基因克隆備課教案

1、備 課 教 案學(xué)年學(xué)期：2011-2012秋季學(xué)期課程名稱(chēng)：基因克隆主講教師：李海英授課對(duì)象：2009級(jí)生命科學(xué)學(xué)院本科黑 龍 江 大 學(xué)1 / 42第 1 教學(xué)周/第 3.4.5 節(jié) （第 1 次課）教 學(xué) 基 本 內(nèi) 容備注教學(xué)目的：通過(guò)本章的學(xué)習(xí)，使學(xué)生掌握基因克隆、重組DNA等相關(guān)概念，同時(shí)介紹基因工程的發(fā)展簡(jiǎn)史和基因工程的巨大意義，引導(dǎo)學(xué)生對(duì)科學(xué)的嚴(yán)謹(jǐn)、謙虛態(tài)度。教 具：多媒體課件教學(xué)重點(diǎn)：DNA嵌合體概念課時(shí)安排：3學(xué)時(shí)教學(xué)難點(diǎn)：基因克隆與基因表達(dá)的技術(shù)路線(xiàn)的區(qū)別教學(xué)內(nèi)容： 第一章 緒論一、基因工程的概念1. 基因工程（genetic engineering）、遺傳工程、重組體DN

2、A技術(shù)2. 嵌合DNA、DNA嵌合體（DNA chimera)3. 分子克?。╩olecular cloning)、基因克隆 (gene cloning)、重組DNA (recombinant DNA)4. 基因工程的操作步驟（1）基因克隆的操作步驟（2）基因表達(dá)的操作步驟二、基因工程發(fā)展簡(jiǎn)史三、基因工程的巨大意義1. 利用微生物制藥（1）利用微生物生產(chǎn)胰島素（2）重組微生物生產(chǎn)生長(zhǎng)激素（3）重組微生物生產(chǎn)干擾素2. 克隆技術(shù)（clone technology）（1）克隆的概念（2）器官移植1、啟發(fā)式教學(xué)內(nèi)容：?jiǎn)l(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)科學(xué)和實(shí)驗(yàn)操作的態(tài)度。2、互動(dòng)教學(xué)內(nèi)容：課堂討論克隆的倫理道德問(wèn)題。（

3、3）干細(xì)胞研究及人類(lèi)倫理觀念3. 基因工程育種（1）基因改造的農(nóng)作物（2）轉(zhuǎn)基因動(dòng)物四、基因工程的安全性問(wèn)題復(fù)習(xí)題1、基因克隆與基因表達(dá)技術(shù)路線(xiàn)的區(qū)別。 2、收集整理有關(guān)轉(zhuǎn)基因植物、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的報(bào)道和照片資料。3、啟發(fā)式教學(xué)內(nèi)容通過(guò)對(duì)轉(zhuǎn)基因植物和轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的介紹，激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣。 第 2 教學(xué)周/第 3.4.5 節(jié) （第 2 次課）教 學(xué) 基 本 內(nèi) 容備注教學(xué)目的：本節(jié)主要講述有關(guān)“限制性核酸內(nèi)切酶”的相關(guān)知識(shí)，通過(guò)對(duì)大腸桿菌限制-修飾現(xiàn)象的講解，引導(dǎo)學(xué)生探究宿主控制性限制的生物學(xué)機(jī)理；掌握各類(lèi)限制性核酸內(nèi)切酶的生物學(xué)功能和命名原則。教 具：多媒體課件教學(xué)重點(diǎn)：型限制性核酸內(nèi)切酶的特點(diǎn)和

4、限制性核酸內(nèi)切酶生物學(xué)功能的英文表述。課時(shí)安排：3學(xué)時(shí)教學(xué)難點(diǎn)：限制-修飾現(xiàn)象的理解教學(xué)內(nèi)容：第二章 基因工程的工具酶第一節(jié) 限制性核酸內(nèi)切酶一、限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn) 1. 發(fā)現(xiàn)過(guò)程2. 相關(guān)概念（1）限制 (restriction) （2）修飾 (modification) （3）宿主控制性限制(hostcontrolled restriction) 3. 限制性核酸內(nèi)切酶的生物學(xué)功能Restriction-modification systems occur in many bacterial species, and constitute a defense mechanism aga

5、inst the introduction of foreign DNA into the cell. They consist of two components; the first is a restriction endonuclease, which recognizes a short, symmetrical DNA sequence, and cuts (hydrolyzes) the DNA backbone in each strand at a specific site within that sequence. Foreign DNA will hence be de

6、graded to relatively short fragments. The second component of the system is a1、課前提問(wèn)（1）DNA嵌合體概念（2）基因克隆的操作步驟（3）基因表達(dá)的操作步驟2、通過(guò)對(duì)大腸桿菌限制-修飾現(xiàn)象的描述，引導(dǎo)學(xué)生探究其中的原因。3、利用對(duì)Smith和Nathans獲得1978年諾貝爾生物醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)的介紹，激勵(lì)學(xué)生探索生命的奧秘。 methylase, which adds a methyl group to a C or A base within the same recognition sequences in the c

