Annexin VFITCPI

1、實(shí)驗(yàn)日期：2015-08-0306 實(shí)驗(yàn)人員：張科 、王茂田、周婉垚、邱世稥、杜瑩瑩、郭慧杰、莫春芬實(shí)驗(yàn)名稱：通過Annexin -FITC+PI試劑盒檢測濃度為c的化合物A作用于LO2、HepG2、MCF-7、MCF-10a 48hr后的凋亡情況實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?. 檢測出濃度為c的化合物A是否促進(jìn)LO2、HepG2、MCF-7、MCF-10a的凋亡2. 計(jì)算出濃度為c的化合物A在48hr后對細(xì)胞的凋亡率實(shí)驗(yàn)原理：1.磷脂酰絲酸（P.S）正常情況下位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中，Annexin 能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexi

2、n 進(jìn)行FITC（熒光素）標(biāo)記。用以標(biāo)記的Annexin 作為熒光探針用流式細(xì)胞儀檢測凋亡的發(fā)生。2.碘化丙啶（PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期和壞死細(xì)胞，PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將Annexin 與PI配合使用，就可以將凋亡早期、中晚期及死細(xì)胞區(qū)分開。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)： 1.實(shí)驗(yàn)參數(shù)序列名稱實(shí)驗(yàn)參數(shù)備注1細(xì)胞培養(yǎng)條件24孔板，37，5%CO22細(xì)胞LO2、HepG2、Mcf-10a、Mcf-7細(xì)胞數(shù)每孔2.5E5，體系1mL/well3刺激方式小分子化合物SIS-13/25/27母液濃度40mM，作用濃度20M和40M。4鋪板后培養(yǎng)時(shí)間24hr5化合物刺激時(shí)

3、間48hr6Annexin V-FITC孵育時(shí)間15min避光PI孵育時(shí)間5min7復(fù)孔3個(gè)2.24孔板設(shè)置（化合物A,濃度c）48hr123456ACTLLO2LO2LO2陰性CTLBCTLHepG2HepG2HepG2陰性CTLCCTLMcf-10aMcf-10aMcf-10a陰性CTLDCTLMcf-7Mcf-7Mcf-7陰性CTL備注：1.陰性孔為不加Annexin -FITC+PI，其他和實(shí)驗(yàn)組一樣2.每孔細(xì)胞數(shù)為2.5E5個(gè)3.每孔化合物濃度為c4.CTL為不加化合物，其他和實(shí)驗(yàn)組一樣3. 總體流程20150803細(xì)胞鋪板24孔，每孔2.5E520150804加入化合物化合物A，濃

4、度c20150806流式檢測加入Annexin -FITC和PI實(shí)驗(yàn)材料：實(shí)驗(yàn)試劑Ø 1 x PBS試劑終濃度體積/質(zhì)量PBS一袋（粉末）RO2L配制人王茂田配制日期20150615存放位置4冷藏室31BØ Annexin -FITC+PI試劑盒公司貨號(hào)購貨日期保存成分1x binding bufferAnnexin -FITCPIØ 培養(yǎng)基試劑終濃度體積F-121×馬血清6%-7%EGF？胰島素？霍亂毒素？氫化可的松？配制人郭慧杰配制日期20150713存放位置4冷藏室31B試劑終濃度體積DMEM完全培養(yǎng)基1×90mL高壓滅菌FBS10%10

5、mL配制人郭慧杰配制日期20150714存放位置4冷藏室31B實(shí)驗(yàn)耗材1.一次性耗材序號(hào)名稱數(shù)量公司備注124孔板1Cosmo, 貨號(hào)：平底2.滅菌耗材序號(hào)名稱數(shù)量公司備注115mL塑料離心管一盒，貨號(hào)：21.5mLEP管一盒3各種tip頭各一盒4T75培養(yǎng)瓶一盒主要儀器： 序列儀器廠家規(guī)格型號(hào)1自動(dòng)平衡離心機(jī)湘儀TDZ4A-WS2生物安全柜Thermo Scientific1300A23微量加樣器100-1000 l20-200 l10-100 l0.5-10 lThermo，F(xiàn)innigan, San Jose,CA, USA4CO2 培養(yǎng)箱Thermo Scientific31105流式

