MDCK細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)

1、孔板底面積9.6cm2,加培養(yǎng)液的量2.5ml,12孔板底面積4.5cm2,加培養(yǎng)液的量2ml,24孔板底面積2cm2,加培養(yǎng)液的量1ml,96孔板底面積0.32cm2,加培養(yǎng)液的量0.1ml,24孔板底面積2cm2,一般加培養(yǎng)液的量1ml,在接種病毒的時(shí)候一般病毒用量為添加培養(yǎng)液的5%-20%。在做咽拭子標(biāo)本時(shí)應(yīng)視標(biāo)本的采集質(zhì)量而定，如果標(biāo)本采集質(zhì)量高可以少加一些，如0.2ml-0.5ml,如果標(biāo)本采集的不夠好，則應(yīng)相對(duì)加大標(biāo)本接種量，可以加到1ml.附件1： EDTA處理胰酶GIBCO BRL Cat. # 15400HEPES 緩沖液1 M 母液GIBCO BRL Cat. # 1563

2、0-080D-MEM培養(yǎng)基GIBCO BRL Cat. # 11965-092青、鏈霉素母液10,000 U/ml GIBCO BRL Cat. # 15140-122/100ml牛血清白蛋白組分V7.5%溶液GIBCO BRL Cat. # 5260-037/100ml三、MDCK細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)（一）生物安全級(jí)別和生物安全規(guī)定1. MDCK細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室生物安全級(jí)別：正常MDCK細(xì)胞培養(yǎng)在生物安全二級(jí)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。2. MDCK細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室生物安全規(guī)定：遵守生物安全實(shí)驗(yàn)室相應(yīng)的生物安全規(guī)定。（二）MDCK細(xì)胞的傳代培養(yǎng)步驟1. 細(xì)胞培養(yǎng)所需的材料（部分試劑在此列出生產(chǎn)廠家貨號(hào)僅供參考，可自行選

3、擇）：（1） 生長(zhǎng)成片的MDCK細(xì)胞；（2） T-75細(xì)胞培養(yǎng)瓶,頸口有傾角；（3） D-MEM培養(yǎng)液；（4） 青、鏈霉素母液(10,000U/mL青霉素G；10,000µg/mL硫酸鏈霉素)，分裝后保存于-20；（5） HEPES緩沖液，1M母液；（6） 胎牛血清；（7） EDTA-胰酶(0.05胰酶；0.53mMEDTA·4Na)（Gibco CatNo. 25300-062），分裝后保存于-20；（8） 牛血清白蛋白組分V，7.5溶液（GIBCO CatNo. 15260）；（9） 1mL和10mL無(wú)菌移液管等；（10） 7075的酒精。建議：經(jīng)常檢查試劑使用的有效期

4、和MDCK細(xì)胞的代數(shù)。2. 培養(yǎng)基和試劑的準(zhǔn)備:（1） 500mL的D-MEM液中加入a) 青、鏈霉素母液5mL(終濃度達(dá):100U/mL青霉素和100µg/mL鏈霉素)；b) HEPES緩沖液12.5mL(終濃度:25mM)；c) 7.5牛血清白蛋白組分V12.5mL。d) 加入7.5%NaHCO310-15mL（終濃度：2-3%)（2） 細(xì)胞生長(zhǎng)液10mL胎牛血清加到90mL的上述D-MEM液，使胎牛血清的終濃度為10。每批胎牛血清均應(yīng)進(jìn)行血清測(cè)試，通過(guò)測(cè)試確定血清的最佳使用濃度。此處提到的血清使用濃度只是一個(gè)參考濃度。3. MDCK細(xì)胞的傳代培養(yǎng)程序此處以T-75細(xì)胞瓶單層培養(yǎng)