7、ellular DNA. This modification renders the host DNA resistant to degradation by the endonuclease.二、限制性核酸內(nèi)切酶的分類(lèi)1. 型限制性核酸內(nèi)切酶2. 型限制性核酸內(nèi)切酶（1）一般性質(zhì)（2）型酶的識(shí)別序列與切割作用A. 識(shí)別序列B. 平末端（blunt/flush end/termini)C. 粘性末端（sticky/cohesive end/termini)（3）型限制性?xún)?nèi)切酶的特點(diǎn)（4）酶切位點(diǎn)的計(jì)算3. III型限制性?xún)?nèi)切酶三、限制性核酸內(nèi)切酶的命名復(fù)習(xí)題一、填空題1、完全的回文序列具有兩個(gè)

8、基本的特點(diǎn)，分別是（ ）和（ ）。2、由于DNA是由4種堿基組成的，所以任何限制性?xún)?nèi)切核酸酶的切割頻率的理論值應(yīng)該是（ ）。3、第一個(gè)用于構(gòu)建重組體的限制性?xún)?nèi)切核酸酶是（ ）。4、核酸內(nèi)切酶命名原則是，第一個(gè)大寫(xiě)字母取自（ ），第二、三兩個(gè)字母取自（ ），第四個(gè)字母則用（ ）表示。4、注意區(qū)別粘性末端和平末端、同裂酶和同尾酶兩對(duì)概念。二、簡(jiǎn)答題下面幾種序列中，那些最有可能是類(lèi)酶的識(shí)別序列，為什么？ GAATCG，AAATTT，GATATC，ACGGCA第 3 教學(xué)周/第 3.4.5 節(jié) （第 3 次課）教 學(xué) 基 本 內(nèi) 容備注教學(xué)目的：通過(guò)本章的學(xué)習(xí)，使學(xué)生掌握天然DNA的制備、純化和濃縮以

9、及限制性?xún)?nèi)切酶反應(yīng)系統(tǒng)的建立，本章重點(diǎn)內(nèi)容是影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的各種因素，并要求學(xué)生掌握限制性核酸內(nèi)切酶的星活性、限制性圖譜等概念。教 具：多媒體課件、教具教學(xué)重點(diǎn)：影響核酸內(nèi)切限制酶活性的因素課時(shí)安排：3學(xué)時(shí)教學(xué)難點(diǎn)：DNA分子的限制性圖譜的構(gòu)建教學(xué)內(nèi)容： 第二章 基因工程的工具酶 第二節(jié) DNA分子片段化一、天然DNA的制備 1. 天然DNA的來(lái)源2. 天然DNA的提取 二、DNA的純化 三、DNA的濃縮 四、限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)系統(tǒng) 1. 限制性核酸內(nèi)切酶反應(yīng)緩沖液 2. 單酶切法 3. 雙酶切法 4. 部分酶切5. DNA分子的限制性圖譜五 、影響核酸內(nèi)切限制酶活性的因素1、 課

10、前提問(wèn)型限制性核酸內(nèi)切酶的特點(diǎn)。2、互動(dòng)教學(xué)內(nèi)容：讓學(xué)生總結(jié)DNA的制備、DNA的純化和DNA的濃縮三個(gè)概念的區(qū)別，引導(dǎo)學(xué)生利用比較的方法學(xué)習(xí)知識(shí)。1. 性活性2. DNA樣品的純度3. DNA甲基化的程度4. DNA的分子結(jié)構(gòu)5. 側(cè)翼序列長(zhǎng)度6. 酶切反應(yīng)緩沖液7. 酶切反應(yīng)溫度和時(shí)間復(fù)習(xí)題1. 什么是限制性?xún)?nèi)切酶的星活性？受哪些因素影響？2. 分別用EcoR、Hpa、EcoR+Hpa酶切一個(gè)DNA片段的三個(gè)樣品，然后通過(guò)凝膠電泳分離 DNA片段，溴化乙錠染色后觀察DNA帶型（如下圖），請(qǐng)根據(jù)這些結(jié)果，繪制一個(gè)限制性圖譜，要標(biāo)明EcoR和Hpa識(shí)別位點(diǎn)間的相對(duì)位置，以及它們之間的距離（kb

