電泳的概念帶電物質在電場中向相反電極移動的現(xiàn)象稱為

1、引引 言言n電泳的概念電泳的概念：帶電物質在電場中向相反電極移帶電物質在電場中向相反電極移動的現(xiàn)象稱為電泳（動的現(xiàn)象稱為電泳（electrophoresiselectrophoresis）。）。n電泳現(xiàn)象早在十九世紀初就已發(fā)現(xiàn)（電泳現(xiàn)象早在十九世紀初就已發(fā)現(xiàn)（18081808年俄國年俄國物理學家物理學家ReRessss進行了世界上第一次電泳實驗）。進行了世界上第一次電泳實驗）。但電泳技術的廣泛應用，則是在但電泳技術的廣泛應用，則是在19371937年用濾紙作年用濾紙作為支持介質成功地進行紙電泳以后，特別是近幾為支持介質成功地進行紙電泳以后，特別是近幾十年以來，電泳技術發(fā)展很快，各種類型的電泳十

2、年以來，電泳技術發(fā)展很快，各種類型的電泳技術相繼誕生，在生物化學、醫(yī)學、免疫學等領技術相繼誕生，在生物化學、醫(yī)學、免疫學等領域得到了廣泛應用。域得到了廣泛應用。原則上按電泳的原理來分，可分為二類：原則上按電泳的原理來分，可分為二類：n自由界面電泳：自由界面電泳：又稱移動界面電泳，是指在沒有支又稱移動界面電泳，是指在沒有支持介質的溶液中進行的電泳。其裝置復雜，價格昂持介質的溶液中進行的電泳。其裝置復雜，價格昂貴，費時費力，不便于推廣應用。貴，費時費力，不便于推廣應用。n區(qū)帶電泳：區(qū)帶電泳：是指有支持介質的電泳，待分離物質在是指有支持介質的電泳，待分離物質在支持介質上分離成若干區(qū)帶。支持介質的作用

3、主要支持介質上分離成若干區(qū)帶。支持介質的作用主要是防止電泳過程中的對流和擴散，以使被分離的成是防止電泳過程中的對流和擴散，以使被分離的成分得到最大分辨率的分離。區(qū)帶電泳由于采用的介分得到最大分辨率的分離。區(qū)帶電泳由于采用的介質不同以及技術上的差異，又可分為不同的類型。質不同以及技術上的差異，又可分為不同的類型。 電泳的分類電泳的分類引引 言言按按支持介質種類支持介質種類的不同，區(qū)帶電泳可分為：的不同，區(qū)帶電泳可分為：紙電泳紙電泳：用濾紙作為支持介質，多用于核苷酸的定性定量分：用濾紙作為支持介質，多用于核苷酸的定性定量分析。析。醋酸纖維素薄膜電泳醋酸纖維素薄膜電泳：醫(yī)學上，常用于分析血清蛋白、胎

4、盤：醫(yī)學上，常用于分析血清蛋白、胎盤球蛋白，其優(yōu)點是簡便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨球蛋白，其優(yōu)點是簡便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。率高。 v以上二種類型的電泳，由于介質的孔徑度大，沒有分子篩以上二種類型的電泳，由于介質的孔徑度大，沒有分子篩效應，主要靠被分離物的電荷多少進行分離。效應，主要靠被分離物的電荷多少進行分離。引引 言言淀粉凝膠電泳淀粉凝膠電泳：多用于同工酶分析，凝膠鋪厚些，可一層一層：多用于同工酶分析，凝膠鋪厚些，可一層一層剝層分析（一板多測）。天然淀粉經(jīng)加工處理即可使用，但孔剝層分析（一板多測）。天然淀粉經(jīng)加工處理即可使用，但孔徑度可調性差，并且由于其批號之間的質量

