液相色譜實(shí)用技術(shù)(一)

1、流動(dòng)相及樣品的預(yù)處理液相色譜實(shí)用技術(shù)（一）液相色譜實(shí)用技術(shù)（一）液相色譜對(duì)流動(dòng)相的要求液相色譜對(duì)流動(dòng)相的要求除色譜柱對(duì)流動(dòng)相的要求外，還有.與檢測(cè)器匹配.脫氣.避免鹵素離子（不銹鋼系統(tǒng)）.溶劑的粘度.細(xì)菌的生長(zhǎng)流動(dòng)相的脫氣流動(dòng)相的脫氣流動(dòng)相脫氣的目的.使色譜泵的輸液準(zhǔn)確輸液均勻準(zhǔn)確，并且脈動(dòng)減小保留時(shí)間及色譜峰面積的重現(xiàn)性提高.提高檢測(cè)的性能防止氣泡引起的尖峰基線(xiàn)穩(wěn)定，信噪比增加溶劑的紫外吸收本底降低.保護(hù)色譜柱減少死體積防止填料的氧化流動(dòng)相脫氣的方法流動(dòng)相脫氣的方法加熱.簡(jiǎn)單，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流動(dòng)相組成的變化抽真空.同上，一般在溶劑抽濾的同時(shí)，也有脫氣的效果超聲波.

2、簡(jiǎn)單，但效果不理想。通惰性氣體（一般用氦氣）.可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度在線(xiàn)脫氣機(jī).可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度樣品的預(yù)處理樣品的預(yù)處理樣品預(yù)處理的目的.除去微粒.減少干擾雜質(zhì).濃縮微量的組份.提高檢測(cè)的靈敏度及選擇性.改善分離的效果.有利于色譜柱及儀器的保護(hù)樣品預(yù)處理的重要性樣品預(yù)處理的重要性占樣品分析時(shí)間的比例（ 60%）.樣品預(yù)處理所用時(shí)間遠(yuǎn)大于色譜分離的時(shí)間占分析的消耗總成本最大.消耗大量的溶劑及其他化學(xué)品實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性及準(zhǔn)確性最差的環(huán)節(jié).影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果好壞的最重要因素 是決定性的步驟是決定性的步驟樣品預(yù)處理常用的方法樣品預(yù)處理常用的方法高速離心過(guò)濾、超濾選擇性沉淀衍生反應(yīng)液-固萃取

3、 / 液-液萃取. Sep-Pak樣品處理小柱新技術(shù)新技術(shù)-戴安公司的戴安公司的ASE快速溶劑萃取快速溶劑萃取樣品預(yù)處理的過(guò)程樣品預(yù)處理的過(guò)程去除微粒去除微粒過(guò)濾.過(guò)濾膜/過(guò)濾裝置有機(jī)(0.5m)/無(wú)機(jī)(0.45m)膜片可更換.一次性使用的膜“Cartridge”使用方便簡(jiǎn)單，交叉污染小有更小內(nèi)徑，可用于微量樣品的處理高速離心大于：10,000g超超 濾濾機(jī)理.超濾是一種基于分子量分離的技術(shù)目的.根據(jù)分子量的不同把分子、細(xì)胞及病毒等分為不同的餾份.除去小分子樣品中的大分子蛋白.脫鹽選擇性沉淀選擇性沉淀常用于生化樣品中除蛋白.有機(jī)溶劑乙腈，甲醇.強(qiáng)酸三氯乙酸，過(guò)氯酸.鹽50% 硫酸銨10% TC