11、）。并請(qǐng)寫(xiě)出分析的過(guò)程 第 4 教學(xué)周/第 3.4.5 節(jié) （第 4 次課）教 學(xué) 基 本 內(nèi) 容備注教學(xué)目的：通過(guò)本章的學(xué)習(xí)，使學(xué)生掌握DNA聚合酶概念、分類(lèi)、各種DNA聚合酶的性質(zhì)和用途，以及對(duì)一些專(zhuān)業(yè)名詞的正確理解，如間斷、缺刻等。教 具：多媒體課件教學(xué)重點(diǎn)：各種DNA聚合酶的性質(zhì)和用途課時(shí)安排：3學(xué)時(shí)教學(xué)難點(diǎn)：用切口平移（缺口轉(zhuǎn)移）方法標(biāo)記DNA以及一些專(zhuān)業(yè)名詞的正確理解。教學(xué)內(nèi)容： 第二章 基因工程的工具酶第三節(jié) DNA聚合酶 一、DNA聚合酶概述1. DNA聚合酶（polymerase）的概念 2. DNA聚合酶的分類(lèi)（1）以DNA聚合酶I為代表的“合成型”；（2）以klenow聚

12、合酶為代表，只有聚合酶活性和部分外切酶的活性；（3）逆轉(zhuǎn)錄酶類(lèi)，以RNA作為聚合模板。二、大腸桿菌DNA聚合酶I（全酶）1. 性質(zhì)2. 用途：用切口平移（缺口轉(zhuǎn)移）方法標(biāo)記DNA三、大腸桿菌DNA聚合酶I大片段（Klenow片段）1. 性質(zhì)1、課前提問(wèn)：（1）影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素有哪些？（2）雙酶切時(shí)有哪些是需要主義的問(wèn)題？2、 啟發(fā)式教學(xué)內(nèi)容：（1）啟發(fā)學(xué)生比較間斷（discontinuity）和缺刻（nick）兩個(gè)概念。 （2）引導(dǎo)學(xué)生比較三類(lèi)DNA聚合酶在作用方式上的差別。3、課堂活動(dòng)內(nèi)容：大腸桿菌DNA聚合酶I同時(shí)具有53方向的聚合酶活性和2. 用途四、T4噬菌體DNA聚合酶

13、1. 性質(zhì)2. 用途五、T7噬菌體DNA聚合酶1. 性質(zhì)2. 主要用途六、Taq DNA聚合酶1. 性質(zhì)2. 用途：用于PCR反應(yīng)，使得PCR技術(shù)得以推廣。七、逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase）（依賴(lài)于RNA的DNA聚合酶）1. 性質(zhì)2. 用途復(fù)習(xí)題一、填空1. T4 DNA聚合酶與Klenow酶一樣，具有53 聚合酶和3 5外切酶兩種活性，但它的35外切酶活性比Klenow酶強(qiáng)（ ）倍，T4 DNA聚合酶作用于（ ）鏈的活性要強(qiáng)于（ ）鏈。2. 反轉(zhuǎn)錄酶除了催化DNA的合成外，還具有（ ）的作用，可以將DNA -RNA雜種雙鏈中的（ ）水解掉。二、判斷題1. 反轉(zhuǎn)錄酶能夠

14、以單鏈RNA或DNA為模板，在引物的引發(fā)下合成一條互補(bǔ)的DNA鏈。2. 以 RNA為模板，用反轉(zhuǎn)錄酶可同時(shí)產(chǎn)生單鏈和雙鏈的 cDNA，雙鏈 DNA是由自身引物引導(dǎo)合成。三、問(wèn)答題35核酸外切酶活性，這意味著即使53方向的聚合酶活性新合成了DNA分子也會(huì)立即被其同時(shí)具有的35核酸外切酶活性所降解。真實(shí)情況是這樣的嗎？4、課堂互動(dòng)內(nèi)容自1983年P(guān)CR技術(shù)問(wèn)世年到發(fā)明人 Dr. Kary Mullis 1993年獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)經(jīng)歷了10年的時(shí)間，那么一項(xiàng)技術(shù)得到廣泛應(yīng)用、認(rèn)同需要什么？如何利用T4 NA聚合酶制備3隱含末端或雙鏈平末端？第 5 教學(xué)周/第 3.4.5 節(jié) （第 5 次課）教 學(xué)

15、基 本 內(nèi) 容備注教學(xué)目的：通過(guò)對(duì)本次課的學(xué)習(xí)，重點(diǎn)使學(xué)生掌握錨定PCR、不對(duì)稱(chēng)PCR和反向PCR三種特殊的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以及一種分子標(biāo)記技術(shù)RAPD。教 具：多媒體課件教學(xué)重點(diǎn)：三種特殊的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的原理課時(shí)安排：3學(xué)時(shí)教學(xué)難點(diǎn)：RAPD技術(shù)的基本原理教學(xué)內(nèi)容：第二章 基因工程的工具酶第四節(jié) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及應(yīng)用一、 錨定PCR1. 已知序列3端區(qū)域的擴(kuò)增 2. 已知序列5端區(qū)域的擴(kuò)增 二、不對(duì)稱(chēng)PCR三、反向PCR 第五節(jié) RAPD技術(shù)一、多態(tài)性（polymorphism)1. 多態(tài)性/差異性的概念2. 多態(tài)性的種類(lèi)3. 多態(tài)性產(chǎn)生的過(guò)程4. 多態(tài)性的相關(guān)技術(shù)1、課前提問(wèn)：（1）缺刻（