5、為例，進(jìn)行敘述。如果細(xì)胞瓶的規(guī)格有變，MDCK細(xì)胞懸液的濃度必須做相應(yīng)的調(diào)整。用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基、EDTA胰酶等，置37預(yù)熱后，用7075酒精擦拭后放于生物安全柜內(nèi)。（1） 棄去細(xì)胞已生長(zhǎng)成片的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加5mL37預(yù)熱的EDTA-胰酶；（2） 溫和地?fù)u動(dòng)細(xì)胞瓶1min，使EDTA-胰酶均勻分布在整個(gè)細(xì)胞薄層。然后用移液管吸去EDTA-胰酶；（3） 重新加入5mL37預(yù)熱的EDTA-胰酶，重復(fù)上述步驟；（4） 加1mLEDTA-胰酶使其均勻分布在整個(gè)細(xì)胞薄層，37孵育細(xì)胞瓶直至細(xì)胞從細(xì)胞瓶的塑料表面分離（約5min10min）。必要時(shí)可以搖動(dòng)或吹打來(lái)分離細(xì)胞。加入1mL胎牛血清中

6、和殘余胰酶的活性；（5） 加9mL細(xì)胞生長(zhǎng)液，輕輕移動(dòng)移液管吹散細(xì)胞團(tuán)，吹打從培養(yǎng)瓶底部一邊開(kāi)始到另一邊結(jié)束，確保所有底部均被吹打到，吹打時(shí)動(dòng)作要輕柔，盡量避免出現(xiàn)泡沫；（6） 吹打后，瓶中加入90mL細(xì)胞生長(zhǎng)液（細(xì)胞懸液的濃度約為每mL含105細(xì)胞），該培養(yǎng)液含終濃度為10的胎牛血清；（7） 每個(gè)T-25細(xì)胞培養(yǎng)瓶中加6mL(6×105/mL細(xì)胞)細(xì)胞懸液，剩余的細(xì)胞懸液可以加到另一T-75細(xì)胞瓶以用于細(xì)胞傳代的種子。通常6mL細(xì)胞懸液23日可長(zhǎng)成80%90%的單層細(xì)胞片；（8） 于375%CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)細(xì)胞，每天觀察細(xì)胞狀態(tài)。注：細(xì)胞傳代的比例可根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況和實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行

7、調(diào)節(jié)。消化液除EDTA-胰酶外，也可以用0.25胰酶與Versene按照1:7的比例配成消化液使用。（三）細(xì)胞的凍存1. 細(xì)胞凍存材料（1） 成片的MDCK細(xì)胞：8090成片，細(xì)胞生長(zhǎng)良好存活率高；（2） 二甲基亞砜（DMSO）；（3） 胎牛血清；（4） EDTA-胰酶(0.05胰酶；0.53mMEDTA·4Na)；（5） 無(wú)菌移液管：1mL和10mL。（6） 15mL無(wú)菌離心管2. 細(xì)胞凍存步驟（1） 凍存液的制備：胎牛血清9mL；二甲基亞砜1mL。（2） 細(xì)胞消化：消化過(guò)程同細(xì)胞培養(yǎng)的消化過(guò)程。（3） 細(xì)胞消化后，移入15mL離心管，1000rpm，離心5min，棄上清，輕彈離心

8、管底，重懸細(xì)胞，加入配制好的細(xì)胞凍存液，混勻后分裝到細(xì)胞凍存管內(nèi)。細(xì)胞凍存濃度為1×106/mL細(xì)胞。（4） 常規(guī)細(xì)胞凍存過(guò)程：42h，-202h，放入液氮長(zhǎng)期保存。如使用商品化凍存盒，直接放于-80過(guò)夜，第二天從凍存盒取出，放入液氮保存。（四）細(xì)胞的復(fù)蘇復(fù)蘇細(xì)胞的原則為快速解凍，以避免冰晶重新結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成傷害，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。新復(fù)蘇的細(xì)胞一般需要數(shù)日或繼續(xù)傳代12代，其細(xì)胞生長(zhǎng)或細(xì)胞特性才會(huì)恢復(fù)正常。1. 材料（1） 37恒溫水浴箱；（2） 細(xì)胞生長(zhǎng)液；（3） 胎牛血清1mL；（4） T-25培養(yǎng)瓶，無(wú)菌移液管；（5） 7075的酒精；（6） 15mL無(wú)菌離心管2. 細(xì)胞復(fù)蘇步

