DNA電泳實驗步驟

1、DNA凝膠電泳凝膠電泳DNA agarose gel electrophoresis實驗七實驗七 瓊脂糖凝膠電泳是常用的用于分離、鑒定DNA、RNA分子混合物的方法，這種電泳方法以瓊脂凝膠作為支持物，利用DNA分子在泳動時的電荷效應和分子篩效應，達到分離混合物的目的。DNA分子在高于其等電點的溶液中帶負電，在電場中向陽極移動。在一定的電場強度下，DNA分子的遷移速度取決于分子篩效應，即分子本身的大小和構型是主要的影響因素。DNA分子的遷移速度與其相對分子量成反比。不同構型的DNA分子的遷移速度不同。如環(huán)形DNA分子樣品，其中有三種構型的分子：共價閉合環(huán)狀的超螺旋分子（cccDNA）、開環(huán)分子(

2、ocDNA)、和線形DNA分子(IDNA)。這三種不同構型分子進行電泳時的遷移速度大小順序為:cccDNAIDNAocDNA 當用低濃度的熒光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色，在紫外光下至少可以檢出1-10ng的DNA條帶，從而可以確定DNA片段在凝膠中的位置。此外，還可以從電泳后的凝膠中回收特定的DNA條帶，用于以后的克隆操作。 實驗原理實驗原理實驗材料：實驗材料：PCR產(chǎn)物產(chǎn)物,植物基因組植物基因組DNA,質(zhì)粒質(zhì)粒DNA等等，購買，購買 或自行提取純化。或自行提取純化。實驗試劑：實驗試劑：5TBE電泳緩沖液：電泳緩沖液： 6電泳載樣緩沖液：電泳載樣緩沖液：0

3、.25 溴粉藍，溴粉藍，40(w/v) 蔗糖水溶蔗糖水溶液，貯存于液，貯存于 4。 溴化乙錠溴化乙錠(EB)溶液母液：將溶液母液：將EB配制成配制成10 mg/mL，用鋁箔，用鋁箔或黑紙包裹容器或黑紙包裹容器,儲于室溫即可。儲于室溫即可。 實驗材料和試劑實驗材料和試劑微波爐微波爐實驗儀器實驗儀器凝膠電泳槽凝膠電泳槽凝膠成像凝膠成像系統(tǒng)系統(tǒng)實驗步驟實驗步驟1.取取5TBE緩沖液緩沖液20mL加水至加水至200mL，配制成配制成0.5TBE稀釋緩沖液稀釋緩沖液，待用。待用。 2.膠液的制備：稱取膠液的制備：稱取0.4g瓊脂糖瓊脂糖，置于置于200mL錐形瓶中錐形瓶中，加入加入50mL 0.5TBE

4、稀釋緩沖液稀釋緩沖液，放入微波爐里加熱至瓊脂糖全部熔化放入微波爐里加熱至瓊脂糖全部熔化，取出搖取出搖勻勻，此為此為0.8瓊脂糖凝膠液。加熱過程中要不時搖動瓊脂糖凝膠液。加熱過程中要不時搖動，使附于瓶壁上使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進入溶液。的瓊脂糖顆粒進入溶液。3.膠板的制備：將有機玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏緊密封住。將封好的膠膠板的制備：將有機玻璃膠槽兩端分別用橡皮膏緊密封住。將封好的膠槽置于水平支持物上，插上樣品梳子，注意觀察梳子齒下緣應與膠槽底槽置于水平支持物上，插上樣品梳子，注意觀察梳子齒下緣應與膠槽底面保持面保持1mm左右的間隙。左右的間隙。 向冷卻至向冷卻至50-60的瓊脂糖膠液中加入溴