16、nick）和間斷（discontinuity）兩個(gè)概念。（2）比較各種DNA聚合酶的活性用什么不同之處?；?dòng)內(nèi)容：提問(wèn)常規(guī)PCR的原理，引導(dǎo)學(xué)生思考如果目的片段兩側(cè)的序列未知，而是只知道目的片段中間的一部分的序列信息，用什么方法可以獲得目的片段？二、RAPD基本原理三、技術(shù)問(wèn)題1. 引物 2. Mg2+濃度要求四、RAPD技術(shù)的應(yīng)用1. 遺傳指紋作圖 2. 檢測(cè)遺傳多樣性與穩(wěn)定性復(fù)習(xí)題1. 生么情況下可以考慮使用不對(duì)稱(chēng)PCR?2. 反向PCR的原理？3. RACE技術(shù)的原理？第 6 教學(xué)周/第 3.4.5 節(jié) （第 6 次課）教 學(xué) 基 本 內(nèi) 容備注教學(xué)目的：通過(guò)對(duì)本次課的學(xué)習(xí)，重點(diǎn)使學(xué)生掌

17、握DNA連接酶相關(guān)知識(shí)，如DNA連接酶的特性、粘性末端連接技術(shù)、連接反應(yīng)的建立等。教 具：多媒體課件教學(xué)重點(diǎn)：DNA連接酶的功能和粘性末端連接技術(shù)課時(shí)安排：3學(xué)時(shí)教學(xué)難點(diǎn)：粘性末端連接技術(shù)教學(xué)內(nèi)容：第二章 基因工程的工具酶第六節(jié) DNA連接酶（ligase） 一、連接酶反應(yīng)1. 間斷修復(fù)功能2. 連接功能二、常用的DNA連接酶1. E. coli DNA連接酶 2. T4 DNA連接酶T4 DNA ligase repairs breaks in a dsDNA backbone and can covalently rejoin annealed cohesive ends in the r

18、everse of a restriction enzyme reaction,to create new DNA molecules.T4 ligase can even ligate one blunt end to another,albeit with rather lower efficiency.課前提問(wèn)：1、反向PCR？2、RAPD的原理？課堂互動(dòng)內(nèi)容1. 啟發(fā)學(xué)生思考DNA連接酶和DNA聚合酶的功能差別。2. 為什么在基因克隆中連接酶是另一個(gè)重要的工具酶？3. 為什么粘性末端要比平末端的連接效率要高？3. RNA連接酶三、粘性末端連接技術(shù) 1、銜接體(linker)技術(shù) 2、結(jié)

19、合體(adaptor)技術(shù)3、同聚體(homopolymer)加尾技術(shù)第七節(jié) 結(jié)合體技術(shù)的應(yīng)用AFLP一、 概述二、 基本原理AFLP technology is based on the selective amplification of genomic restriction fragment using PCR. DNA is digested with restriction endonucleases, and double-stranded DNA adapters are ligated to the ends of the DNA fragments to generate

20、template DNA for amplification. Thus, the sequence of the adapers and the adjacent restriction site serve as primer binding sites for subsequent amplification of the restricton fragments by PCR. Selective nucleotides extending into the restriction fragments are added to the 3 ends of the PCR primers

21、 such that only restriction fragments in which the nucleotide flanking the restriction site match the selective nucleotide will be amplified. The amplified fragments are then analyzed by gel electrophoresis to generate the fingerprint.三、 技術(shù)特點(diǎn)四、主要應(yīng)用復(fù)習(xí)題（填空題）（1）為了防止 DNA的自身環(huán)化，可用（ ）脫去雙鏈 DNA( )。（2）欲將某一具有突

22、出單鏈末段的雙鏈 DNA分子轉(zhuǎn)變成平末段的雙鏈形式，統(tǒng)常可采用（ ）和（ ）的作用。課堂互動(dòng)內(nèi)容：粘性末端的連接效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于平末端的連接，但在基因工程操作中得到的片段往往都是平末端的，同學(xué)們能否想出一些辦法，將本是平末端的連接轉(zhuǎn)變成粘性末端的連接呢？2、判斷題（1）T4 DNA連接酶和E.coli連接酶都能催化平末端和粘性末端的連接。（2） T4 DNA連接酶和E.coli連接酶都能催化雙鏈DNA和單鏈DNA連接。第 7 教學(xué)周/第 1.2.3 節(jié) （第 7 次課）教 學(xué) 基 本 內(nèi) 容備注教學(xué)目的：本節(jié)課主要講述核酸修飾酶（如未端轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶、多核苷酸激酶等）、單鏈核酸內(nèi)切酶（如S1核