9、驟（1） 將細(xì)胞生長(zhǎng)液放入37水浴預(yù)熱，預(yù)熱后以7075的酒精擦拭外壁，放入生物安全柜內(nèi)；（2） 自液氮中取出細(xì)胞凍存管，檢查蓋子是否旋緊，避免熱脹冷縮過(guò)程蓋子松掉；（3） 立即放入37水浴中快速解凍，輕輕搖動(dòng)使其在1min內(nèi)全部融化，以7075的酒精擦拭保存管外部，移入生物安全柜內(nèi)；在解凍過(guò)程中，需做好個(gè)人防護(hù)，防止凍存管爆裂；（4） 取出1.0mL解凍的細(xì)胞懸液，緩慢加入到預(yù)先加有5mL細(xì)胞生長(zhǎng)液的15mL離心管內(nèi)，1000rpm，離心5min，棄去上清，用5mL細(xì)胞生長(zhǎng)液重懸細(xì)胞，移入細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，放入37 5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。（五）質(zhì)量控制MDCK細(xì)胞隨著傳代次數(shù)的增加，可能會(huì)降低其

10、對(duì)流感病毒的敏感性。因此實(shí)驗(yàn)室應(yīng)保持低代數(shù)的細(xì)胞株在液氮中。為了保持該分離系統(tǒng)的敏感性，當(dāng)細(xì)胞復(fù)蘇后被連續(xù)傳1520代，或總代數(shù)達(dá)到40代以上時(shí)，可以用已知滴度的陽(yáng)性質(zhì)控病毒來(lái)檢驗(yàn)MDCK細(xì)胞系的敏感性。如果細(xì)胞的敏感性已經(jīng)下降，即應(yīng)復(fù)蘇新的細(xì)胞株。所用細(xì)胞系應(yīng)確保無(wú)支原體污染。（六）MDCK細(xì)胞系的敏感性的檢測(cè)選擇已知TCID50的流感病毒，在同一條件下分別感染早代（小于30代）的細(xì)胞株和現(xiàn)有的細(xì)胞株，對(duì)其進(jìn)行TCID50測(cè)定。如果測(cè)試的TCID50比早代的低2個(gè)或以上Lg，表明其對(duì)病毒的敏感性已下降，不應(yīng)繼續(xù)使用；如果兩者相差不超出一個(gè)Lg，表明可繼續(xù)使用。四、流感病毒的分離病毒分離培養(yǎng)是

11、流感樣病例病原學(xué)監(jiān)測(cè)的基礎(chǔ)，是流感病毒檢測(cè)最常用和最可靠的方法之一。目前多采用雞胚和MDCK細(xì)胞進(jìn)行流感病毒分離。通過(guò)雞胚分離的流感毒株與原始標(biāo)本的抗原性和基因特性可能會(huì)有所不同，而通過(guò)MDCK細(xì)胞所分離的流感病毒與原始標(biāo)本相似。另外由于“O”相毒株的重現(xiàn)，MDCK細(xì)胞對(duì)“O”相毒株的敏感性遠(yuǎn)高于雞胚，所以MDCK細(xì)胞已成為流感病毒分離不可缺少的一種宿主系統(tǒng)。但是目前全球主要使用雞胚進(jìn)行流感疫苗生產(chǎn)，MDCK分離的病毒在很多國(guó)家尚未批準(zhǔn)用于疫苗生產(chǎn)，因此雞胚分離仍然發(fā)揮著舉足輕重的作用。具備流感病毒分離能力的流感監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)實(shí)驗(yàn)室收到哨點(diǎn)醫(yī)院的常規(guī)監(jiān)測(cè)標(biāo)本后，要求利用狀態(tài)良好的MDCK細(xì)胞和（或）

12、雞胚進(jìn)行病毒分離。若同時(shí)進(jìn)行MDCK細(xì)胞和雞胚分離，為減少工作量，可先用MDCK細(xì)胞對(duì)原始標(biāo)本進(jìn)行篩選，MDCK細(xì)胞病毒分離結(jié)果為陽(yáng)性后，再將另外一份-70或以下溫度保存的原始標(biāo)本進(jìn)行雞胚雙腔接種（羊膜腔和尿囊腔），進(jìn)行病毒分離。（一）實(shí)驗(yàn)室生物安全級(jí)別和生物安全規(guī)定1. 流感病毒分離實(shí)驗(yàn)室生物安全級(jí)別：季節(jié)性流感病毒和2009甲型H1N1流感病毒生物安全二級(jí)；高致病性禽流感病毒生物安全三級(jí)。2. 流感病毒分離實(shí)驗(yàn)室生物安全規(guī)定應(yīng)當(dāng)遵守生物安全實(shí)驗(yàn)室的有關(guān)生物安全的規(guī)定。（二）流感病毒的細(xì)胞分離標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程（所列試劑生產(chǎn)廠家及貨號(hào)僅供參考）1. 試驗(yàn)材料（1） 剛75-90成片的MDCK細(xì)胞，