5、相差很大，很難得徑度可調性差，并且由于其批號之間的質量相差很大，很難得到重復的電泳結果，加之電泳時間長，操作麻煩，分辨率低，到重復的電泳結果，加之電泳時間長，操作麻煩，分辨率低，實驗室中已很少使用。實驗室中已很少使用。瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對大部分蛋白質只有很小的分子篩效應。度較大，對大部分蛋白質只有很小的分子篩效應。聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質的分離、純化及檢：可用于核酸和蛋白質的分離、純化及檢測。其分辨率較高。測。其分辨率較高。v聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實驗室最常用的支

6、持介質聚丙烯酰胺和瓊脂糖是目前實驗室最常用的支持介質引引 言言引引 言言 另外根據(jù)支持介質形狀不同，區(qū)帶電泳可分另外根據(jù)支持介質形狀不同，區(qū)帶電泳可分為：為：薄層電泳、薄層電泳、 板電泳、柱電泳板電泳、柱電泳。 據(jù)用途不同，可分為：據(jù)用途不同，可分為：分析電泳、制備電泳、分析電泳、制備電泳、定量、免疫電泳。定量、免疫電泳。第一節(jié)第一節(jié) 電泳的基本原理電泳的基本原理 電泳是在電場的作用下而產生的物質運電泳是在電場的作用下而產生的物質運動，不同的物質在一定的電場強度下，動，不同的物質在一定的電場強度下，由于所帶電荷不同，因此受到的引力不由于所帶電荷不同，因此受到的引力不同，向相反電極泳動速度不同進

7、而達到同，向相反電極泳動速度不同進而達到分離目的。分離目的。 .若將帶凈電荷若將帶凈電荷Q Q的粒子放入電場，則該粒子所受到的電荷引力為：的粒子放入電場，則該粒子所受到的電荷引力為： F F引引= =E Q E Q （1）在溶液中在溶液中, ,運動粒子與溶液之間存在阻力運動粒子與溶液之間存在阻力F F阻阻 F F阻阻=6=6r rV V 當當F F引引= =F F阻阻時時 EQ= 6EQ= 6r rV V V= V= 由上式可以看出由上式可以看出, ,粒子的移動速度粒子的移動速度( (泳動速度泳動速度V)V)與電場強度與電場強度( (E)E)和粒子所帶電荷量和粒子所帶電荷量( (Q)Q)成正比

8、成正比, ,而與粒子的半徑而與粒子的半徑( (r)r)及溶液的粘度及溶液的粘度( () )成反比。成反比。非球形分子（如線狀非球形分子（如線狀DNADNA）在電泳過程中受到更大在電泳過程中受到更大的阻力，即粒子的泳動速度與粒子形狀有關。的阻力，即粒子的泳動速度與粒子形狀有關。EQEQ6 6r r（2）（3）（4） 電泳的基本原理電泳的基本原理 在一定在一定pHpH條件下，每一種分子都具有特定條件下，每一種分子都具有特定的電荷（種類和數(shù)量）、大小和形狀，在的電荷（種類和數(shù)量）、大小和形狀，在一定時間內它們在相同電場中泳動速度不一定時間內它們在相同電場中泳動速度不同，各自集中到特定的位置上而形成緊

9、密同，各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動帶。這就是帶電粒子可以用電泳技的泳動帶。這就是帶電粒子可以用電泳技術進行分離、分析和鑒定的基本原理。術進行分離、分析和鑒定的基本原理。 +- 由由（4 4）可知，帶電粒子的泳動速度受電場強度影響，可知，帶電粒子的泳動速度受電場強度影響，使得同一種帶電粒子在不同電場里泳動速度不同，為使得同一種帶電粒子在不同電場里泳動速度不同，為了便于比較，了便于比較，常用遷移率常用遷移率 m m（或稱泳動度，指帶電粒或稱泳動度，指帶電粒子在單位電場強度下的泳動速度）子在單位電場強度下的泳動速度）代替泳動速度表示代替泳動速度表示粒子的泳動情況。粒子的泳動情況。 m =