4、A樣品衍生樣品衍生提高檢測(cè)的靈敏度.增加紫外基團(tuán)以增強(qiáng)紫外檢測(cè)的靈敏度.增加熒光基團(tuán)使樣品用高靈敏度熒光檢測(cè)器改變分離的選擇性.改變組份的基團(tuán)，如：變離子型化合物為非離子型，用反相方法分離典型的例子.氨基酸分析AccQ-Tag 衍生法衍生法NNOHOONO+NOR1R2HNNOOOHNH20NH2NOOOHN+AQC衍生試劑及氨基酸衍生后的氨基酸CO26-氨基鄝啉N-羥基琥珀酰亞胺N-羥基琥珀酰亞胺半衰期1秒半衰期約15秒濃縮樣品濃縮樣品濃縮樣品的方法. 萃取/吹干. 沉淀/再溶解. 色譜法. 液固抽提/Sep-Pak小柱固相萃?。ü滔噍腿。⊿PE）技術(shù)）技術(shù)固相萃取技術(shù)是基于同液相色譜同樣技

5、術(shù)開(kāi)發(fā)的產(chǎn)品，分離復(fù)雜樣品中的不同組份固相萃取技術(shù)（SPE）的重要性.實(shí)驗(yàn)室中6080%的成本及工作量在樣品制備上加速樣品的制備時(shí)間降低樣品前處理的成本提高分析的準(zhǔn)確性及回收率更容易自動(dòng)化減少樣品處理步驟降低對(duì)不穩(wěn)定樣品的影響提高安全性 SPE小柱小柱專(zhuān)門(mén)開(kāi)發(fā)了固相萃取技術(shù)（SPE）SPE 小柱的應(yīng)用領(lǐng)域.除去雜質(zhì)及干擾組份.把樣品分成不同極性的組分析.富集微量的組份SPE 小柱的主要種類(lèi).反相.正相.離子交換Sep-Pak的種類(lèi)的種類(lèi)根據(jù)Sep-Pak及樣品的性質(zhì)，選洗脫強(qiáng)度不同的溶劑把樣品分開(kāi)讓樣品的各組份在固定相上吸附、解吸附，或不與固定相作用. 讓所感興趣的樣品通過(guò)小柱，雜質(zhì)留在柱上.

6、 讓雜質(zhì)留在柱上，所感興趣的樣品通過(guò)小柱反 相正 相離子交換固定相非非極極性性極極性性帶帶電電荷荷溶 劑從從極極性性到到非非極極性性從從非非極極性性到到極極性性p pH H或或離離子子強(qiáng)強(qiáng)度度( (低低到到高高) )各種各種Sep-Pek小柱（一）小柱（一）正相.包括 Silica / Florisil / NH2 / Diol / CN / Alumina可先用6到10倍柱體積的非極性（通常是樣品溶液）平衡加入樣品用非極性溶劑洗脫不想要的組份用極性溶劑洗脫第一組感興趣的組份用極性更強(qiáng)的溶劑洗脫剩下的感興趣的組份.在不同條件下，有些填料可以用于反相或離子交換，如 NH2 / CN.確認(rèn)回收率各

7、種各種Sep-Pek小柱（二）小柱（二）反相.包括 C18 / C8 / Diol / NH2 / CN可先用6到10倍柱體積的甲醇或乙腈活化，再用6到10倍柱體積的水或緩沖液平衡，不要讓小柱干了樣品溶解在強(qiáng)一些極性的溶劑中加入樣品用強(qiáng)極性溶劑洗脫不想要的組份用極性弱些的溶劑洗脫第一組感興趣的組份用極性更弱的溶劑洗脫剩下的感興趣的組份.確認(rèn)回收率各種各種Sep-Pek小柱小柱(三三)離子交換.包括 Accell Plus CM / Accell Plus QMA / NH2可先用6到10倍柱體積的去離子水或弱緩沖液平衡，樣品溶解在去離子水或弱緩沖液中加入樣品用弱緩沖液洗脫不想要的組份用強(qiáng)一些緩