13、T-25細(xì)胞瓶（2） TPCK處理胰酶（牛胰腺來(lái)源型）（SIGMA T8802）（3） HEPES緩沖液,1M母液（4） D-MEM培養(yǎng)基（高糖，含有L-谷氨酰胺），Hank's液（5） 青、鏈霉素母液(10,000U/mL青霉素G，10,000µg/mL硫酸鏈霉素)（6） 牛血清白蛋白組分，7.5%溶液（GIBCO Cat No 15260）（7） 處理好的臨床標(biāo)本0.5mL（標(biāo)本處理參見(jiàn)附件1第一部分）（8） 無(wú)菌移液管：1mL和10mL2. 培養(yǎng)基和試劑的準(zhǔn)備（建議：經(jīng)常檢查試劑的有效期）（1） 500mLD-MEM液中加入：a) 青、鏈霉素母液5mL(終濃度達(dá)：100

14、U/mL青霉素和100µg/mL鏈霉素)b) 牛血清白蛋白組分V12.5mL(終濃度:0.25)c) HEPES緩沖液12.5mL(終濃度:25mM)d) 加入7.5%NaHCO310-15mL（終濃度：2-3%)（2） 病毒生長(zhǎng)液：再向上述培養(yǎng)液中每500mL加入0.5mL的TPCK-胰酶（母液濃度為2mg/mL）使TPCK-胰酶的濃度為2µg/mL。3. 流感病毒MDCK細(xì)胞分離程序所有有關(guān)流感病毒分離的操作都應(yīng)在相應(yīng)生物安全級(jí)別的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行，必須遵守生物安全規(guī)定，嚴(yán)格執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程和廢棄物管理規(guī)定，做好個(gè)人防護(hù)要求。（1） 7590成片細(xì)胞的準(zhǔn)備a) 用40倍光學(xué)

15、顯微鏡鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MDCK細(xì)胞用于病毒的分離。b) 輕輕倒出細(xì)胞生長(zhǎng)液，用10mL的無(wú)菌移液管吸6mLp的Hank's液（或PBS緩沖液）清洗細(xì)胞3遍。（2） 接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶a) 用無(wú)菌的移液管將清洗細(xì)胞的Hank's液從細(xì)胞培養(yǎng)瓶中移出。b) 用無(wú)菌的移液管吸取500µl臨床樣品置于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，溫和搖動(dòng)數(shù)次，使之均勻鋪于細(xì)胞培養(yǎng)瓶底。c) 將步驟2）中的培養(yǎng)瓶放入35，5%CO2培養(yǎng)箱中吸附12h。d) 從培養(yǎng)箱中取出細(xì)胞培養(yǎng)瓶，用10mL的無(wú)菌移液管吸取6mLp的Hank's液（或PBS緩沖液）清洗細(xì)胞，加入5mL含終濃度2

16、µg/mLTPCK-胰酶的病毒生長(zhǎng)液于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。e) 放置于355%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。f) 每日觀察細(xì)胞病變情況（細(xì)胞病變的特征是細(xì)胞腫脹圓化，細(xì)胞間隙增大成網(wǎng)狀，細(xì)胞核固縮或破裂，嚴(yán)重時(shí)細(xì)胞部分或全部脫落）。（3） 細(xì)胞培養(yǎng)物的收獲a) 當(dāng)75100細(xì)胞出現(xiàn)病變時(shí)進(jìn)行收獲。即使無(wú)細(xì)胞病變也應(yīng)該于第7天收獲。b) 進(jìn)行紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)(HA)，用HI方法進(jìn)行流感病毒的鑒定（具體方法參見(jiàn)附件1：五、紅細(xì)胞凝集及紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)）。對(duì)于HA8的細(xì)胞分離物,進(jìn)行10-10-3稀釋后，再感染細(xì)胞繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞傳代，直至HA8時(shí)才能利用HI方法進(jìn)行病毒的鑒定。經(jīng)連續(xù)傳代2次以上，HA<