10、V/E = Q/6m = V/E = Q/6r r （5 5） 由上式可以看出，由上式可以看出，遷移率僅與球形粒子所帶電荷數(shù)遷移率僅與球形粒子所帶電荷數(shù)量，粒子大小及溶液粘度有關而與電場強度無關。量，粒子大小及溶液粘度有關而與電場強度無關。EQEQ6 6r r（4）V= 電泳的基本原理電泳的基本原理 由于蛋白質、氨基酸等的電離度由于蛋白質、氨基酸等的電離度隨溶液隨溶液pHpH變化變化而不同，所以實際上常使用有效遷移率。有效遷移而不同，所以實際上常使用有效遷移率。有效遷移率率U U為遷移率為遷移率m m和當時條件下電離度和當時條件下電離度的乘積。的乘積。 U = m U = m （6 6） 將（

11、將（6 6）式代入（）式代入（5 5）式得：）式得： U =U = （7 7） .Q Q.6 6r r 由由（7 7）式可以看出，）式可以看出，凡能影響溶液粘度凡能影響溶液粘度的因素的因素如如溫度溫度，影響分子帶電量，影響分子帶電量Q Q及解離度及解離度的因素如的因素如pHpH的的改變，都會對有效遷移率，產生影響。改變，都會對有效遷移率，產生影響。 電泳的基本原理電泳的基本原理 以上討論的是在溶液中進行的自由界面電泳的情況，在用支以上討論的是在溶液中進行的自由界面電泳的情況，在用支持介質的區(qū)帶電泳中，除上述影響因素外，有效遷移率還受持介質的區(qū)帶電泳中，除上述影響因素外，有效遷移率還受電電滲滲（

12、是指在電場中，液體對于固體支持物的相對移動）的影響。（是指在電場中，液體對于固體支持物的相對移動）的影響。電泳時應避免用高電滲物質作支持介質。電泳時應避免用高電滲物質作支持介質。 最后要考慮選用最后要考慮選用離子強度離子強度適宜的溶液。離子強度影響粒子的適宜的溶液。離子強度影響粒子的電動電勢，溶液的離子強度越高，由于溶液中的離子會分擔大電動電勢，溶液的離子強度越高，由于溶液中的離子會分擔大部分電流，則粒子的電動電勢越小，泳動速度越慢，反之越快。部分電流，則粒子的電動電勢越小，泳動速度越慢，反之越快。 總之，電泳受總之，電泳受粒子本身大小、形狀、所帶電量粒子本身大小、形狀、所帶電量、溶液粘度、溶

13、液粘度、溫度、溫度、pHpH、電滲及離子強度電滲及離子強度多種因素的影響。多種因素的影響。 第二節(jié)第二節(jié) 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（polyacrylamide polyacrylamide gel gel electrophoelectropho- -resisresis，PAGEPAGE）是以是以聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質的一種電泳方作為支持介質的一種電泳方法。聚丙烯酰胺凝膠具有機械強度好，有彈性，透明，化學性質法。聚丙烯酰胺凝膠具有機械強度好，有彈性，透明，化學性質穩(wěn)定，對穩(wěn)定，對pHpH和溫度變化小，沒有吸附和電滲作用小

14、的特點，是一種和溫度變化小，沒有吸附和電滲作用小的特點，是一種很好的電泳支持介質。聚丙烯酰胺凝膠是由很好的電泳支持介質。聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體丙烯酰胺單體（acryacry- - lamidelamide，簡稱簡稱AcrAcr）和和交聯(lián)劑交聯(lián)劑N N，N-N-甲叉雙丙烯酰胺甲叉雙丙烯酰胺（methylane methylane bisacrylamidebisacrylamide，簡稱簡稱BisBis）在催化劑作用下合成的。在催化劑作用下合成的。 聚丙烯酰胺凝膠電泳按原理和操作形式的不同，主要有不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳按原理和操作形式的不同，主要有不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝

