骨髓腔內(nèi)注射造血干細(xì)胞移植的研究和應(yīng)用進(jìn)展

1、骨髓腔內(nèi)注射造血干細(xì)胞移植的研究和應(yīng)用進(jìn)展         【摘要】  骨髓腔內(nèi)注射造血干細(xì)胞移植旨在促進(jìn)HSC的歸巢。近年來已有大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)肯定了不同來源供體細(xì)胞通過骨髓腔內(nèi)注射能有效地歸巢并植入骨髓、迅速重建受體造血和免疫功能、減少GVHD，誘導(dǎo)同種異基因器官移植免疫耐受，提高受體生存率。本文主要對(duì)該技術(shù)在骨髓移植、臍血移植、研究HSC生物學(xué)特性等方面的作用以及臨床應(yīng)用前景進(jìn)行綜述。 【關(guān)鍵詞】  骨髓腔內(nèi)注射Progress of Research and Application on

2、Hematopoietic Stem Cell Transplantation by Intra-bone Marrow Injection ReviewAbstract  The purpose of hematopoietic stem cell transplantation by intra-bone marrow injection (IBM-HSCT) is to facilitate the homing of HSC. It has been recently proven in many animal experiments that   dif

3、ferent kinds of donor cells could efficiently home and engraft into the bone marrow IBM-HSCT，which led to the rapid hemopoietic and immune recovery of recipients，preventing the development of GVHD，inducing the donor-specific tolerance in allogeneic organ transplantation，and promoting the survival ra

4、te of recipients. In this review，the effect of IBM-BMT and IBM-UCBT，the application of IBM injection technique in the study on HSC s biological characteristics，and its prospect for clinical HSCT were sumarized.Key words intra-bone marrow injection；hematopoietic stem cell transplantation；bone marrow

5、transplantation；cord blood transplantation造血干細(xì)胞移植 ( hematopoietic stem cell transplantation，HSCT)經(jīng)過40余年的臨床應(yīng)用，已成為能夠治愈血液病、實(shí)體瘤、遺傳代謝性疾病、自身免疫性疾病等多種疾患的安全有效的治療手段，其進(jìn)一步發(fā)展尚依賴于諸多因素，如探索HSC的最佳來源和輸注途徑，對(duì)HSC及其相關(guān)細(xì)胞因子生物學(xué)特性的進(jìn)一步研究，預(yù)處理方案的優(yōu)化以及對(duì)移植相關(guān)并發(fā)癥的預(yù)防和處理等等。新的理論和移植技術(shù)層出不窮，其中旨在促進(jìn)HSC歸巢的骨髓腔內(nèi)注射（intra-bone marrow injection，I

6、BMI）技術(shù)，自2001年Kushida等1首次提出后，隨著動(dòng)物實(shí)驗(yàn)有效性的報(bào)道不斷增多，已向我們展示出它對(duì)HSCT的重要作用和廣闊的臨床應(yīng)用前景。經(jīng)外周靜脈輸注HSC的歸巢以及對(duì)HSCT的影響傳統(tǒng)HSC輸入途徑為經(jīng)外周靜脈輸注，該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于臨床HSCT與相關(guān)基礎(chǔ)研究中。以此法輸注的HSC須先經(jīng)右心房、右心室、肺部進(jìn)入體循環(huán)，在4小時(shí)內(nèi)根據(jù)血流量的不同進(jìn)入骨髓、肝、脾、肺、骨骼肌及其它組織中，但絕大部分滯留于肺部，僅有少量HSC能在某些細(xì)胞因子（如SDF-1及其受體CXCR4等）的影響下識(shí)別相應(yīng)的血管位點(diǎn)并穿越基底層到達(dá)骨髓腔。這一特異且迅速的過程稱為HSC“歸巢”（homing），一般

7、在移植后12-36小時(shí)內(nèi)完成。只有歸巢并定居于骨髓微環(huán)境中合適“龕位”（niche）的HSC才能進(jìn)一步增殖、分化和重建造血2。有研究發(fā)現(xiàn)移植后3小時(shí)僅有（5.6±0.7）%的供體細(xì)胞到達(dá)骨髓腔3。Yahata等2將PKH-26標(biāo)記的人臍血CD34+細(xì)胞經(jīng)尾靜脈輸入經(jīng)60Co亞致死量照射后的NOD/SCID小鼠，發(fā)現(xiàn)移植后20小時(shí)受體骨髓腔中的供體細(xì)胞只占其骨髓細(xì)胞總數(shù)的 （1.56 ± 0.32）%。  經(jīng)外周靜脈輸注的HSC如此低的歸巢比例無疑將明顯影響其植入效率。由van-der-Loo等4所進(jìn)行的小鼠同種異基因 HSCT中，骨髓和脾臟的種植效率分別為18%