23、酸酶和Bal 31核酸酶等）以及核酸外切酶等基因工程常用酶，使學(xué)生掌握這些酶的生物學(xué)活性，明確這些酶在基因工程中的應(yīng)用。教 具：多媒體課件教學(xué)重點(diǎn)：核酸修飾酶和單鏈核酸內(nèi)切酶生物學(xué)活性課時(shí)安排：3學(xué)時(shí)教學(xué)難點(diǎn)：核酸修飾酶的應(yīng)用教學(xué)內(nèi)容：第八節(jié) 基因工程的其它酶類(lèi)一、核酸修飾酶1. 未端（脫氧核苷酸）轉(zhuǎn)移酶 2. 堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）3. 多核苷酸激酶(polynucleotide kinase)二、單鏈核酸內(nèi)切酶1. S1核酸酶2. Bal 31核酸酶三、核酸外切酶(exonucleases)1. 核酸外切酶VII(exoVII) 課前提問(wèn)：1、AFLP技術(shù)的

24、英文表述？2、銜接體(linker)、結(jié)合體(adaptor)、同聚體(homopolymer)加尾等技術(shù)。課堂互動(dòng)內(nèi)容在基因操作中，常常會(huì)遇到不希望發(fā)生連接作用的互補(bǔ)粘性末端末端發(fā)生了自連作用，引導(dǎo)學(xué)生思考怎樣才能避免這種情況的發(fā)生？2. 核酸外切酶III (exoIII)3. 核酸外切酶(exo) 4. T7基因6核酸外切酶復(fù)習(xí)題1. 欲將某一具有突出單鏈末段的雙鏈 DNA分子轉(zhuǎn)變成平末段的雙鏈形式，統(tǒng)?？刹捎茫?）和（ ）的作用。2. 為了防止 DNA的自身環(huán)化，可用（ ）脫去雙鏈 DNA( )。3.、簡(jiǎn)答題按適當(dāng)?shù)捻樞?，列出將一種mRNA的cDNA克隆到表達(dá)載體所用到的酶。第 8 教學(xué)

25、周/第 3.4.5 節(jié) （第 8 次課）教 學(xué) 基 本 內(nèi) 容備注教學(xué)目的：本章首先基因克隆技術(shù)做了概述講述了基因工程載體的基本概念和載體的種類(lèi)、性質(zhì)。著重介紹了質(zhì)粒載體的概念、生物學(xué)特性、質(zhì)粒的遺傳與復(fù)制、構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的基本策略。教 具：多媒體課件教學(xué)重點(diǎn)：質(zhì)粒的生物學(xué)特性課時(shí)安排：3學(xué)時(shí)教學(xué)難點(diǎn)：構(gòu)建質(zhì)粒克隆載體的基本策略教學(xué)內(nèi)容：第三章 基因工程載體第一節(jié) 基因克隆技術(shù)概述一、基因克隆技術(shù)二、目的基因的取得三、重組體的構(gòu)建1. 載體的概念2. 載體的性質(zhì)四、轉(zhuǎn)化及重組子篩選鑒定1. 轉(zhuǎn)化（transformation)2. 重組子課前提問(wèn)：采取什么措施可以防止接頭發(fā)生自連作用？課堂互

26、動(dòng)內(nèi)容：基因工程操作為什么要用到載體？課堂互動(dòng)內(nèi)容：轉(zhuǎn)化子與重組子的區(qū)別？3. 重組子的篩選方法第二節(jié) 質(zhì)粒載體（Plasmid Vector）一、質(zhì)粒的概念二、質(zhì)粒的一般生物學(xué)特性1. 質(zhì)粒DNA（1）SC構(gòu)型（2）OC構(gòu)型（3）L型2. 質(zhì)粒的復(fù)制與遺傳3. 構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的基本策略 4. 質(zhì)粒的改造復(fù)習(xí)題 1、 基因克隆技術(shù)的一般過(guò)程？2、 在瓊脂糖凝膠電泳中，質(zhì)粒DNA的SC型、OC型和L型是如何分布的？3、 質(zhì)粒載體必須具備的4個(gè)特性？4、 構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的基本策略？ 課堂互動(dòng)內(nèi)容：質(zhì)粒DNA在瓊脂糖凝膠上會(huì)呈現(xiàn)出幾條帶？為什么？第 9 教學(xué)周/第 3.4.5 節(jié) （第 9 次課