17、8者，可以用核酸檢測(cè)方法鑒定分型。（三）流感病毒雞胚分離標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程1. 試驗(yàn)材料（1） 911日齡雞胚（2） 照卵燈（3） 7075酒精（4） 一次性注射器（5） 雞蛋開(kāi)孔器（6） 蠟、膠水或膠布（7） 10mL試管和試管架（8） 10mL移液管（9） 無(wú)菌鑷子2. 流感病毒雞胚分離程序所有有關(guān)病毒分離的操作都應(yīng)遵守生物安全規(guī)定，嚴(yán)格執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程和廢棄物管理規(guī)定。進(jìn)入生物安全實(shí)驗(yàn)室要求遵循生物安全實(shí)驗(yàn)室的個(gè)人防護(hù)要求。（1）驗(yàn)卵a(bǔ)) 用照卵燈檢測(cè)雞胚，標(biāo)記出雞胚的氣室與尿囊腔的界限、胚胎的位置。如果雞胚是死胚、沒(méi)有受精、有裂痕、發(fā)育不全或表面有好多滲水孔，應(yīng)棄掉。b) 如何判斷雞胚狀態(tài)血

18、管：活胚血管清晰；死胚模糊，成淤血帶或淤血塊。胎動(dòng)：活胚有明顯的自然運(yùn)動(dòng)，但是大于14天的胎動(dòng)則不明顯；死胚無(wú)胎動(dòng)。c) 絨毛尿囊膜發(fā)育界限：血管密布的絨毛尿囊膜與雞胚胎的另一面（卵黃囊）形成明顯的界限。（2）雞胚接種(照視下雙腔接種法)a) 將雞胚的氣室朝上放置在蛋盤(pán)上，標(biāo)記每個(gè)雞胚,通常每個(gè)樣本接種3個(gè)雞胚。b) 用7075酒精消毒雞胚表面，在氣室端鉆孔，開(kāi)約6x6mm裂口。c) 注射器裝上16號(hào)針頭，吸200µL處理過(guò)的臨床標(biāo)本。d) 從裂口中滴入無(wú)菌的液體石蠟，然后輕輕晃動(dòng)雞胚，讓液體石蠟在雞胚殼膜內(nèi)層（臟層）鋪開(kāi)大約1cm2面積（石蠟層不可將殼膜內(nèi)層完全覆蓋，會(huì)導(dǎo)致死胚），

19、此時(shí)在照卵燈下即可清楚的看到雞胚胎的位置。將注射針頭緩慢刺入胚胎的鄂下胸前，用針頭輕輕撥動(dòng)下顎及腿，當(dāng)進(jìn)入羊膜腔時(shí)，能看到雞胚隨著針頭的撥動(dòng)而動(dòng)，即可注射100µl臨床標(biāo)本。將針頭退出至1/2寸長(zhǎng)度，將另外100µl臨床標(biāo)本注入雞胚尿囊腔。e) 用同一注射器和針頭將同一標(biāo)本依上法接種另外兩枚雞胚。f) 將針頭棄于合適的生物安全裝置中。g) 用消毒過(guò)的醫(yī)用膠布封口。h) 3335溫箱培養(yǎng)雞胚23天。一般A型流感病毒培養(yǎng)2天，B型流感病毒培養(yǎng)3天，臨床采樣標(biāo)本通常培養(yǎng)3天。雞胚進(jìn)行病毒分離培養(yǎng)時(shí)，每天檢查雞胚生長(zhǎng)情況，24h內(nèi)死亡的雞胚，認(rèn)為是非特異死亡應(yīng)棄去。（3）雞胚尿囊液