8、-20%和8% -10%。在異種移植中該比例更低，據(jù)Cashman等5報(bào)道，人臍血HSC植入亞致死量輻照的NOD/SCID小鼠的效率為7%。   中國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志  J Exp Hematol 2006；14(1)骨髓腔內(nèi)注射造血干細(xì)胞移植的研究和應(yīng)用進(jìn)展為減少HSC在受體骨髓外器官組織的滯留而造成的損失，國內(nèi)外學(xué)者曾嘗試HSC的其他注射途徑。如劉英等6將人臍血MNC直接注入胚胎卵黃囊內(nèi)進(jìn)行SD大鼠宮內(nèi)移植，植入率為89.7%，未發(fā)生GVHD。這一結(jié)果提示胚胎對(duì)異體抗原的反應(yīng)表現(xiàn)為免疫耐受，外源性HSC卵黃囊內(nèi)移植能更早地與受體HSC競爭，產(chǎn)生更高的嵌合比例；F

9、an等7發(fā)現(xiàn)，經(jīng)門靜脈注射（portal vein injection，PV injection）的HSC在7天內(nèi)遷移至造血、免疫器官，移植后第3天和第7天肝臟、骨髓和胸腺中供體源細(xì)胞明顯高于尾靜脈注射組（i.v組）。PV組67%的小鼠可存活40天以上，i.v組小鼠則在23天內(nèi)全部死亡，提示HSCT門靜脈注射途徑可有效地重建造血和免疫，提高受體存活率。顯然以上方法都因技術(shù)操作難度大、設(shè)備條件限制不易于臨床的應(yīng)用和推廣。近年來的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究提示，具有較長臨床應(yīng)用歷史的骨髓腔內(nèi)輸注技術(shù)可能是一種安全、有效的HSC輸注手段。骨髓腔內(nèi)輸注的理論基礎(chǔ)與臨床應(yīng)用位于長骨骨髓腔和扁骨松質(zhì)骨骨小梁中的骨髓含有

10、豐富的血管，某些小血管的管壁變薄、管腔擴(kuò)大成為血竇，骨髓腔內(nèi)充滿網(wǎng)狀的海綿狀靜脈竇。長骨和扁骨骨髓腔中的靜脈竇匯集成一至數(shù)條大的靜脈沿動(dòng)脈徑路出骨后匯入靜脈干。骨髓腔內(nèi)靜脈竇一定程度的開放狀態(tài)和高通透性是骨內(nèi)輸液的解剖學(xué)基礎(chǔ)，控制輸注速度和濃度既能提高局部藥物濃度又能使輸入的藥物和液體有效地進(jìn)入全身血液循環(huán)，成人輸液速度可達(dá)20 -50 ml / min。骨穿刺部位宜選四肢長骨尤其是脛骨近端，骨質(zhì)較硬者可采用脛骨中部稍上方處。髂骨、胸骨、鎖骨均不如四肢長骨操作方便和成功率高。并發(fā)癥少見，多為液體滲漏皮下或骨膜下、繼發(fā)感染、骨筋膜室綜合征、脂肪栓塞等8。   由于靜脈輸液導(dǎo)管

11、類型和質(zhì)量的改進(jìn)，20世紀(jì)40年代后期骨髓腔輸液已很少用于常規(guī)治療，而多用于急癥搶救時(shí)建立輸液通路和某些疾病的特殊治療。傅美珍等9單用超小劑量阿糖胞苷（8-10毫克/次，每周1次）骨髓腔內(nèi)注射治療2例成人急性非淋巴細(xì)胞白血病(2型)，分別于51天、57天獲得完全緩解。Sesay等10在脊椎整形術(shù)中以利多卡因椎骨腔注射聯(lián)合納布啡、丙帕他莫靜脈推注，麻醉有效率與單純靜脈用藥組相當(dāng)（85 % vs 84%），但副作用的發(fā)生率少75%，利多卡因血漿濃度僅為中毒劑量的1/4。還有骨髓腔內(nèi)用藥成功治療再生障礙性貧血、創(chuàng)傷性骨髓炎等疾病的報(bào)道，但至今尚無骨髓腔內(nèi)注射HSCT的臨床研究資料。骨髓腔內(nèi)注射HSC