15、膠電泳，SDS-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠聚丙烯酰胺凝膠電泳，聚丙烯酰胺凝膠等電聚焦電泳，雙向電泳等類型。等電聚焦電泳，雙向電泳等類型。一、概述一、概述CHCH2 2=CH=CHC=OC=ONHNH2 2CH2=CHCH2=CH C=OC=O NH NH CH CH2 2 NH NH C=O C=O CH CH2 2=CH=CH- -CHCH2 2-CH-CH-CHCH2 2-CH-CH-n nCHCH2 2-CH-CH- C=O C=O C=O C=O NH NH2 2 NH NH CH CH2 2 NH NH C=O C=O-CH-CH2 2-CH-CH-CHCH2 2-C

16、H-CH-n nCHCH2 2-CH-CH- C=O C=O C=O C=O NH NH NH NH2 2丙烯酰胺丙烯酰胺N,N-N,N-甲叉雙丙烯酰甲叉雙丙烯酰胺胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺二、聚丙烯酰胺凝膠的制備二、聚丙烯酰胺凝膠的制備 聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種：聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種： 1 1. .化學聚合化學聚合 化學聚合的催化劑通常采用化學聚合的催化劑通常采用過硫酸銨過硫酸銨（ammonium ammonium persulfatepersulfate，ApAp），），此外還需要加速劑此外還需要加速劑TEMEDTEMED（N N，N N，NN，N-N-四甲基乙二胺），

17、四甲基乙二胺），它能以自由基的形式存在。微量它能以自由基的形式存在。微量TEMEDTEMED的加入，可使過硫酸銨形成的加入，可使過硫酸銨形成自由基：自由基： S S2 2O O8 82-2- 2SO 2SO4 4- - 這些自由基的產生可引發(fā)丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的聚合、交這些自由基的產生可引發(fā)丙烯酰胺與甲叉雙丙烯酰胺的聚合、交聯(lián)反應，形成有一定平均孔徑的聚丙烯酰胺。聯(lián)反應，形成有一定平均孔徑的聚丙烯酰胺。. 光聚合通常用光聚合通常用核黃素核黃素為催化劑，核黃素經(jīng)光照形成無色基，為催化劑，核黃素經(jīng)光照形成無色基，再被痕量氧氧化形成自由基，引發(fā)聚合反應。再被痕量氧氧化形成自由基，引發(fā)聚合反應。

18、TEMEDTEMED的存在，的存在，可以加速聚合?？梢约铀倬酆?。 上述聚合反應受許多因素的影響：上述聚合反應受許多因素的影響： （1 1）大氣氧能淬滅自由基，阻止多聚體鏈長的增加。在進行）大氣氧能淬滅自由基，阻止多聚體鏈長的增加。在進行化學聚合前，一般用減壓抽氣的辦法除去溶液中溶解的空氣。化學聚合前，一般用減壓抽氣的辦法除去溶液中溶解的空氣。在膠液表面，往往覆蓋一層水或溶液，隔絕空氣，可加速聚在膠液表面，往往覆蓋一層水或溶液，隔絕空氣，可加速聚合。合。 （2 2）低溫、低）低溫、低pHpH都會減慢聚合反應速度。都會減慢聚合反應速度。 （3 3）有些材料如聚丙烯酸甲酯有機玻璃，一些金屬等可抑制）

19、有些材料如聚丙烯酸甲酯有機玻璃，一些金屬等可抑制聚合反應。聚合反應。2.2.光聚合光聚合 凝膠的物理性質如機械強度、彈性、透明度和粘著度都取決凝膠的物理性質如機械強度、彈性、透明度和粘著度都取決于凝膠總濃度（于凝膠總濃度（T T）和和AcrAcr與與BisBis兩者之比。兩者之比。凝膠總濃度（凝膠總濃度（T T）和交和交聯(lián)度（聯(lián)度（C C）的計算公式分別為：的計算公式分別為：T= C= T= C= 凝膠孔徑大小，主要受凝膠濃度的影響。凝膠孔徑大小，主要受凝膠濃度的影響。凝膠濃度越大，孔凝膠濃度越大，孔徑越小徑越小。凝膠濃度過大，膠硬而脆，易折斷。濃度過小，凝膠稀。凝膠濃度過大，膠硬而脆，易折斷