20、和羊水的收獲a) 雞胚在收獲前應(yīng)置4過(guò)夜或至少放置4h。b) 標(biāo)記15mL無(wú)菌塑料管與相應(yīng)的雞胚編號(hào)一致。用7075酒精消毒雞胚頂部。c) 用無(wú)菌鑷子撕破雞胚氣室蛋殼，推開(kāi)雞胚尿囊膜。用10mL吸管吸取雞胚尿囊液置于相應(yīng)的收集管中。用吸管或無(wú)菌鑷子刺破雞胚羊膜，吸取羊水放置于另外的管中。羊水較少時(shí)也可以將3個(gè)雞胚的羊水合并。d) 將雞胚收獲液3000rpm離心5min去除血液和細(xì)胞。進(jìn)行紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)。沒(méi)有紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象的標(biāo)本，應(yīng)再進(jìn)行雞胚盲傳2次（對(duì)于“O”相的毒株，需要連續(xù)傳代多次才能具備在雞胚中生長(zhǎng)的特性），盲傳后HA滴度仍為陰性的標(biāo)本，可按有關(guān)生物安全規(guī)定進(jìn)行處理。對(duì)于HA<8的

21、雞胚分離物進(jìn)行10-110-3稀釋后，繼續(xù)進(jìn)行雞胚傳代，HA8時(shí)才能利用HI方法進(jìn)行病毒的鑒定。經(jīng)連續(xù)傳代2次后HA<8者，可以用核酸檢測(cè)方法鑒定分型。（四）注意事項(xiàng)1. 不要在-20條件下保存病毒分離物，因?yàn)樵摐囟葪l件下流感病毒極不穩(wěn)定。2. 流感病毒分離操作嚴(yán)格按照生物安全規(guī)程的要求。禁止在同一實(shí)驗(yàn)室，同一時(shí)間處理和接種未知臨床標(biāo)本和已知病毒。禁止在同一實(shí)驗(yàn)室，同一時(shí)間處理接種采自不同動(dòng)物的標(biāo)本；動(dòng)物標(biāo)本（如豬、禽等）必須與人的標(biāo)本分別保存。五、紅細(xì)胞凝集及紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)流感病毒的血凝素（HA）能夠引起多種禽類(lèi)和哺乳動(dòng)物的紅細(xì)胞發(fā)生凝集，因此而得名。用于檢測(cè)流感病毒滴度的紅細(xì)胞凝

22、集試驗(yàn)也是根據(jù)病毒的這一特性而建立的。當(dāng)血清中特異性抗體與病毒血凝素結(jié)合后，則可以抑制紅細(xì)胞凝集的出現(xiàn)，即為紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)（HI）的理論根據(jù)。微量紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)是目前最常用的一種鑒定流感病毒型/亞型的方法。該方法簡(jiǎn)單、易行、結(jié)果可信。用于HI的標(biāo)準(zhǔn)參照血清必須及時(shí)更新，要包括當(dāng)年的疫苗株和/或流行代表株的抗血清。HI中所用的血清必須經(jīng)特殊處理以去除非特異性抑制素及非特異性凝集素。（一）生物安全要求生物安全要求及個(gè)人防護(hù)要求與流感病毒的分離相同，并應(yīng)遵守相應(yīng)的生物安全規(guī)定。（二）實(shí)驗(yàn)所用試劑1. 抗原：季節(jié)性A(H1N1)、A(H3N2)、B-Yamagata系、B-Victoria系、

23、新甲型H1N1流感病毒液2. 抗血清：經(jīng)RDE或者過(guò)碘酸鉀處理后的季節(jié)性A(H1N1)、A(H3N2)、B-Yamagata系、B-Victoria系、新甲型H1N1流感病毒抗血清。（三）其他試劑/材料/儀器（試劑盒中不包含）1. 紅細(xì)胞懸液2. PBS緩沖液，PH7.43. 水浴箱（37，56）4. 臺(tái)式離心機(jī)5. 多道可調(diào)加樣器6. 離心管7. 96孔微量血凝板（使用豚鼠和人紅細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)須用“U”底板，使用雞/火雞紅細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)最好用“V”底板，“U”底板也可使用）、可調(diào)多通道加樣器、單道加樣器等。8. 200ul、1000ulTIP頭、水槽流感病毒紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)各項(xiàng)條件比較紅細(xì)胞雞火雞