12、T的實(shí)驗(yàn)研究現(xiàn)狀骨髓腔內(nèi)注射HSCT的直接目的是增加HSC的歸巢。但已有研究證實(shí)，經(jīng)骨髓腔內(nèi)輸注的藥物可迅速地彌漫到靜脈竇，從骨髓到動(dòng)脈與從靜脈到動(dòng)脈的循環(huán)時(shí)間一致。但直接注射入骨髓腔中的HSC是否能及時(shí)、有效地植入“龕位（niche）"并增殖分化、重建受體造血免疫功能，IBM輸注途徑對(duì)受體免疫功能的恢復(fù)及GVHD有何影響，鑒于骨髓腔穿刺可能增加病人的痛苦和繼發(fā)感染的機(jī)會(huì)，該方法是否有肯定的臨床應(yīng)用價(jià)值等問題都需要深入探討。目前對(duì)這一技術(shù)的研究成果主要是在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上改進(jìn)和完善其具體操作方法，并已通過一系列的動(dòng)物模型驗(yàn)證其有效性。骨髓腔內(nèi)注射骨髓移植（IBMI-BMT）雖然IBM

13、I在臨床上是非常成熟、安全的技術(shù)，但對(duì)于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，尤其是嚙齒類小動(dòng)物則不易操作，從而限制了對(duì)此技術(shù)的深入研究。近年來，日本關(guān)西醫(yī)科大學(xué)Ikehara領(lǐng)導(dǎo)的研究小組對(duì)動(dòng)物骨髓液的采集、IBMI的方法做了部分改進(jìn)，其可操作性大為提高。Ikehara小組以長骨灌流法（perfusion me- thod）采集骨髓，IBMI則以受鼠長骨（如脛骨、股骨）為穿刺部位，行約5 mm皮膚切口，持50 l或1 ml微量注射器以26-29 G針頭自膝關(guān)節(jié)表面穿過膝腱插入骨髓腔。每只受鼠注射供體細(xì)胞數(shù)為5×106-3×107 BMC，注射液容量為3.5-40微升/每側(cè)脛骨腔。Ikehara小組已

14、建立了小鼠、大鼠、家兔及食蟹猴等多種移植動(dòng)物模型。   現(xiàn)有研究資料表明，IBMI-BMT單獨(dú)或與其它方法聯(lián)合運(yùn)用能明顯提高供體細(xì)胞植入效率，促進(jìn)受體造血、免疫功能的重建。Kushida等1應(yīng)用IBMI技術(shù)，以正常C57BL/6小鼠為供體對(duì)狼瘡性腎炎MRL/lpr小鼠行異基因骨髓移植，發(fā)現(xiàn)IBMI組移植后3天供體源性骨髓細(xì)胞在受體注射側(cè)及非注射側(cè)脛骨骨髓中均占60%，脾臟中占40%，移植后10天在上述部位幾乎達(dá)到100%，而i.v組移植后3天供體源性細(xì)胞在骨髓中10%，移植后10天為70%。IBMI組所有受鼠的無病生存期超過1年，原有的異常T細(xì)胞（Thy1.2+/B220+

15、/CD4-/CD8-）消失，混合淋巴細(xì)胞培養(yǎng)及抗綿羊紅細(xì)胞抗體生成實(shí)驗(yàn)證實(shí)受體具有正常的免疫功能；2004年Nakamura等11報(bào)道，將骨髓腔內(nèi)注射細(xì)胞濃度提高至5×106/3.5 l，行雙側(cè)脛骨注射并聯(lián)合供體外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMNC）靜脈輸注（DLI），平均于BMT后7天植入并成為完全供體型，受鼠達(dá)到長期存活（120天）；Zhang等12則進(jìn)一步比較骨髓造血細(xì)胞聯(lián)合基質(zhì)細(xì)胞骨髓腔內(nèi)輸注或靜脈輸注及單純骨髓造血細(xì)胞骨髓腔內(nèi)輸注的移植效果，發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞同時(shí)骨髓腔內(nèi)注射可以更好地促進(jìn)供體細(xì)胞在受體內(nèi)的造血、免疫重建。   在實(shí)質(zhì)器官移植中，IBMI-BMT亦起到

16、良好的誘導(dǎo)免疫耐受的作用。Esumi等13將受體BN大鼠予氟達(dá)拉賓+亞致死量60Co輻照預(yù)處理，24小時(shí)后移植F344大鼠后肢并接受其骨髓細(xì)胞IBMI。在不予免疫抑制劑的情況下觀察一年，全部受鼠存活，移植肢體均未出現(xiàn)排斥反應(yīng)，而且供體細(xì)胞能完全重建造血。   Ikehara14認(rèn)為IBMI-BMT有以下優(yōu)勢(shì)：GVHD罕見，即使供體細(xì)胞中含有一定量的T細(xì)胞（6%）亦無GVHD發(fā)生；植入率高，即使預(yù)處理照射劑量低于亞致死量也可移植成功；造血重建快；T細(xì)胞的功能可以完全恢復(fù)。IBMI-BMT的有效性與其促進(jìn)骨髓HSC與基質(zhì)細(xì)胞的歸巢密切相關(guān)：經(jīng)骨髓腔注射的HSC可在注射及非注射部