27、）教 學(xué) 基 本 內(nèi) 容備注教學(xué)目的：本章主要講述pBR322質(zhì)粒載體、pUC質(zhì)粒載體、TA克隆載體和酵母中的質(zhì)粒載體等內(nèi)容。要求學(xué)生重點(diǎn)掌握pBR322質(zhì)粒載體的構(gòu)建、pUC質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)和TA克隆載體的構(gòu)建等內(nèi)容。教 具：多媒體課件教學(xué)重點(diǎn)：pBR322質(zhì)粒載體的構(gòu)建、pUC質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)和TA克隆載體的構(gòu)建課時(shí)安排：3學(xué)時(shí)課前提問(wèn)：1. 克隆基因的一般過(guò)程？2. 重組子、轉(zhuǎn)化子、轉(zhuǎn)化。3. 構(gòu)建質(zhì)?？寺≥d體的基本策略？教學(xué)難點(diǎn)：pBR322質(zhì)粒載體的構(gòu)建教學(xué)內(nèi)容：第二節(jié) 質(zhì)粒載體（Plasmid Vector）三、常用的質(zhì)粒載體 1. pBR322質(zhì)粒載體（1）標(biāo)準(zhǔn)的質(zhì)粒載體命名法則 （

28、2）pBR322質(zhì)粒載體的物理圖譜（3）pBR322質(zhì)粒載體的構(gòu)建 （4）pBR322質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn) 2. pUC質(zhì)粒載體（1）概述（2）pUC質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)（3）pUC質(zhì)粒載體的優(yōu)點(diǎn) 3. TA克隆載體 4. 酵母中的質(zhì)粒載體 復(fù)習(xí)題 1. 在質(zhì)粒中如何增減酶切位點(diǎn)？2. 構(gòu)建質(zhì)粒載體的基本原則是什么？課堂互動(dòng)內(nèi)容“pBR”是指“細(xì)菌抗藥性質(zhì)粒”嗎？第 10 教學(xué)周/第 3.4.5 節(jié) （第 10 次課）教 學(xué) 基 本 內(nèi) 容備注教學(xué)目的：本章主要內(nèi)容為噬菌體的生物學(xué)、噬菌體克隆載體、柯斯克隆載體、人工染色體克隆載體等內(nèi)容，要求學(xué)生重點(diǎn)掌握噬菌體克隆載體的相關(guān)知識(shí)以及溫和噬菌體、溶源性細(xì)菌、

29、溶源化、整合、原噬菌體和YAC、BAC等概念。教 具：多媒體課件教學(xué)重點(diǎn)：噬菌體克隆載體課前提問(wèn)：1. pUC質(zhì)粒載體的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。2. pBR322質(zhì)粒載體的構(gòu)建過(guò)程？課時(shí)安排：3學(xué)時(shí)教學(xué)難點(diǎn)：噬菌體克隆外源DNA的策略教學(xué)內(nèi)容：第三節(jié) 其他克隆載體一、 噬菌體概述1. 噬菌體的基本特征2. 噬菌體的結(jié)構(gòu)及其核酸類(lèi)型3. 噬菌體的感染性（1）噬菌體的溶菌生命周期（2）噬菌體的溶源周期 溫和噬菌體（temperate phage） 溶源性細(xì)菌（lysogen) 溶源化（lysogenization) 整合（intergration） 原噬菌體（prophage）二、 噬菌體克隆載體1. 與構(gòu)建克

30、隆載體相關(guān)的噬菌體性質(zhì) 2. 噬菌體作為構(gòu)建克隆載體材料的依據(jù) 3. 構(gòu)建噬菌體克隆載體的基本策略4. 噬菌體克隆載體的主要類(lèi)型5. 重組體DNA的體外包裝6. 重組體分子的選擇方法7. 噬菌體克隆載體的應(yīng)用 三、柯斯 （cosmid）克隆載體四、 人工染色體克隆載體 1. 酵母人工染色體載體（yeast artificial chromosome，YAC） 2. 細(xì)菌人工染色體（bacterial artificial chromosome，BAC）課堂互動(dòng)內(nèi)容所有的噬菌體都能使寄主細(xì)胞發(fā)生裂解嗎？課堂互動(dòng)內(nèi)容1. 噬菌體可以直接作為載體來(lái)使用？為什么？2. 對(duì)照理想載體必須具備的條件，分析

31、如何對(duì)噬菌體進(jìn)行改造才能使它成為一種理想的載體？復(fù)習(xí)題1、如何將野生型的噬菌體改造成為一個(gè)理想的載體？2、為什么野生型的噬菌體不宜作為基因工程載體？3、什么是YAC? 什么是BAC？它們有哪些優(yōu)點(diǎn)？第 11 教學(xué)周/第 3.4.5 節(jié) （第 11 次課）教 學(xué) 基 本 內(nèi) 容備注教學(xué)目的：本章主要講述了外源DNA片段同載體分子的重組、受體細(xì)胞、重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法和轉(zhuǎn)化等知識(shí)。需要學(xué)生掌握感受態(tài)細(xì)胞、轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)化率等概念。教 具：多媒體課件教學(xué)重點(diǎn)：重組 DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法課時(shí)安排：3學(xué)時(shí)課前提問(wèn)：1.噬菌體克隆外源DNA的策略？2. 什么是YAC？什么是BAC？教學(xué)難點(diǎn)：轉(zhuǎn)