24、豚鼠人“O”型血終濃度0.50.50.750.75孔底部形狀V型V型U型U型孵育時(shí)間30min30min45min60min紅細(xì)胞沉積形狀細(xì)胞沉積成點(diǎn)狀，傾斜時(shí)細(xì)胞向下流成淚滴狀細(xì)胞沉積成點(diǎn)狀，傾斜時(shí)細(xì)胞向下流成淚滴狀細(xì)胞沉積成環(huán)狀細(xì)胞沉積成環(huán)狀（四）流感病毒鑒定步驟1. 紅細(xì)胞配置如用火雞、雞的紅細(xì)胞，工作液濃度為1%，如用人“O”型、豚鼠紅細(xì)胞，工作濃度為1.5%。下面介紹WHO流感參比與合作中心提供的紅細(xì)胞標(biāo)定的方法：（1） S液中的紅細(xì)胞，1200r/min離心5min，棄上清。（2） 加入等量的PBS液體洗滌，充分混勻，1200r/min離心5min，棄上清。（3） PBS液體洗滌三

25、次。最后一次洗滌后，1200r/min離心10min。（4） 將紅細(xì)胞稀釋至合適的濃度。注：A.S液全稱(chēng)為Alsever氏液。配制方法為葡萄糖2.05g、檸檬酸鈉0.8g、檸檬酸0.055g、氯化鈉0.42g、去離子水加至100mL，微熱溶解，將pH值調(diào)到6.1，8磅20min高壓滅菌，4貯存?zhèn)溆谩?. 流感毒株HA滴度的測(cè)定（1） 在微量血凝板的第212列加入50ul PBS（PH7.4）。（2） 在第一列（A1G1）中加入100ul病毒懸液。（3） H1加入100ul PBS，作為紅細(xì)胞陰性對(duì)照。（4） 從第一列各孔吸50ul病毒液，由第1列至第12列做2倍系列稀釋?zhuān)詈笠涣忻靠讞壢?0u

26、l。（5） 在每孔中加入50ul紅細(xì)胞懸液，輕拍血凝板，充分混勻。（6） 室溫孵育，孵育時(shí)間見(jiàn)表：流感病毒紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)各項(xiàng)條件比較。3. HA試驗(yàn)結(jié)果判斷引起全部紅細(xì)胞凝集為完全凝集，以“+”記錄；只有部分紅細(xì)胞凝集記錄為“+/-”；無(wú)凝集記錄“-”。血凝滴度的判定以出現(xiàn)完全凝集的最高稀釋度為終點(diǎn)，其稀釋度的倒數(shù)即為病毒的血凝滴度。HA滴度判定舉例病毒稀釋度HA滴度1:11:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048123456789101112A+-2B+-8C+-16D+-32E+-64F+-128G+2048H-14. 制備用于紅細(xì)胞凝

27、集抑制試驗(yàn)的4個(gè)血凝單位的抗原（1） 一個(gè)凝集單位指能引起等量的標(biāo)準(zhǔn)化的紅細(xì)胞凝集的病毒量。進(jìn)行紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)時(shí)一般用4個(gè)血凝單位的病毒量。（2） 制備4個(gè)單位血凝抗原時(shí)，首先計(jì)算出紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)所需的病毒抗原的總量。如每種血清做8孔稀釋?zhuān)靠子每乖?5ul，則測(cè)定一份血清需0.2mL抗原。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)血清的份數(shù)（本試劑盒包含5種標(biāo)準(zhǔn)血清）計(jì)算出實(shí)驗(yàn)所需病毒抗原總量。（3） 其次，計(jì)算出病毒稀釋度。用病毒的HA滴度除以8，得到的商即為配置4個(gè)血凝單位所需的稀釋度。如，某病毒的HA滴度為64，除以8等于8，則1:8（1mL病毒液加7mLPBS）稀釋該病毒即可得到4個(gè)血凝單位的抗原。注：紅細(xì)胞