20、。濃度過小，凝膠稀軟，不易操作，也易斷裂。軟，不易操作，也易斷裂。當凝膠濃度確定后，交聯(lián)度為當凝膠濃度確定后，交聯(lián)度為5%5%時，時，凝膠具有最小孔徑，凝膠具有最小孔徑，超過超過5%5%或低于或低于5%5%時凝膠孔徑都要增大。時凝膠孔徑都要增大。 三、凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關系三、凝膠濃度和交聯(lián)度與孔徑大小的關系Acr（g）+Bis（g）V（ml）X100%Acr（g）+Bis（g）Bis（g）X100% 在濃度為在濃度為7.5%7.5% 的凝膠中，大多數(shù)生物體內的蛋白質能得到的凝膠中，大多數(shù)生物體內的蛋白質能得到滿意的分離效果。因此，把濃度為滿意的分離效果。因此，把濃度為7.5%7.5

21、% 凝膠稱為標準膠。對于凝膠稱為標準膠。對于一個未知樣品，常用一個未知樣品，常用7.5%7.5%的標準膠或的標準膠或4%-10%4%-10% 的凝膠梯度來測試，的凝膠梯度來測試，而后選出適宜的凝膠濃度。而后選出適宜的凝膠濃度。 用于研究大分子核酸的凝膠多為用于研究大分子核酸的凝膠多為2.4%2.4%的大孔凝膠，此時凝的大孔凝膠，此時凝膠太軟，不易操作，可加入膠太軟，不易操作，可加入0.5%0.5%瓊脂糖，或在瓊脂糖，或在3%3%凝膠中加入凝膠中加入20%20%蔗糖以增加機械強度而又不影響凝膠孔徑大小。蔗糖以增加機械強度而又不影響凝膠孔徑大小。四、不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳四、不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠

22、電泳 系統(tǒng)的不連續(xù)性表現(xiàn)在以下幾個系統(tǒng)的不連續(xù)性表現(xiàn)在以下幾個方面：方面： 1.凝膠由上、下兩層凝膠組成，兩層凝膠由上、下兩層凝膠組成，兩層凝膠的孔徑不同，上層為大孔徑的濃凝膠的孔徑不同，上層為大孔徑的濃縮膠，下層為小孔徑的分離膠?？s膠，下層為小孔徑的分離膠。 2.緩沖液離子組成及各層凝膠的緩沖液離子組成及各層凝膠的pHpH不不同。電極緩沖液為同。電極緩沖液為pH8.3pH8.3的的TrisTris- -甘氨甘氨酸緩沖液，濃縮膠為酸緩沖液，濃縮膠為pH6.7pH6.7的的TrisTris- -HClHCl緩沖液，而分離膠為緩沖液，而分離膠為pH8.9pH8.9的的TrisTris- -HClH

23、Cl緩沖液。緩沖液。 3.在電場中形成不連續(xù)的電位梯度。在電場中形成不連續(xù)的電位梯度。 在這樣一個不連續(xù)的系統(tǒng)里，存在在這樣一個不連續(xù)的系統(tǒng)里，存在三種物理效應，即三種物理效應，即樣品的濃縮效應，樣品的濃縮效應，凝膠的分子篩效應和電荷效應凝膠的分子篩效應和電荷效應，由于，由于這三種物理效應，使樣品分離效果好，這三種物理效應，使樣品分離效果好，分辨率高。分辨率高。8.38.38.96.7水平板式電泳槽水平板式電泳槽垂直板式電泳槽垂直板式電泳槽電泳條帶電泳條帶第三節(jié)第三節(jié) 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂或瓊脂糖作支持介質的一瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂或瓊脂糖作支持介質的一種電泳方法。種電泳方法。對于分子量較大的樣品對于分子量較大的樣品，如大分子核酸、，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔徑較大的瓊脂糖凝膠進行電泳分病毒等