8、沖液（改變pH或離子強(qiáng)度）洗脫第一組感興趣的組份用更強(qiáng)的緩沖液洗脫剩下的感興趣的組份.確認(rèn)回收率Sep-Pak小柱的方法開(kāi)發(fā)小柱的方法開(kāi)發(fā)SPE方法開(kāi)發(fā)的幾個(gè)關(guān)鍵因素.文獻(xiàn)查閱.流速控制同色譜理論：以10ml/min潤(rùn)濕小柱，15ml/min加載樣品離子交換填料或固定相少于100mg的小柱，用更低的流速加載樣品以15ml/min流速洗脫樣品.注意樣品本底的不同.注意載荷量及加樣方式快速溶劑萃取快速溶劑萃取ASEtASE 的的原理原理是選擇合適的溶劑、通過(guò)增是選擇合適的溶劑、通過(guò)增加溫度和壓力來(lái)提高萃取過(guò)程的效率加溫度和壓力來(lái)提高萃取過(guò)程的效率.tASE 是用溶劑對(duì)固體、半固體的樣品進(jìn)是用溶劑對(duì)

9、固體、半固體的樣品進(jìn)行萃取的技術(shù)行萃取的技術(shù).tASE 可用來(lái)代替索氏提取、超聲萃取、可用來(lái)代替索氏提取、超聲萃取、手工振搖、煮沸法和其他萃取方法手工振搖、煮沸法和其他萃取方法.ASE 200 增加溫度的作用t 增加分析物的溶解度增加分析物的溶解度- 蒽在蒽在150度氯甲烷中的溶度氯甲烷中的溶解度是解度是50度時(shí)的度時(shí)的15倍倍t 有利于克服基體效應(yīng)，加有利于克服基體效應(yīng)，加快解析動(dòng)力學(xué)快解析動(dòng)力學(xué)t 降低溶劑粘度，加速溶劑降低溶劑粘度，加速溶劑分子向基體中的擴(kuò)散分子向基體中的擴(kuò)散 讓溶劑讓溶劑 在高溫下仍保持液態(tài)在高溫下仍保持液態(tài) 可保證易揮發(fā)性物質(zhì)不揮發(fā)可保證易揮發(fā)性物質(zhì)不揮發(fā) 在壓力下可

10、快速充滿(mǎn)萃取池在壓力下可快速充滿(mǎn)萃取池升高的壓力的作用升高的壓力的作用ASE 工作流程工作流程將樣品裝入萃取池將樣品裝入萃取池 Time(min溶劑充滿(mǎn)萃取池溶劑充滿(mǎn)萃取池萃取池加熱加壓萃取池加熱加壓樣品保持一定的壓力和溫度樣品保持一定的壓力和溫度 (靜態(tài)萃?。╈o態(tài)萃?。┫蜉腿〕刂凶⑷肭鍧嵢軇┫蜉腿〕刂凶⑷肭鍧嵢軇┯糜肗2 吹掃萃取池吹掃萃取池萃取液準(zhǔn)備分析萃取液準(zhǔn)備分析.TotalASE的突出優(yōu)點(diǎn)的突出優(yōu)點(diǎn)溶劑用量少溶劑用量少萃取效率高萃取效率高樣品基體影響小樣品基體影響小可同時(shí)選用四種溶劑萃取可同時(shí)選用四種溶劑萃取安全，全自動(dòng)安全，全自動(dòng)快速，快速，15分鐘分鐘EPA標(biāo)準(zhǔn)方法：標(biāo)準(zhǔn)方法：U

11、S EPA Method 3545A16530脂溶性.A, D, E, K.通常用正己烷萃取水溶性.B1, B2, B6, C, 尼克酸 等.通常用甲醇萃取維生素的傳統(tǒng)萃取方法與維生素的傳統(tǒng)萃取方法與ASE萃取法比較萃取法比較Traditional MethodsFat soluble A, D, E, K.150 300 mL 正己正己烷烷.回流回流 or 振搖振搖13 hoursWater soluble B complex, C.150300 mL甲醇甲醇.回流回流 or 振搖振搖13 hoursASE MethodsFat soluble A, D, E, K.1545 mL正己烷正己烷.15 minWater soluble B, C.1545 mL 甲醇甲醇.15 m