28、凝集抑制試驗(yàn)中所用的4個(gè)血凝單位是指每25ul病毒液中含有4個(gè)血凝單位（等于50ul病毒液中含有8個(gè)血凝單位）。所需抗原總量為1600ul時(shí)，4個(gè)血凝單位配置對(duì)照表HA滴度病毒液(ul)PBS(ul)168008003240012006420014001281001500256501550512251575102412.51587.520486.251593.755. 4個(gè)血凝單位抗原的復(fù)核滴定為了保證紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)中抗原用量一致并且準(zhǔn)確無(wú)誤，新配置的4個(gè)血凝單位抗原需復(fù)核滴定。操作方法同HA實(shí)驗(yàn)步驟。如果只有前4孔出現(xiàn)凝集，表明每50ul病毒含有8個(gè)血凝單位，該病毒稀釋準(zhǔn)確，可以用于紅細(xì)

29、胞凝集抑制試驗(yàn)。如第5孔也出現(xiàn)凝集，說(shuō)明每50ul病毒含有16個(gè)血凝單位，該抗原必須等量稀釋。如只有前3孔凝集，表明每50ul病毒僅含4個(gè)血凝單位，病毒量需加倍。此外，4個(gè)血凝單位抗原必須每次用前新配置。6. 紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)（HI）鑒定未知病毒（1） 在血凝板的每孔加入25ul PBS。然后在A1A5、A7A11各列分別加入：抗季節(jié)性A(H1N1)流感病毒標(biāo)準(zhǔn)參考血清、抗季節(jié)性A(H3N2)流感病毒標(biāo)準(zhǔn)參考血清、抗B-Yamagata系流感病毒標(biāo)準(zhǔn)參考血清、抗B-Victoria系流感病毒標(biāo)準(zhǔn)參考血清、抗新甲型H1N1流感病毒標(biāo)準(zhǔn)參考血清25ul，A6、A12加入25ul PBS，作為陰性

30、對(duì)照。用多道移液器從A行每個(gè)孔分別取25ul，由A至H行做2倍稀釋血清，最后一行棄去25ul。（2） A1至A5各列每孔加入25ul待檢抗原（4個(gè)血凝單位）陽(yáng)性對(duì)照：A7至A11各列分別加入4個(gè)血凝單位的季節(jié)性A(H1N1)流感病毒標(biāo)準(zhǔn)參考抗原、季節(jié)性A(H3N2)流感病毒標(biāo)準(zhǔn)參考抗原、B-Yamagata系流感病毒標(biāo)準(zhǔn)參考抗原、B-Victoria系流感病毒標(biāo)準(zhǔn)參考抗原、新甲型H1N1流感病毒標(biāo)準(zhǔn)參考抗原各25ul/孔。對(duì)照孔A6、A12各列加入25ul PBS/孔。輕拍，混勻，室溫孵育30min。（3） 每孔加入50ul配置好的紅細(xì)胞懸液，輕拍混勻，室溫孵育30-60min，觀察血凝抑制實(shí)

31、驗(yàn)結(jié)果。（具體孵育時(shí)間根據(jù)使用的不同種血球來(lái)定，詳見(jiàn)表1。）（4） 血凝抑制效價(jià)是完全抑制血凝出現(xiàn)時(shí)血清的最高稀釋度的倒數(shù)。7. 鑒定結(jié)果判定（1） 標(biāo)準(zhǔn)參照血清對(duì)待檢抗原的抑制效價(jià)20才可以算為陽(yáng)性。（2） 一種待檢抗原不能同時(shí)被兩種或兩種以上的標(biāo)準(zhǔn)血清抑制。（3） 待檢抗原標(biāo)準(zhǔn)參照血清有交叉抑制，但與一種亞型（B型流感稱(chēng)為系）的標(biāo)準(zhǔn)參照血清抑制效價(jià)大于其他亞型參照血清4倍以上時(shí)，便可以判定為此種亞型的流感病毒。（五）注意事項(xiàng)1. 血紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)必須用4個(gè)血凝單位/25ul的抗原，抗原必須新鮮配制。2. 紅細(xì)胞懸液的配制必須標(biāo)準(zhǔn)化。3. 正確存放試劑，避免反復(fù)凍融及污染。4. 凍干的試劑應(yīng)按照說(shuō)明溶解，保存。5. 任何待檢病毒與一種以上的推薦抗血清反應(yīng)，滴度明顯大于20，可能的原因?yàn)椋海?） 使用了不足4個(gè)血凝單位的抗原。（2） 細(xì)菌污染。非流感病毒來(lái)源的凝集素可以非特異的與所有的抗