多聚賴氨酸的配置、保存、使用(共5頁(yè))

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上多聚賴氨酸的配置、保存、使用一、常用的多聚賴氨酸包被可以用三蒸水，或者PBS，濃度一般為用0.1 mg/ml進(jìn)行包被。 二、其他常用包被方法比較(以各種免疫分析為例)：.snap 三、我配成1mg/ml的儲(chǔ)存液，用Mini-Q(超純水)配制，放在20儲(chǔ)存，使用時(shí)稀釋10倍（也用超純水），即終濃度100ug/ml，過(guò)濾后使用。工作液過(guò)濾使用，如一次用不完，放在4儲(chǔ)存。 多聚賴氨酸在水溶液中易分解，所以一次不要配太多工作液。 四、我現(xiàn)在要配多聚賴氨酸,書(shū)上寫(xiě)的用 PBS配,但沒(méi)寫(xiě)PH,濃度，向各位請(qǐng)教。     

2、  答：PH應(yīng)該在7.07.4，PBS：取氯化鈉7.650 g，無(wú)水磷酸 氫二鈉0.724 g，磷酸二氫鉀0.210g 溶于蒸餾水1000 mL 中，以1N 氫氧化鈉 溶液調(diào)pH 值為7.07.4，經(jīng)121滅菌15 分鐘 五、我準(zhǔn)備用多聚賴氨酸涂片培養(yǎng)細(xì)胞,不知道多聚賴氨酸涂過(guò)的玻片如何滅菌？能否干烤滅菌？        答：Sigma的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)上寫(xiě)的很明白的。    

3、60;   另外，有本書(shū)上是這么寫(xiě)的，供參考： Poly-lysine-coated tissue culture surfaces         To coat coverslips: Prepare a stock solution by dissolving 25 mg/ml polylysine in 4.73

4、0;ml water (both poly-L-lysine and poly-D-lysine are used to coat tissue culture surfaces; check specific protocol for choice of isomer) and filter sterilize through a 0.22-m&

5、#160;filter. Store in 100-l aliquots at ?20°C. When ready to use, dilute one aliquot in 40 ml water to prepare 13 g/ml working solution. Sterilize coverslips by 

6、;autoclaving prior to coating. Dip coverslips in the working solution, then incubate 15 min to several hours in a humidified 37°C, 5% CO2 incubator. Allow surface to

7、 dry.        To coat culture dishes or 8-well chamber slides: Prepare a stock solution by dissolving 100 mg poly-lysine in 100 ml water (both poly-L-l

8、ysine and poly-D-lysine are used to coat tissue culture surfaces; check specific protocol for choice of isomer) and filter sterilize through a 0.22-m filter. Store in 5-m

9、l aliquots at ?20°C. When ready to use, dilute 1 part stock solution with 9 parts water to prepare 100 g/ml working solution. Fill tissue culture dishes or 

10、;slide wells with the working solution and incubate 1 hr in a humidified 37°C, 5% CO2 incubator, then remove solution by vacuum aspiration and allow surface to 

11、dry. Store coated tissue culture ware up to 3 months at 4°C. Use diluted solutions only once, but unused diluted aliquots can be stored up to 3 months at 4

12、°C.        你可以配置好PLL后單獨(dú)將其過(guò)濾除菌，分裝，待用。玻片也是事先泡洗潔精，泡酸，雙蒸水洗，烘干后高壓滅菌，待用。培養(yǎng)的前一天包被培養(yǎng)板時(shí)先把玻片放入培養(yǎng)孔然后把PLL加到玻片上，靜置15分鐘，洗出多余的PLL，然后用高壓過(guò)的雙蒸水洗板，培養(yǎng)板放入37度烘箱里過(guò)夜就可以用了。 六、多聚賴氨酸消毒該怎么辦？        答：紫外照射消毒我沒(méi)試過(guò)，但用0.22um的濾器消毒是沒(méi)問(wèn)題的（小的一次性濾器可以過(guò)濾200ml)。在液體消毒