5、化乙的瓊脂糖膠液中加入溴化乙錠錠(EB)溶液使其終濃度為溶液使其終濃度為0.5g /mL。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖。用移液器吸取少量融化的瓊脂糖凝膠封橡皮膏內(nèi)側(cè)，待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠凝膠封橡皮膏內(nèi)側(cè)，待瓊脂糖溶液凝固后將剩余的瓊脂糖小心地倒入膠槽內(nèi)，使膠液形成均勻的膠層。待膠完全凝固后撥出梳子，注意不要損槽內(nèi)，使膠液形成均勻的膠層。待膠完全凝固后撥出梳子，注意不要損傷梳底部的凝膠，然后向槽內(nèi)加入傷梳底部的凝膠，然后向槽內(nèi)加入0.5TBE稀釋緩沖液至液面恰好沒稀釋緩沖液至液面恰好沒過膠板上表面。過膠板上表面。 4. 加樣：取加樣：取10L DNA樣品與樣品與2L 6上

6、樣液混勻，用微量移液槍小心上樣液混勻，用微量移液槍小心加入樣品槽中。若加入樣品槽中。若DNA含量偏低，則可依上述比例增加上樣量，但含量偏低，則可依上述比例增加上樣量，但總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個樣品要更換總體積不可超過樣品槽容量。每加完一個樣品要更換tip頭，以防止頭，以防止互相污染，注意上樣時要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞炕ハ辔廴?，注意上樣時要小心操作，避免損壞凝膠或?qū)悠凡鄣撞磕z刺穿。凝膠刺穿。 5. 電泳：加完樣后電泳：加完樣后,合上電泳槽蓋，立即接通電源?？刂齐妷罕３衷诤仙想娪静凵w，立即接通電源?？刂齐妷罕３衷?0-80V，電流在，電流在40mA以上。當溴酚藍條帶移

7、動到距凝膠前沿約以上。當溴酚藍條帶移動到距凝膠前沿約2cm時，時，停止電泳。停止電泳。6. 染色：未加染色：未加EB的膠板在電泳完畢后移入的膠板在電泳完畢后移入0.5g/mL的的EB溶液中，室溫溶液中，室溫下染色下染色20-25min。 7. 觀察和拍照：在波長為觀察和拍照：在波長為254nm的長波長紫外燈下觀察染色后的或已的長波長紫外燈下觀察染色后的或已加有加有EB的電泳膠板。的電泳膠板。 瓊脂糖通常用水平裝置在強度和方向恒定的電場下瓊脂糖通常用水平裝置在強度和方向恒定的電場下電泳。瓊脂糖主要在電泳。瓊脂糖主要在DNA制備電泳中作為一種固體支制備電泳中作為一種固體支持基質(zhì)，其密度取決于瓊脂糖

8、的濃度。在電場中，在中持基質(zhì)，其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場中，在中性性pH值下帶負電荷的值下帶負電荷的DNA向陽極遷移，其遷移速率由向陽極遷移，其遷移速率由下列多種因素決定：下列多種因素決定： 1、 DNA的分子大小的分子大小 2、 瓊脂糖濃度瓊脂糖濃度 3、 DNA分子的構象分子的構象 4、 電源電壓電源電壓 5、嵌入染料的存在、嵌入染料的存在 6、 離子強度影響離子強度影響 DNADNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶 1. EB是強誘變劑并有中等毒性，配制和使用時都應戴手套，是強誘變劑并有中等毒性，配制和使用時都應戴手套，并且不要把并且不要把EB灑到桌面或地面上。凡是沾污了灑到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器的容器或物品必須經(jīng)專門處理后才能清洗。沾染了或物品必須經(jīng)專門處理后才能清洗。沾染了EB的垃圾要專的垃圾要專門處理后才可丟棄。門處理后才可丟棄。2. 當當EB太多太多, 膠染色過深，膠染色過深，DNA帶看不清時，可將膠放入蒸帶看不清時，可將膠放入蒸餾水沖泡，餾水沖泡，30min后再觀察。后再觀察。 3. 制備凝膠時，倒膠的溫度不可