17、位的骨髓和其它造血器官中迅速達(dá)到最佳的分布。 IBMI-BMT可以有效地使供體骨髓基質(zhì)細(xì)胞進(jìn)入受體受損的骨髓微環(huán)境中支持造血。同時(shí)這些基質(zhì)細(xì)胞可通過直接包繞HSC或分泌具免疫抑制作用的肝細(xì)胞生長因子（HGF）、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF-）等細(xì)胞因子使HSC免受免疫活性細(xì)胞的攻擊，還可經(jīng)血循環(huán)進(jìn)入胸腺參與T細(xì)胞的陽性選擇而促進(jìn)T細(xì)胞免疫功能的恢復(fù)。灌流法（PM）能避免傳統(tǒng)髂骨多點(diǎn)穿刺抽取法所造成的外周血（如CD4+、CD8+T淋巴細(xì)胞）混入，因此減少甚至避免了GVHD的發(fā)生，而PM法采集的HSC活性亦高于傳統(tǒng)方法。骨髓腔內(nèi)注射臍血移植（IBMI-UCBT）臍血移植（UCB transplantati

18、on，UCBT）已經(jīng)成為可替代BM-HSCT的重要治療手段。但由于單份UCB所含HSC數(shù)量有限并更為幼稚，免疫效應(yīng)細(xì)胞功能不成熟，以致UCBT后造血、免疫重建延遲，感染率、移植相關(guān)死亡率較高，在一定程度上影響和限制了UCBT的發(fā)展應(yīng)用。有希望解決UCBT造血恢復(fù)延遲的策略包括通過體外擴(kuò)增、混合臍血移植等方法增加UCB中HSC的數(shù)量，以間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSC）與造血干細(xì)胞聯(lián)合移植以促進(jìn)供體HSC歸巢骨髓并迅速增殖等。其中，促進(jìn)UCB中有限的HSC歸巢并植入骨髓是目前研究的熱點(diǎn)之一。      &

19、#160;  已有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)IBMI-UCBT同樣能促進(jìn)HSC歸巢，提高植入效率。Wang等15將人臍血CD34+細(xì)胞2×104-2×105/40 l注入NOD/SCID小鼠脛骨骨髓腔中并做限制性稀釋法分析供體細(xì)胞的植入頻率，發(fā)現(xiàn)IBM組人臍血Lin-/low CD34+CD38-細(xì)胞的植入頻率為1/44，而i.v組僅為1/660。移植后在外周血、脾臟及非注射側(cè)脛骨骨髓腔內(nèi)均檢出該供體細(xì)胞并能夠分化，提示骨髓內(nèi)移植有正常的歸巢和種植機(jī)制。取出移植后6周的小鼠骨髓內(nèi)人CD45+細(xì)胞進(jìn)行第2次靜脈或骨髓內(nèi)注射，IBMI組與i.v組的供體嵌和比例分別為0.546

20、77;0.268 、0.031±0.018（P0.01）；Castello等16報(bào)道，將IBMI組輸注的人臍血細(xì)胞數(shù)減少1/2，于移植后30、60、90天與i.v組比較受體內(nèi)人CD45+細(xì)胞和CD45+/CD34+細(xì)胞含量，兩組無明顯差異。可見IBMI法具有更高的移植效率，尤其在UCBT輸注細(xì)胞數(shù)有限的情況下更具有應(yīng)用價(jià)值。   對(duì)于其它來源的HSC，如小鼠胚胎干細(xì)胞R1誘導(dǎo)分化的HSC，骨髓腔內(nèi)注射亦較靜脈輸注有明顯的優(yōu)勢(shì)。骨髓腔內(nèi)注射在HSC生物學(xué)特性研究中的作用IBMI技術(shù)除了可應(yīng)用于不同來源造血干細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)，還可廣泛用于有關(guān)HSC的基礎(chǔ)研究。例如CD34