13、時(shí)，如果所含成份經(jīng)過(guò)高溫，鈷60照射發(fā)生變性者，建議用濾器（0.22），多聚賴氨酸為氨基酸類，建議用濾器，如果要求程度高，可以兩個(gè)濾器過(guò)濾兩次。 七、資料：多聚賴氨酸溶液（Poly-L-Lysine Solution）Conc.: 0.1% w/v, in water Storage: 18-26Thimerosal, 0.01%, added as preservative 多聚賴氨酸溶液是廣泛應(yīng)用的組織切片與玻片黏合劑，該多聚陽(yáng)離子分子與組織切片上的陰離子相互作用會(huì)產(chǎn)生較

14、強(qiáng)的黏合力。        適用組織學(xué)，免疫組織化學(xué)，冰凍切片，細(xì)胞涂片，原位雜交等使用的玻片的防脫片處理，以防實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中組織掉片。也可用于細(xì)胞培養(yǎng)，增加細(xì)胞貼壁能力。 八、使用說(shuō)明 操作步驟（可直接在玻片上涂布） 1.滅菌的ddH2O 1:10稀釋該多聚賴氨酸溶液。 2.用之前將稀釋的多聚賴氨酸溶液放在室內(nèi)，使其溫度到室溫18-26 3.將玻片浸在稀釋的多聚賴氨酸溶液5分鐘。注意增加時(shí)間不會(huì)提高包被效果。 4.在60烘箱1小時(shí)干燥，或室溫18-26過(guò)夜干燥待用。 九、注意事項(xiàng) 1.每100mL已稀釋的多聚賴氨

15、酸溶液要包被的玻片40-90張， 超過(guò)90張片子將影響其黏合力。 2.用之前的玻片必須保持清潔。必要時(shí)用含1% HCl的70%乙醇溶液來(lái)清洗。 3.不要在用過(guò)的稀釋液中加新的溶液。 4.釋過(guò)的多聚賴氨酸溶液要放在2-8，至少在3個(gè)月內(nèi)是穩(wěn)定的。 5.用過(guò)的稀釋液要過(guò)濾，若出現(xiàn)渾濁或長(zhǎng)菌要丟棄。 十、將0.5%多聚賴氨酸溶液加入細(xì)胞培養(yǎng)皿中，浸泡5-10分鐘并自然晾干待用即可。 十一、多聚賴氨酸(poly-l-lysine)：常用包被培養(yǎng)皿的基質(zhì)之一.。 1. 配制硼酸緩沖液（PH8.4） A液：硼砂溶液1.907g溶于100ml三蒸水（0.05M） B液：硼酸溶液

16、1.237g溶于100ml三蒸水（0.2M） 4.5mlA液5.5mlB液硼酸緩沖液（PH8.4） 2. 多聚賴氨酸5mg溶于50ml硼酸緩沖液中，配成100g/ml的多聚賴氨酸溶液。過(guò)濾除菌，20度保存。 3. 使用時(shí)4倍稀釋，可以重復(fù)使用3次！ 十二、聽(tīng)說(shuō)一般買來(lái)的多聚賴氨酸都是用了做免疫組化時(shí)用的，一般都加了防腐劑，不利于細(xì)胞培養(yǎng)。所以我以前都是自制鼠尾膠原。請(qǐng)教midas主任，不知道這種說(shuō)法是否正確？       答:我不知道別的地方PLL的來(lái)源，不過(guò)我們這里是sigma的粉劑，而且注明是for 

17、cell culture。 如果多聚賴氨酸中有防腐劑那么肯定不適合細(xì)胞培養(yǎng)！ 十三、一些參考書(shū)上有的用三蒸水，有的用PBS配置，這與你說(shuō)的很有出入，是不是三種配法都可以？不知道那一種更合理些？       答：其實(shí)都可以，不過(guò)這是推薦的方法！（用硼酸緩沖液） 十四、主任，按照您的配方，多聚賴氨酸的使用濃度應(yīng)該是0.025mg/ml，目前我們實(shí)驗(yàn)室的使用濃度是0.1mg/ml，這個(gè)濃度來(lái)源于上海腦所我想請(qǐng)問(wèn)一下，我們用的濃度是否偏高，我培養(yǎng)的是大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞，如果用您推薦的濃度，細(xì)胞是否容易貼壁謝謝！   