32、化的過(guò)程和機(jī)理教學(xué)內(nèi)容：第四章 重組體的篩選第一節(jié) 重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞一、外源DNA片段同載體分子的重組1.平末端連接 2. 粘性末端連接l 銜接體（linker)l 結(jié)合體 （adaptor)l 同聚體加尾 （homopolymer）二、受體細(xì)胞1.受體細(xì)胞(receptor cell)的概念2.受體細(xì)胞的選擇原則三、重組 DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞的方法1.轉(zhuǎn)化（transformation）2.轉(zhuǎn)染（transfection）3.顯微注射技術(shù)（microinjection）4.電轉(zhuǎn)化法（electro-tranformation）,也稱(chēng)為電穿孔法（electroporation）5.基因槍法

33、（gene gun/particle gun），又稱(chēng)微彈轟擊法（micro-projectile bombardment）6.脂質(zhì)體介導(dǎo)法（liposome mediated gene transfer）7.花粉管通道法四、轉(zhuǎn)化1.轉(zhuǎn)化的目的（1）大量產(chǎn)生重組DNA分子（2）重組DNA分子進(jìn)行純化2.受體細(xì)胞的感受態(tài)課堂互動(dòng)內(nèi)容1.在外源DNA片段與載體分子的連接產(chǎn)物中，可能存在幾種類(lèi)型的分子？2. 任何不經(jīng)特殊處理的細(xì)胞都可以吸收外源DNA分子嗎？3. 轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)染是一回事嗎？課堂互動(dòng)內(nèi)容：1. 為什么還要將已經(jīng)重組的DNA導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中去呢？2. 在轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中，可能存在幾種類(lèi)型的細(xì)胞？（1

34、）感受態(tài)細(xì)胞（competent cell)的概念（2）感受態(tài)的機(jī)制 局部原生質(zhì)體化假說(shuō)、酶受體假說(shuō)（3）轉(zhuǎn)化的過(guò)程（4）轉(zhuǎn)化反應(yīng)3.轉(zhuǎn)化率 4.轉(zhuǎn)化率的影響因素復(fù)習(xí)題 1、轉(zhuǎn)化的目的是什么？2、什么是轉(zhuǎn)化？什么是轉(zhuǎn)染？3. 什么是轉(zhuǎn)化率？影響轉(zhuǎn)化率的因素有哪些？ 第 12 教學(xué)周/第 3.4.5 節(jié) （第 12 次課）教 學(xué) 基 本 內(nèi) 容備注教學(xué)目的：本次課程主要講述了與重組子的篩選相關(guān)的內(nèi)容內(nèi)容，要求學(xué)生掌握選擇與篩選、轉(zhuǎn)化子與重組子兩對(duì)概念的區(qū)別以及若干種篩選重組子的方法。教 具：多媒體課件課前提問(wèn)：1.有幾種方法可以將重組 DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞？如何選用？2. 在轉(zhuǎn)化產(chǎn)物中，可能存在幾

35、種類(lèi)型的細(xì)胞？教學(xué)重點(diǎn)：重組體的篩選方法課時(shí)安排：3學(xué)時(shí)教學(xué)難點(diǎn)：篩選與選擇、重組子與轉(zhuǎn)化子這兩對(duì)概念的正確理解教學(xué)內(nèi)容：第四章 重組體的篩選第二節(jié) 重組體的篩選一、相關(guān)概念1. 選擇（selection）2. 篩選（screening） 3. 轉(zhuǎn)化子 4. 重組子二、重組體的篩選方法1. 遺傳表型直接篩選法（1）抗藥性篩選（2）插入失活法抗藥性基因插入失活法-半乳糖苷酶顯色反應(yīng)（-互補(bǔ)篩選發(fā)法）-互補(bǔ)藍(lán)白選擇（blue-white screening）A more sophisticated procedure for screening for the presence of recomb

36、inant plasmids, which can be carried out on a single transformation plate, is called blue-white screening. This method also involves the insertional inactivation of a gene and, as the name implies, uses the production of a blue compound as an indicator. The gene in this case is lacZ, which encodes t

37、he enzyme -galactosidase, then expression of a lacZ gene may be induced using isopropy-D-thiogalactopyranoside (IPTG), and the expressed enzyme can utilize the synthetic substrate 課堂互動(dòng)內(nèi)容1. 選擇和篩選是一回事嗎？為什么？2. 轉(zhuǎn)化子都是重組子嗎？重組子都是轉(zhuǎn)化子嗎？為什么？課堂互動(dòng)內(nèi)容：播放藍(lán)白篩選的動(dòng)畫(huà)資料，是同學(xué)們更加直觀地理解這種篩選方法。5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-gal