21、- HSC由于歸巢相關(guān)受體表達(dá)水平較低而缺乏SDF-1/CXCR4介導(dǎo)的歸巢能力，以傳統(tǒng)靜脈輸注途徑移植無法重建受體的造血免疫功能，因此難以研究其生物學(xué)特性。為排除歸巢的影響，Kimura等17將人臍血Lin-CD34-細(xì)胞直接注射入經(jīng)60Co亞致死量照射的NOD/SCID鼠脛骨骨髓腔中，可使供體細(xì)胞成功植入。與CD34+細(xì)胞相比，該群細(xì)胞在受體內(nèi)的分化、造血重建雖較遲緩，但具更高的增殖和遷移潛能，屬于原始的HSC，有更好的同質(zhì)性（homogenous nature）；Zhong等18則以股骨骨髓腔內(nèi)注射的方法比較供體骨髓細(xì)胞在清髓或非清髓受鼠體內(nèi)的再分布和增殖情況，結(jié)果顯示預(yù)處理方式對(duì)移植細(xì)

22、胞的骨髓內(nèi)再分布無明顯影響，供體細(xì)胞在非清髓受體中植入率低的主要原因是無法有效擴(kuò)增，而不僅僅是“龕位”的缺乏。骨髓腔內(nèi)注射HSCT的臨床應(yīng)用前景以上的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了骨髓腔內(nèi)注射能夠通過促進(jìn)HSC迅速有效的歸巢和植入骨髓來提高HSC的移植效率，因而有可能應(yīng)用于臨床HSCT。但有關(guān)于IBM-HSCT的臨床研究資料卻極少。1998年Hagglund等19曾報(bào)道38例（年齡18歲）接受HLA全相合或1個(gè)位點(diǎn)不合的血緣相關(guān)骨髓移植，骨髓腔滴注(IBM-drop infusion，IBM-drop)、i.v+IBM-drop和i.v組分別有8、10、20例，結(jié)果ANC0.5×109中位時(shí)間分別是

23、20、19、18.5天，IBM-drop組依賴靜脈營養(yǎng)和使用抗生素的時(shí)間明顯少于i.v組，而3組病例在急性和慢性GVHD發(fā)病率、移植相關(guān)死亡率、復(fù)發(fā)率及生存率方面無明顯差異。2003年Ikehara等14對(duì)此結(jié)果進(jìn)行回顧分析，認(rèn)為除了骨髓采集方法的影響外，Hagglund等19采用的髂骨骨髓腔滴注法容易使供體細(xì)胞過快地進(jìn)入外周血循環(huán)而不是停留于骨髓內(nèi)，因此不能達(dá)到最佳的注射效果。而目前的研究仍缺乏從臨床角度探討骨髓腔內(nèi)注射的最佳治療策略，如注射劑量、部位、速度等。   綜上所述，大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)肯定了不同來源供體細(xì)胞通過骨髓腔內(nèi)注射途徑能有效地歸巢并植入骨髓，達(dá)到迅速重建受體

24、造血和免疫功能，減少GVHD，誘導(dǎo)同種異基因器官移植免疫耐受，提高受體生存率的目的。這一技術(shù)值得進(jìn)一步進(jìn)入臨床移植研究和深入探討?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】  1Kushida T，Inaba M，Hisha H，et al. Intra-bone marrow injection of allogeneic bone marrow cells: a powerful new strategy for treatment of intractable autoimmune diseases in MRL/lpr mice. Blood，2001；97: 3292-32992Yahata T，And

25、o K，Sato T，et al. A highly sensitive strategy for SCID-repopulating cell assay by direct injection of primitive human hematopoietic cells into NOD/SCID mice bone marrow. Blood，2003；101: 2905-29133Szilvassy SJ，Meyerrose TE，Ragland PL，et al. Differential homing and engraftment properties of hematopoie

26、tic progenitor cells from murine bone marrow，mobilized peripheral blood，and fetal liver. Blood，2001；98: 2108-21154van-der Loo JC，Ploemacher RE. Marrow- and spleen-seeding efficiencies of all murine hematopoietic stem cell subsets are decreased by preincubation with hematopoietic growth factors. Bloo

27、d. 1995；85: 2598-26065 Cashman JD，Eaves CJ. High marrow seeding efficiency of human lymphomyeloid repopulating cells in irradiated NOD/SCID mice. Blood，2000；96: 3979-39816劉英，莊廣倫，游澤山等. 人臍血造血干細(xì)胞經(jīng)鼠卵黃囊進(jìn)行宮內(nèi)移植的實(shí)驗(yàn)研究. 中華醫(yī)學(xué)雜志，2003，83: 60-627Fan TX，Hisha H，Jin TN， et al. Successful allogeneic bone marrow transplantation (BMT) by injection of bone marrow cells via portal vein: stromal cells as BMT-facilitating cells. Stem Cells，2001；19:144-1508孫崇啟.嬰兒應(yīng)用急救藥物的靜脈替代途徑