18、;    答：有些文獻(xiàn)上也是用的0.1mg/ml，但是我們?cè)趯?shí)際工作中用0.025mg/ml是完全可以的。 方法是至少包被4h以上，過(guò)夜也可以（可重復(fù)用3次）！之后無(wú)菌水清洗，晾干后即可使用。       用于配養(yǎng)細(xì)胞的多聚賴氨酸分子量要求>70,000，一般常見(jiàn)的分子量有70,000150,000，150,000300,000和>300,000，分子量越大，黏附力越強(qiáng)，但相對(duì)完全溶解較困難，所以我推薦使用150,000300,000比較好。    &#

19、160;   多聚賴氨酸的工作濃度各家文獻(xiàn)報(bào)道相差很大，從0.25 mg/ml到0.01mg/ml都有，因?yàn)槎嗑圪嚢彼釋?duì)細(xì)胞有毒性，所以在保證貼附的前提下，濃度越低越好，還省錢。我現(xiàn)在用的是0.01mg/ml。 多聚賴氨酸的配制濃度在各個(gè)書(shū)上不一，我也在做原位雜交，濃度是0.01mg/ml比較好吧 十五、請(qǐng)問(wèn)多聚賴氨酸（）如何配置？保存？工作濃度？       答：多聚賴氨酸應(yīng)該是避光保存的 我們實(shí)驗(yàn)室使用的方法如下，希望對(duì)你有用： 多聚賴氨酸（Poly-L-Lycine,PLL） 試劑：多聚賴

20、氧酸 5g 蒸餾水 1000ml 配制方法：稱取PLL，溶于H2O，充分混合即可，此液濃度為0.5%，可適當(dāng)稀釋配成0.010.5%濃度。4保存，也可-20備用。PLL可反復(fù)冰凍，效果無(wú)明顯影響，工作液常再稀釋1050倍。 我的使用方法如下：        先配制成10mg/ml的濃縮液，使用前按照1：80稀釋，制成工作液，濃度25ug/ml,可用于包被培養(yǎng)皿。 十六、各位老師，有幾個(gè)關(guān)于多聚賴氨酸包被培養(yǎng)板的問(wèn)題請(qǐng)教 1、pll到底溶于硼酸緩沖液還是溶于三蒸水或雙蒸水 2、使用前是用滅菌的去離子水稀釋嗎

21、，可不可以用雙蒸水或別的        答：多聚賴氨酸溶于硼酸緩沖液或者無(wú)菌培養(yǎng)用水；        多聚賴氨酸包被培養(yǎng)板使用前是用滅菌的去離子水稀釋，最好不要用雙蒸水或別的，因?yàn)槎嗑圪嚢彼岚坏脑硎峭ㄟ^(guò)改變器皿表面的電荷而促進(jìn)細(xì)胞的黏附。 十七、請(qǐng)問(wèn)：多聚賴氨酸包被培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶時(shí)，該注意什么問(wèn)題？        答：我的方法是：濃度為50ng/1ml的多聚賴氨酸，加入培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶

22、能均勻覆蓋底部就可，放置在無(wú)菌操作臺(tái)中過(guò)夜。第二天早上用時(shí)先用雙蒸水沖洗三遍再用。 十八、我的問(wèn)題是多聚賴氨酸可以在培養(yǎng)瓶中放多長(zhǎng)時(shí)間，太長(zhǎng)了會(huì)有影響嗎？        答：我曾用過(guò)多聚賴氨酸包被培養(yǎng)瓶,但濃度是0.1mg/ml,我都是放一夜,第二天吸掉晾干就用,當(dāng)然要紫外消一下.我覺(jué)得時(shí)間長(zhǎng)點(diǎn)沒(méi)什么大礙。       我們這里的老師說(shuō)，多聚賴氨酸不能用紫外線照射。 1.用賴氨酸包被培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶時(shí)，應(yīng)該選用多聚左旋賴氨酸(分子量為15-30萬(wàn)) ； 2.