38、actopyranoside (X-gal) to yield a blue product. Insertional inactivation of lacZ in the production of a recombinant plasmid would prevent the development of the blue color.2. 電泳法篩選（1）質(zhì)粒抽提篩選法（2）限制性酶解法（3）PCR的方法3. 核酸分子雜交檢測(cè)法（1）原理（2）分子雜交的分類(lèi)（3）斑點(diǎn)印跡雜交和狹線(xiàn)印跡雜交（4）菌落和噬菌斑雜交4. 免疫化學(xué)檢測(cè)法5. 亞克隆法 復(fù)習(xí)題 1. 建立了一個(gè)基因文庫(kù)后，如何

39、鑒定一個(gè)帶有目的基因的克??？2. 為什么要進(jìn)行重組子的篩選與鑒定工作？第 13 教學(xué)周/第 3.4.5 節(jié) （第 13 次課）教 學(xué) 基 本 內(nèi) 容備注教學(xué)目的：本次課程主要講述基因表達(dá)的機(jī)制、外源基因表達(dá)系統(tǒng)和制約目的基因表達(dá)的因素等內(nèi)容，要求學(xué)生掌握表達(dá)載體、轉(zhuǎn)基因沉默、共抑制、融合蛋白、包涵體等相關(guān)知識(shí)。課前提問(wèn)：1.藍(lán)白篩選的英文表述？2. 選擇、篩選、轉(zhuǎn)化子、重組子等概念。教 具：多媒體課件教學(xué)重點(diǎn)：外源基因表達(dá)系統(tǒng)課時(shí)安排：3學(xué)時(shí)教學(xué)難點(diǎn)：基因表達(dá)的機(jī)制和制約目的基因表達(dá)的因素教學(xué)內(nèi)容：第五章 外源基因的表達(dá)第一節(jié) 外源基因的表達(dá)體系一、基因表達(dá)的機(jī)制1. 外源基因的起始轉(zhuǎn)錄：可調(diào)

40、控的啟動(dòng)子2. mRNA的延伸與穩(wěn)定性3. 外源基因mRNA的有效翻譯4. 表達(dá)蛋白在細(xì)胞中的穩(wěn)定5. 目的基因沉默二、外源基因表達(dá)系統(tǒng)1概念 2原核生物基因表達(dá)系統(tǒng) （1）優(yōu)點(diǎn) （2）大腸桿菌基因表達(dá)載體l 復(fù)制子l 啟動(dòng)子和終止子l 核糖體結(jié)合位點(diǎn)l 密碼子（簡(jiǎn)并密碼子的選擇）l 選擇標(biāo)記（抗生素抗性基因）3真核生物基因表達(dá)系統(tǒng)三、制約目的基因表達(dá)的因素 1外源基因是否插入在正確的閱讀框架2目的基因的有效轉(zhuǎn)錄（如啟動(dòng)子的作用）3mRNA的有效翻譯（如SD序列等作用）4轉(zhuǎn)錄后，翻譯后的適當(dāng)?shù)男揎椇图庸み^(guò)程 課堂互動(dòng)內(nèi)容回顧分子生物學(xué)講過(guò)的知識(shí)“原核生物轉(zhuǎn)錄過(guò)程”？課堂互動(dòng)內(nèi)容：回顧真核基因的

41、一般結(jié)構(gòu)和復(fù)制子、終止子、啟動(dòng)子等相關(guān)概念？復(fù)習(xí)題1. 制約目的基因表達(dá)的因素有哪些？如何解決？2. 什么是轉(zhuǎn)基因沉默？哪些因素可以導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因沉默？如何避免？3.什么是共抑制？什么是融合蛋白？第 14 教學(xué)周/第 3.4.5 節(jié) （第 14 次課）教 學(xué) 基 本 內(nèi) 容備注教學(xué)目的：本章主要講述與外源基因在原核細(xì)胞中表達(dá)的 相關(guān)知識(shí)。要求學(xué)生掌握真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)的困難和采取的措施，以及基因表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)與分離純化方法。課前提問(wèn)：1. 大腸桿菌基因表達(dá)載體含有哪些元件？2. 制約目的基因表達(dá)的因素有哪些？如何解決？教 具：多媒體課件教學(xué)重點(diǎn)：原核系統(tǒng)高效表達(dá)外源真核基因的措施課時(shí)安排：3學(xué)時(shí)教學(xué)難點(diǎn)：真核基因在原核細(xì)胞中表達(dá)的困難教學(xué)內(nèi)容：第五章 外源基因的表達(dá)第二節(jié) 外源基因在原核細(xì)胞中的表達(dá)一、基因工程的表