方式較好。王志祥等人建立的混合池模型可以較好的描述制備型HPLC分離過程,發(fā)現(xiàn)在制備型HPLC分離過程中,分離度和柱效均隨質(zhì)量超載程度的增加而下降。但是,在分離度可以滿足分離要求的前提下,采用質(zhì)量超載的方式操作,可以提高制備量。2022-2-194流動相 進行制備型液相色譜分離時,所用溶劑的純度很重要。即使含純化合物的流動相溶劑中含有微量的不揮發(fā)性雜質(zhì)當(dāng)大量溶劑經(jīng)蒸發(fā)后,其雜

13、質(zhì)濃度就會增高。制備型液相色譜往往需消耗大量溶劑,因此應(yīng)在溶劑純度與所用數(shù)量之間進行權(quán)衡。流動相中的非揮發(fā)性添加劑會在產(chǎn)物回收時引起麻煩,這是可采用揮發(fā)性緩沖物來改進分離效果,又易于將其除去。5洗脫 制備型HPLC所采用的洗脫方式主要有兩種。一種是維持流動相的熱力學(xué)參數(shù)不變的等度洗脫法;一種是改變流動相的一種或幾種熱力學(xué)參數(shù)的梯度洗脫法。2022-2-196 被分離物質(zhì)的收集在制備型分離工作中,需使用大量的洗脫溶劑,因此要采用適當(dāng)?shù)氖占?。如有可?應(yīng)對溶劑回收再用,因而也應(yīng)盡量不使用混合溶劑。在使用反相或聚合物吸附劑進行分離時,有時從水液中回收樣品較困難。一種解決辦法是蒸除其中的有機溶劑,然

14、后用甲苯或氯仿提取殘留水液。如以甲醇-水為洗脫液,可將收集的流分用水稀釋5倍,用泵加回到色譜柱上,然后用甲醇將化合物洗脫下來。如從環(huán)肽中脫鹽時,先用水洗脫重新加到柱上的流分,然后用純甲醇洗脫所需成分另一種方法是將收集的樣品加到SephadexLH-20柱上,如Seto等在從植物薔薇中分離黃酮苷時,采用此法以水洗除HPLC洗脫液中含有的磷酸,而后用甲醇將純化合物洗下。2022-2-19 7.實例標(biāo)準(zhǔn)品的制備 實例：茶氨酸、苯乙醇苷類 、羅漢果甜苷等樣品的分離純化實例：綠原酸、大豆異黃酮等藥物雜質(zhì)研究 制備型HPLC是制備純化雜質(zhì)的一種很有效的手段。2022-2-19實例：標(biāo)準(zhǔn)品的制備 茶氨酸是影

15、響茶葉品質(zhì)的重要組成部分,約占茶葉中游離氨基酸的40%以上，占茶葉干重的12%。藥理學(xué)研究表明茶氨酸能拮抗咖啡堿引起的神經(jīng)系統(tǒng)興奮,同時具有降壓作用。目前,僅日本有少量的茶氨酸對照品,且價格較貴,限制了對其進一步的研究與應(yīng)用。肖偉濤等采用制備高效液相色譜技術(shù)分離純化茶氨酸對照品,純度達到98%以上,制備收率大于60%。方法簡便,生產(chǎn)周期短、費用低。茶氨酸產(chǎn)品可用作分析方法的對照品。 苯乙醇苷類化合物為傳統(tǒng)補益中藥肉從蓉的有效成分,該類化合物有明顯提高記憶功能、抗衰老、助陽等作用。松果菊苷是肉從蓉中含量較高的一種苯乙醇苷類化合物,在以管花肉從蓉為原料制成的國家級二類新藥-苯乙醇總苷中其質(zhì)量分?jǐn)?shù)高

16、達48%。但目前國內(nèi)外還未見有松果菊苷標(biāo)準(zhǔn)品出售。雷厲等利用反相制備高效液相色譜法從管花肉從蓉的乙醇提取物中純化制備了松果菊苷的標(biāo)準(zhǔn)品,純度達到98%以上該方法操作簡便,重現(xiàn)性好,可用于松果菊苷及其它苯乙醇苷類化合物的大量制備。2022-2-19實例：標(biāo)準(zhǔn)品的制備 羅漢果甜苷(mogroside V)我國傳統(tǒng)出口商品羅漢果中的主要甜味成分,具有甜度高、熱量低、水溶性好等優(yōu)點。藥理研究表明,羅漢果甜苷具有鎮(zhèn)咳、祛痰以及增強免疫等功效。但目前市場上還沒有羅漢果甜苷的標(biāo)準(zhǔn)品出售。余麗娟等利用半制備高效液相色譜法得到羅漢果甜苷標(biāo)準(zhǔn)品,純度達98.5%。方法具有操作簡便、重現(xiàn)性好、產(chǎn)品純度高等優(yōu)點。為研

17、究mogroside V單體的活性及體內(nèi)藥物學(xué)過程提供了方便,也為制備其他羅漢果三萜苷類標(biāo)準(zhǔn)品提供了有益的參考。以甜苷作為羅漢果中的含量測定的指標(biāo),對于確定羅漢果品質(zhì)的好壞、指導(dǎo)羅漢果的收購和羅漢果甜苷產(chǎn)品的生產(chǎn)具有重要意義。2022-2-19實例：樣品的分離純化 綠原酸具有抗菌、抗病毒、利膽、增高白血球及興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)等功效。國外多以咖啡豆和金銀花為原料提取綠原酸。有實驗結(jié)果表明,杜仲葉片中綠原酸的含量與金銀花的相當(dāng),而且資源豐富,價格低廉。目前,國內(nèi)外對杜仲中綠原酸高純單體的分離多采用硅膠或大孔吸附樹脂反復(fù)柱層析或多級萃取,再采用重結(jié)晶法得到少量純品。 彭密軍等采用制備高效液相色譜技術(shù),

18、從杜仲葉提取物中分離純化得到高純活性成分綠原酸,綠原酸的純度98.61%。同時,彭密軍等人認為流速及洗脫方式對綠原酸的分離情況有較大影響,提出并應(yīng)用了流動相速度梯度洗脫方法,該方法可以縮短分離時間,保持較高的分辨率,同時還能降低試劑的用量。此外,彭密軍等還利用制備高效液相-臺階梯度法分離純化了杜仲中三種環(huán)烯醚萜化合物。結(jié)果表明,產(chǎn)品純度均可達到95%以上,其中京尼平苷酸的產(chǎn)率可高達100.89/。2022-2-19 大豆異黃酮(Soybean isoflavones)是大豆生長過程形成的次級代謝產(chǎn)物，被稱為“植物雌激素”，經(jīng)大孔吸附樹脂純化大豆異黃酮粗提物后，以PHPLC分離得到高純度的大豆異黃酮單體。以SHIMpack PRCODS(20mm x250mm，5m)制備柱，考察了流動相組成及流速、進樣量對分離度的影響，確定了最佳色譜條件為乙腈一水流動相梯度洗脫，進樣量800L，