23、感覺(jué)你“濃度為50ng/1ml”有些低，我一般最后多聚賴氨酸使用濃度達(dá)到2030ug/ml； 3.包被時(shí)間一般為67h，或者過(guò)夜也可； 4.使用時(shí)應(yīng)該先用滅菌水洗三次PBS（起平衡鹽作用）洗一次，洗液的量應(yīng)該大于包被液的量； 5.“多聚賴氨酸可以在培養(yǎng)瓶中放多長(zhǎng)時(shí)間，太長(zhǎng)了會(huì)有影響嗎？”，我包被時(shí)間最長(zhǎng)的經(jīng)歷 有過(guò)48h,最后只是多聚賴氨酸隨著時(shí)間延長(zhǎng)蒸發(fā)一些而量變少了，但是對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)并無(wú)大礙，這是我曾經(jīng)有過(guò)的經(jīng)歷，所以我會(huì)負(fù)責(zé)地告訴你； 6.“多聚賴氨酸能在4度冰箱里放多久？”，最好置于20度保存，放置數(shù)月乃至半年都可以。      

24、;  我問(wèn)過(guò)博士德公司，他們分裝的多聚賴氨酸是用來(lái)作免疫組化的，沒(méi)有做過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，他們不保證能否用在細(xì)胞培養(yǎng)中，建議你買其他公司的吧，有固體的，分子量為15-30萬(wàn)，我們實(shí)驗(yàn)室用濃度0.01%的來(lái)促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞貼壁。        我們用的多聚賴氨酸濃度為100ug/ml,一般包被3-4小時(shí)即可用.我們包被完后一般放在培養(yǎng)箱里,臨用時(shí)拿出來(lái)洗三次，吹干即可如果不急著用，放在培養(yǎng)箱里較長(zhǎng)時(shí)間也沒(méi)關(guān)系，把瓶蓋擰緊即可，我最長(zhǎng)放了星期也沒(méi)有問(wèn)題。      &

25、#160; 左旋和右旋的多聚賴氨酸都可以用于包被細(xì)胞培養(yǎng)器具,主要看你的細(xì)胞貼壁能力如何,左旋的更利于細(xì)胞貼壁.我們一般使用0.01%濃度的,包被過(guò)夜,第二天用雙蒸水洗兩三次,超凈臺(tái)紫外照射,風(fēng)干。可以直接買sigma的原裝粉劑自己配。還有,配好的多聚賴氨酸在4度時(shí)間不能放置太久,大概就一兩周吧。存放于-20度中的一般為0.1%的,而且不能反復(fù)凍融,只能融化一次。最好是配好后分裝。 十九、多聚賴氨酸可用蒸餾水或PBS配制嗎？        答：可以的，我們這兒基本上都是用去離子水配制的，這幾種方法效果差不多。不知道

26、你是用來(lái)做什么的，免疫組化還是養(yǎng)細(xì)胞？ihc沒(méi)什么特別說(shuō)明，如果是包被瓶皿，那就要注意無(wú)菌操作，還有有些普通的多聚賴氨酸加有防腐劑，對(duì)細(xì)胞有影響的！ （注：sigma公司的產(chǎn)品有注明：used to coat tissue culture surfaces。購(gòu)買時(shí)要注意）        如果是浸泡材料后直接接種細(xì)胞的話（多聚賴氨酸有利于細(xì)胞帖壁），我建議你用PBS,因?yàn)镻BS平衡鹽，對(duì)細(xì)胞損傷小。如果配制后是用來(lái)加入培養(yǎng)基的（只是作為其中的一種成份），可以用三蒸水。