6、細(xì)胞儀C6BD，San Diego, CA, USA實(shí)驗(yàn)步驟： 2015-08-03細(xì)胞鋪板：24孔板，每孔2.5E5個(gè)，1mL體系2015-08-04加入化合物：2015-08-06流式細(xì)胞儀檢測凋亡序號(hào)名稱內(nèi)容備注時(shí)間1收細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為E6個(gè)/mL，取200uL，1000rpm x5min（4）5min2潤洗（作用）1mL PBS潤洗細(xì)胞2次，1000rpm x5min（4）PBS要用冷的10min3懸浮細(xì)胞用100uL 1xBinding Buffer懸浮細(xì)胞4加入Annexin V-FITC在細(xì)胞懸液中加入2uL Annexin V-FITC（20ug/mL），輕輕混勻后放在2-8

7、避光孵育15min。15min5加入PI加入1uL PI（50ug/mL）后輕輕混勻放在2-8避光孵育2min。5min6檢測用流式細(xì)胞儀在1小時(shí)內(nèi)檢測#1流式操作序號(hào)內(nèi)容備注1上樣未經(jīng)染色的細(xì)胞，在線性FS-SS點(diǎn)圖上顯示細(xì)胞并設(shè)門圈出目標(biāo)細(xì)胞群體。2建立LogFL1-LogFL2（最好用FL3）雙參數(shù)點(diǎn)圖并分析以上光散射圖中設(shè)門的細(xì)胞；保證>98%的細(xì)胞處于在X、Y軸Log 1為邊界的左下象限中心區(qū)域。3檢測annexin V-FITC單染的細(xì)胞并檢查FL1-FL2（或FL3）散點(diǎn)圖，保證在左上和右上象限內(nèi)沒有顆粒。如果有顆粒出現(xiàn)在上端象限則說明有熒光滲漏；此時(shí)FL1的熒光被FL2

8、（或FL3）PMT檢測到了。為了糾正這種現(xiàn)象，增加FL1漏到FL2（或FL3）熒光的補(bǔ)償%（這可能在1-5%之間）。如果這個(gè)調(diào)節(jié)沒有有效地去除FL2的陽性信號(hào)，此時(shí)要降低FL2（或FL3） PMT的電壓。4檢測PI單染的細(xì)胞并檢查FL1-FL2（或FL3）散點(diǎn)圖，保證在右上和右下象限內(nèi)沒有顆粒。如果有顆粒出現(xiàn)在右側(cè)象限則說明有熒光滲漏；此時(shí)PI的熒光被FL1 PMT檢測到了。為了糾正這種現(xiàn)象，增加FL2（或FL3）漏到FL1熒光的補(bǔ)償%（這可能在15-25%之間）。如果這個(gè)調(diào)節(jié)沒有有效地去除FL1的陽性信號(hào)，此時(shí)要降低FL1 PMT的電壓。如果在以上調(diào)節(jié)補(bǔ)償過程中更改了PMT的電壓，建議重復(fù)3

9、、4步驟，確保不引起過度熒光補(bǔ)償。過度補(bǔ)償可以從陽性細(xì)胞十分貼近從標(biāo)這一現(xiàn)象觀察出來。一個(gè)恰當(dāng)?shù)难a(bǔ)償應(yīng)該是單陽性細(xì)胞熒光強(qiáng)度與落在左下Log 1為邊界象限中間陰性細(xì)胞的熒光強(qiáng)度一致。5設(shè)定FL1標(biāo)尺位置: 處于左下象限內(nèi)的大群細(xì)胞是Annexin V染色陰性的細(xì)胞（一般這些細(xì)胞會(huì)在FL1軸方向上升至2個(gè)對數(shù)坐標(biāo)值）。將垂直的FL1標(biāo)尺設(shè)定在緊靠Annexin V陰性群體右側(cè)0.1-0.2Log單位的地方。6設(shè)定FL2 （或FL3）標(biāo)尺位置: 可以通過一定數(shù)據(jù)的雙陽性細(xì)胞來區(qū)分PI+和PI-的細(xì)胞群體。在此條件下可能會(huì)識(shí)別出兩群細(xì)胞，一是位于散點(diǎn)圖的右下方（ANN+/PI-）還有就是右上方（ANN+/PI+）。水平線可以置于這兩群細(xì)胞的中間。如果在分析的細(xì)胞群體中沒有PI+細(xì)胞，區(qū)分PI+細(xì)胞最好是參照雙陰性細(xì)胞群體，將水平線設(shè)在雙陰性細(xì)胞以上0.1-0.3 Log單位的地方。在陰性群體門以外的細(xì)胞可被識(shí)為Annexin V或Annexin V和PI陽性的細(xì)胞。#2 熒光顯微鏡觀察序號(hào)內(nèi)容備注1滴一滴用Annexin V-FITC/PI雙染的細(xì)胞懸液于載玻片上，并用蓋玻片蓋上細(xì)胞。滴加懸液前要充分混勻。