27、        說(shuō)明書(shū)上要求配制及存放要在塑料制品中，忌玻璃制品，用PBS稀釋。 二十、是否需要一次性濾器濾過(guò)一下,用前照一小時(shí)？        答：我覺(jué)得要是用一次性濾器濾過(guò)的東西，就不用再照了。沒(méi)必要。 二十一、用多聚賴氨酸包被可以減少細(xì)胞脫片，根據(jù)細(xì)胞類型而定，最好用之。以下是我作細(xì)胞爬片時(shí)步驟： （1）多聚賴氨酸（PLL）：        武漢博士德分裝Sigma產(chǎn)品，10ml/

28、瓶。4度存放，有效期1年。 博士德說(shuō)明書(shū)明確指出：多聚賴氨酸一般用干凈的塑料器皿，如塑料切片盒，塑料杯等稀釋，而不能用玻璃器皿 稀釋，以免影響效果；在1:10稀釋液可以保存在4度里，三個(gè)月內(nèi)仍然可以使用。        因?yàn)槎嗑圪嚢彼釋?duì)細(xì)胞有一定毒性，所以在保證貼附的前提下，盡量使用低點(diǎn)兒的濃度。 （2）無(wú)菌處理：        PLL不可以高溫消毒，故應(yīng)過(guò)濾除均，分裝于無(wú)菌處理的細(xì)胞凍存管內(nèi)，1ml/管，封口模密封，4度保存。另外，準(zhǔn)備無(wú)菌去離

29、子水50ml。 （3）配置工作液：        用移液槍吸取0.3ml PLL3ml 無(wú)菌去離子水，混勻放于10ml無(wú)菌塑料離心管中。封口模密封后4度存放。 （4）玻片處理：        常規(guī)處理的蓋玻片，紗布“夾心餅式”消毒、保存。鋪片于培養(yǎng)皿中，移液槍將PLL工作液“滴加于”玻片上，室溫10分鐘后，用消毒好的紗布條吸取玻片上的PLL液。在超靜臺(tái)內(nèi)風(fēng)干后使用，或者超靜臺(tái)內(nèi)過(guò)夜晾干，次日使用。 （5）常規(guī)細(xì)胞消化，離心后爬片。 &#

30、160;      如果既然細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，染色時(shí)不掉片，可以不用PLL。有些細(xì)胞，如神經(jīng)元就必須要PLL包，要不細(xì)胞生長(zhǎng)受影響，也會(huì)掉片。 二十二、制備多聚賴氨酸蓋玻片方法一         用超純水配成母液濃度為1mg/ml的多聚賴氨酸（Poly-L-Lysine），分裝好以后-20度保存，用的時(shí)后再凍融。 方法： 1.吸取約0.25ml滴在無(wú)菌的蓋玻片上過(guò)夜，使多聚賴氨酸粘附在蓋玻片上。 2.第二天吸去多余的多聚賴氨酸溶液，把蓋玻片依次經(jīng)去離子水、

31、Tyrode溶液和去離子水浸洗兩次。 3.空氣干噪并用紫外燈照射15分鐘后即可使用（不要求無(wú)菌的話操作可簡(jiǎn)單一些）。 二十三、制備多聚賴氨酸蓋玻片方法二        自來(lái)水浸2h，浸酸過(guò)夜，自來(lái)水沖洗干凈，95%乙醇浸12h,70度烤干，高壓處理，涂一層多聚賴氨酸（0.025mg/ml），室溫包被4h，DD水沖洗10遍，無(wú)水乙醇沖洗，超凈臺(tái)風(fēng)干。蓋玻片易碎，處理時(shí)動(dòng)作要輕，還有一次多處理一點(diǎn)，備用。 1.多聚賴氨酸不能高壓滅菌，本身就是氨基酸，高壓會(huì)破壞它的成分。 2.多聚賴氨酸可以紫外照射，包括國(guó)外的文獻(xiàn)，都說(shuō)過(guò)用之前用紫外照射。 3.做之前要先把游離的多聚賴氨酸洗去。 綜